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相似文献
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1.
为了建立一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的方法,试验以构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了IBV SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR检测方法对其进行研究。结果表明:该检测方法的标准曲线线性关系良好,相关系数(R2)为0.998 8,可检测到7.5×103copies/μL的病毒核酸,与其他禽源病毒不发生交叉反应,重复性试验变异系数小于3%。说明该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可用于IBV的定量检测。  相似文献   

2.
为了建立一种快速的新城疫病毒(NDV)病原检测方法,试验针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法建立了检测IBV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和反应条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果表明:该检测方法特异性强,与其他禽源病毒如NDV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.1×101拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。说明研究建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于IBV的定量检测。  相似文献   

3.
为了建立鸡传染性支气管炎病毒快速、敏感的检测方法,本研究利用RT-PCR技术扩增出鸡传染性支气管炎病毒M基因中134bp的保守序列,并克隆到pMD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了IBV的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达3.5×10~1拷贝,与禽呼肠孤病毒、新城疫病毒、H9N2亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床IBV的检测。  相似文献   

4.
本试验针对肾型鸡传染性支气管炎病毒(IBV-QX)保守基因N基因设计并合成引物,构建了阳性质粒标准品;经过不断优化建立了检测IBV-QX SYBR GreenⅠReal-Time PCR标准曲线。结果显示,本次所建立的检测方法重复性好,特异性高,最低可检测到39.7copies/μl的病毒核酸,对常见禽源病毒无交叉反应。本次建立的方法不仅可以用于各基因型IBV病原检测,也可用于病毒的定量研究。因此,本实验室所建立的IBV检测方法在鸡传染性支气管炎病毒的快速检测上具有重要意义。  相似文献   

5.
本研究针对传染性支气管炎病毒(IBV)tl/CH/LDT3/03毒株的N基因(GenBank登录号为AY702975)设计并合成了一对引物,构建重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IBV核酸的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法可检测到初始模板中6.45×10copies/μL的病毒核酸。与常规PCR相比,敏感性高100倍。该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克氏病毒(MDV)均不发生交叉反应;重复性试验的变异系数小于2.6%。结果表明,本试验建立的荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于传染性支气管炎的临床诊断。同时应用本方法对人工感染IBV的SPF鸡的主要脏器盲肠扁桃体、肾脏、肺和气管进行了病毒RNA定量检测,结果表明,肾脏的病毒含量最高,盲肠扁桃体中病毒持续的时间最长,从而揭示了IBV在SPF鸡体内复制的动态变化,证实了感染鸡的临床表现与病毒滴度的时间相关性。  相似文献   

6.
《中国兽医学报》2016,(10):1701-1705
为了快速检测临床样品中新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的混合感染,根据NDV的F基因和IBV的N基因保守序列分别设计了2对特异性引物,优化双重RT-PCR反应条件,建立了可同时检测NDV和IBV的快速双重反转录PCR(RT-PCR)诊断方法。敏感性试验表明,此方法对NDV和IBV的RNA最小检出量分别为0.014 3和0.013 6ng;NDV的扩增片段大小为459bp,IBV的扩增片段为282bp。对其他病毒如IBDV、AIV和EDSV的检测结果均为阴性,表明此方法具有较好的特异性。对58份临床疑似样品进行检测,NDV和IBV的阳性率分别为44.82%和31.03%,NDV和IBV混合感染率为20.68%,表明本研究建立的NDV与IBV双重RT-PCR检测方法,可用于临床发病病料中NDV和IBV混合感染的快速鉴别诊断。  相似文献   

7.
本研究建立了一种快速的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52株定量检测方法,为进一步研究疫苗的效价检测和质量监控新方法奠定基础。针对IBV核蛋白(N)基因,设计特异的H52株荧光定量PCR检测引物和TaqMan-MGB探针,优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验,探讨荧光定量RT-PCR与EID50方法测定病毒含量的相关性,并通过体外转录技术对病毒基因拷贝数进行定量分析。该方法特异性强,与其他禽源病毒均无交叉反应;该方法可检测到5.60×101拷贝/μL的病毒核酸,与常规PCR相比,敏感性高10倍;重复性试验的变异系数为0.9%~3.2%;与EID50检测结果的相关系数r=0.934,两种方法在检测H52株病毒效价上具有很好的相关性。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法,适合于对鸡传染性支气管炎病毒H52株病毒含量的快速定量检测。  相似文献   

8.
为了建立禽呼肠孤病毒(ARV)快速、敏感的检测方法。本研究利用RT-PCR技术扩增出ARV S1基因中298bp的保守序列,并克隆到p MD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了ARV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达4.8×101拷贝,与NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV、REV均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床ARV的检测。  相似文献   

9.
为揭示鸡传染性支气管炎病毒(IBV)在鸡胚肾细胞(CEK)中复制增殖的动态变化规律,通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测IBV病毒感染CEK3、6、12、24、36、48、72h后病毒增殖量的动态变化。结果显示,随着时间增加,IBV病毒增殖出现规律性变化,3~12h时IBV增殖不明显,36h时IBV开始大量复制,48h时达到高峰,但72h后有所下降。试验表明IBV在细胞内复制增殖的最佳时间在接毒后48h,其复制增殖情况与细胞状态负相关。  相似文献   

