高温胁迫下绿豆象内参基因筛选及其Hsp70基因的表达特性

为明确Hsp70蛋白在绿豆象Callosobruchus chinensis高温耐受性中的作用,该研究筛选并克隆β-actin、α-tubulin、β-tubulin、EF1-α、GAPDH、Hsc70、AK和RPL40八个候选内参基因,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术测定其在绿豆象雌雄成虫体内的表达量,通过geNorm、BestKeeperr和NormFinde软件对这8个候选内参基因的表达稳定性进行评价,选择最适宜的内参基因对不同高温胁迫下绿豆象体内Hsp70基因的表达特性进行测定。结果表明,8个候选基因引物均有良好的特异性和引物扩增效率,引物扩增效率介于91.6%～108.1%之间。高温胁迫下,β-tubulin基因较其他7个候选基因有较小的平均变异度、稳定值和标准差,为最适宜的内参基因。39、42和45℃高温处理1 h后绿豆象雌雄成虫体内Hsp70表达水平较对照显著上调,当处理时间延长至3 h后,Hsp70基因的相对表达量较对照也有不同程度上调,但差异不显著,表明绿豆象Hsp70基因可以响应高温胁迫,Hsp70蛋白在绿...     

马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-hsp90的克隆及温度胁迫下的表达

马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是一种抗逆性极强的世界性检疫害虫,对温度胁迫具有很强的适应性,为进一步明确其对温度胁迫适应性的分子生态机制,采用RT-PCR及RACE技术克隆得到了1个hsp90基因的cDNA全长序列,命名为Ld-hsp90,并利用实时荧光定量PCR技术检测其在温度胁迫后相对表达量的变化。Ld-hsp90全长为2 489 bp,开放阅读框(ORF)长度为2 160 bp,编码719个氨基酸,理论等电点为4.98,分子量约为82.09 kD,5'端与3'端非编码区长度分别为113 bp和216 bp。氨基酸序列中含有HSP90家族的5个签名序列及胞质特征序列MEEVD。实时荧光定量PCR检测结果显示:38℃和44℃高温热激1 h,马铃薯甲虫成虫体内的Ld-hsp90的表达量均显著高于对照组,而0℃与-10℃低温处理1 h后的表达量与对照组均无显著差异。研究表明Ld-hsp90的上调表达在马铃薯甲虫抗高温中起着重要的作用。     

小麦条锈菌hsp70基因的克隆及热胁迫下的表达特征分析

为明确热激蛋白70在小麦条锈菌对高温适应性中的作用,采用RACE和PCR技术扩增得到小麦条锈菌hsp70的基因全长,并利用实时荧光定量PCR技术对热胁迫下不同温度敏感类型小麦条锈菌中hsp70的表达特征进行分析。克隆得到的小麦条锈菌hsp70基因组序列全长为2 817bp,包含7个内含子,cDNA序列全长为2 267bp,其中开放阅读框为1 917bp,编码639个氨基酸,分子量为66.7ku,等电点为5.15。编码蛋白含3个保守的HSP70氨基酸序列。qRT-PCR试验结果表明,28℃热激后,hsp70的转录水平随热激时间的延长而略有增加,2h达到最高值。不同温度敏感类型菌株在热激2h后hsp70的相对表达量具有显著差异。低敏感类型菌株hsp70平均表达量为未经处理对照的7.12倍,而高敏感类型菌株hsp70平均表达量仅为对照的1.63倍。     

温度诱导对星豹蛛热激蛋白hsp70和hsp90基因表达的影响

为探讨温度诱导对星豹蛛的应激反应,运用实时定量PCR法测定了不同温度对星豹蛛热激蛋白hsp70和hsp90基因表达量的影响。结果表明:经过17、20、23、26℃诱导后,星豹蛛hsp70和hsp90基因表达量与对照组差异不显著,当高于26℃时,随着温度的升高表达量呈先升高后降低的趋势,且在38℃时最高,分别为对照组的716.46和10.44倍,差异显著;低于17℃时,表达量随着温度的降低呈逐渐升高的趋势,其中-1℃时最高,分别为对照组的334.53和9.38倍,差异显著;-1~41℃范围内,在相同诱导温度处理下,星豹蛛hsp70基因表达量显著高于hsp90基因。表明当星豹蛛受到温度高于26℃或低于17℃的刺激后,体内hsp70和hsp90基因表达量均增加,且hsp70基因表达量高于hsp90基因。说明热激蛋白只有在极端高温和低温的条件下才充分表达,从而对机体产生保护作用,且这种保护只在一定温度范围内起作用。     

三叶斑潜蝇热激蛋白Hsp90基因的克隆及其在高温胁迫下的表达分析

采用RT-PCR及RACE技术克隆了三叶斑潜蝇Hsp90基因全长cDNA序列,并用实时定量RT-PCR的方法检测其在不同发育阶段受到高温胁迫后的表达水平。该基因的cDNA序列全长2 408 bp,开放阅读框为2 145 bp,编码714个氨基酸;5′非编码区为151 bp,3′非编码区为112 bp。该基因推导的氨基酸序列与其他昆虫同源序列比较有很高的相似性（80%~99%）。聚类分析结果显示三叶斑潜蝇与美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR检测结果表明三叶斑潜蝇Hsp90基因的表达受到热胁迫的诱导,诱导3龄幼虫最大表达量的温度比诱导其他发育阶段的温度低,在43 ℃时预蛹和蛹的表达量在整个生命周期中最高,在检测的高温胁迫条件下,雄虫比雌虫的表达量更高。该结果为阐明三叶斑潜蝇胁迫耐受能力及其对其他潜蝇种群的取代机制奠定了分子基础。     

温度胁迫对荒漠昆虫小胸鳖甲(鞘翅目:拟步甲科)幼虫热激蛋白基因hsp70表达的影响

热激蛋白在昆虫响应环境胁迫中发挥作用,然而在准噶尔盆地的拟步甲科特有种小胸鳖甲Microdera punctipennis幼虫对环境的适应过程中热激蛋白如何发挥作用尚不清楚。本研究利用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术测定了高低温处理后小胸鳖甲各龄幼虫热激蛋白hsp70基因的表达变化,以探讨小胸