10.
为揭示鸡传染性支气管炎病毒(IBV)在鸡胚肾细胞(CEK)中复制增殖的动态变化规律,通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测IBV病毒感染CEK3、6、12、24、36、48、72h后病毒增殖量的动态变化。结果显示,随着时间增加,IBV病毒增殖出现规律性变化,3~12h时IBV增殖不明显,36h时IBV开始大量复制,48h时达到高峰,但72h后有所下降。试验表明IBV在细胞内复制增殖的最佳时间在接毒后48h,其复制增殖情况与细胞状态负相关。  相似文献   

11.
为建立一种快速检测禽传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus,IBV)病原的方法,根据GenBank上的禽传染性支气管炎病毒基因组序列,设计1对引物,建立了检测IBV的一步法RT-PCR方法,该方法对20份疑似传染性支气管炎(Infectiousbronchitis,IB)病料、传染性法氏囊病毒(Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)、新城疫病毒(Newcastaldiseasevirus,NDV)进行检测,结果仅IBV为阳性,IBDV、NDV均为阴性。该一步法RT-PCR方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,最低可检测出约4pg的IBVRNA,将为IBV的病原检测及分子流行病学调查等提供早期快速的诊断方法。  相似文献   

12.
为建立B型流感病毒(IBV)快速诊断方法,本研究采用真核表达系统表达并纯化了IBV中高度保守的核糖核蛋白(NP),以其为抗原,免疫小鼠制备IBV NP蛋白单克隆抗体(MAb),选取抗原表位长、特异性强的MAb2B3-5作为捕获抗体,选取抗原表位短、灵敏度高的MAb 3C3-7经HRP标记后作为检测抗体,经条件优化,建立了检测IBV NP蛋白的双MAb夹心ELISA检测方法。结果显示,该检测方法捕获抗体包被量为每孔100 ng,检测抗体使用量为每孔20 ng,NP蛋白浓度在3.9 ng/mL~62.5 ng/mL时与OD_(450nm)呈良好的线性关系,相关系数R20.99。利用该ELISA方法对多种病毒进行检测,结果显示该方法仅能与IBV发生反应,表明该方法特异性强;灵敏度试验结果显示,该方法对病毒NP蛋白的最低检测限为13.26 ng/mL,敏感性高;批内和批间重复性变异系数均小于8%,重复性好;捕获抗体可在25℃和37℃保存4 d,热稳定性好。利用本实验建立的ELISA方法和qPCR方法对本实验室保存的40份人咽拭子进行检测,该方法与qPCR方法相比符合率为70%,表明本研究建立的方法可用于临床检测。本研究建立的ELISA检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为B型流感的快速诊断、NP蛋白功能研究及定量检测提供技术支持。  相似文献   

13.
利用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)多克隆抗体构建的免疫磁珠富集IBV,对Gen Bank中896株IBV S1基因序列及其多变区进行分析,根据IBV强毒株和弱毒疫苗株序列差异设计引物,建立了一种基于免疫磁珠富集IBV后检测S1基因多变区的多重RT-PCR方法。结果表明:该方法能扩增出强毒株约710 bp的通用片段和约350 bp的特异片段,弱毒疫苗株能扩增出约710 bp的通用片段和约210 bp的特异片段,能鉴别出强毒株和弱毒疫苗株。免疫磁珠富集IBV后比不富集病毒用RT-PCR方法检测敏感性提高100倍。该方法为IBV检测提供了新的技术支持。  相似文献   

14.
根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的3′端非编码区保守区域,设计并合成一对特异性引物,建立IBV纳米PCR检测方法,并进行了特异性、灵敏性和重复性试验,然后将建立的方法进行初步应用。结果显示:该方法特异性良好,能从4种不同基因型IBV核酸样品中检测到约346bp的目的条带,而对禽偏肺病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、马立克氏病病毒、禽白血病病毒、鸭肝炎病毒等其他病原检测结果均为阴性;敏感性试验表明,纳米PCR的最低检测浓度为1.01×10^-4ng/μL,其敏感性是普通PCR的10倍;重复性试验显示3次均能检出IBV核酸。纳米PCR方法的临床应用表明,送检样品及攻毒鸡样品的检出率分别达到50%(10/20)和60%(30/50),与普通PCR方法检测结果符合率为100%。研究建立的IBV纳米PCR检测方法具有较高的敏感性和良好的特异性,为IBV的临床诊断、病原检测和流行病学调查提供了新的技术手段。  相似文献   

15.
除传染性支气管炎病毒(IBV) Beaudette株外,其它IBV均难以在体外细胞系中传代培养。为研究限制IBV体外传代培养的影响因素,本研究应用流式细胞术检测IBV经典株M41囊膜与宿主细胞膜融合程度,结果显示M41可以在体外培养条件下侵入鸡细胞系LMH和DF-1,但荧光定量PCR检测显示侵入的M41无法增殖。进一步通过对比分析M41易感组织气管、非易感组织脾脏及LMH细胞全基因组转录谱数据,结果显示宿主细胞粘附、细胞周期、p53及SRC可能是M41在体外培养细胞中增殖的宿主决定因素。本研究通过在2D培养体系中预先孵育Gelatin和3D培养两种方式来调节细胞粘附的物理环境,结果显示两种方法均可以促进M41在体外培养细胞中的增殖;利用多种经典的细胞周期抑制剂及p53和SRC活性调控分子预先处理LMH和DF1,显示细胞周期、p53活性及SRC活性对IBV体外增殖无显著影响。表明细胞粘附特性是影响IBV体外增殖的重要因素。本研究为IBV体外细胞培养体系的建立奠定了实验基础。  相似文献   

16.
为建立快速检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的血清学方法,本试验以IBV为检测抗原,建立了一种检测IBV抗体的间接ELISA方法,并对各种检测条件进行了优化.研究结果显示,抗原的最佳包被浓度为19.2 μg/mL,最佳包被条件为37 ℃ 1 h后4 ℃过夜;血清的最佳稀释度为1:800,37 ℃孵育60 min;酶标二抗稀释度为1:7 000,37 ℃孵育60 min;底物显色为37 ℃避光作用10 min.经特异性、重复性、敏感性试验证明,该方法与鸡常见病原的阳性血清均无交叉反应,重复性较好及血清稀释至1:12 800时仍可检测到IBV抗体.结果表明,本试验所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、重复性和敏感性.  相似文献   

17.
根据GenBank已发表的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV) ZZ2004 3a、3b及E基因序列,设计1对引物,扩增540 bp特异性核酸片段,建立了检测IBV ZZ2004的RT-PCR方法.特异性试验结果表明,IBV ZZ2004能扩增出540 bp的核酸片段,而IBV M41、H120、H52毒株以及新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性腔上囊病病毒(IBDV)均无特异性条带出现.敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1.525 pg的模板.上述结果表明,本试验所建立的RT-PCR方法敏感性高、特异性强.利用建立的RT-PCR方法对从河南省分离的6株疑似鸡IBVZZ2004进行检测,结果5株为阳性.该方法的建立为IBV ZZ2004的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法.  相似文献   

18.
利用A型魏氏梭菌滤液处理100倍浓缩的IBV-M41株病毒液,成功研制出IBV血凝抗原,HA效价为1∶256~1∶1024,且仅与IBV阳性血清发生反应,而不与其它标准阳性血清反应。建立了IBV的血凝抑制(HI)反应条件,以梅里亚公司和荷兰GD公司生产的IBV商品血凝抗原作为对照,对免疫鸡和SPF鸡血清进行了抗体测定,检测结果无明显差异,且HI检测结果与IDEXX诊断试剂盒的结果符合率为94.2%。研究表明:本实验所建立的方法敏感性高、特异性强,适合于SPF鸡监测和IB疫苗免疫效果检测。  相似文献   

19.
鸡传染性支气管炎病毒的快速检测   总被引:4,自引:0,他引:4  
本试验建立了一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒的通用性PCR方法。通过对纯化后IBV核蛋白基因进行的直接PCR及套式PCR扩增表明,两次PCR产物的大小为0.7kb和0.5kb,与实际设计相符。而对照的NDV主IBDV的PCR扩增产物均为阴性。用IBV HB(华北)株感染SPF鸡后,应用我们所建立的PCR方法去检测不同时期所采集的肾脏、气管、盲肠扁桃体、肺脏和肝脏中的IBV,在SPF鸡感染IBV后的21天仍然能够检测到IBV的基因组,Southern blot杂交试验证明了我们获得的PCR产物为IBV的核蛋白基因。对30份自然感染病料的检测表明,本实验所建立的PCR方法检测阳性数为15份,阳性率为50%(15/30);鸡胚接种检测的阳性数为17份,阳性率为56.7%(17/30);IFA检测的阳性数11 ,阳性率为36.7%(11/30)。PVR检测法与鸡胚接种方法的阳性符合率为93.3%(14/15),统计学分析表明,P>0.05,差异不显著,而PCR检测法与IFA的阳性符合率为60%(9/15)。结果证明本实验所建立的PCR检测方法具有敏感、特异、快速等特点,适用于不同来源及不同血清型IBV的检测。  相似文献   

20.
为获得鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus, IBV)N蛋白的单克隆抗体,通过原核表达IBV N蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。经ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆获得3株杂交瘤细胞株,命名为1#、18#、19#,并进行了抗体亚类的鉴定、Western-blot和IFA检测。结果显示:制备的3株单克隆抗体亚型均为IgG1,Western-blot和IFA试验结果表明单克隆抗体均能与IBV发生特异性反应而与其他禽病常见病毒均无交叉反应。本研究成功制备了IBV单克隆抗体,为进一步建立IBV检测方法和深入研究IBV的生物学特性奠定了基础。  相似文献   

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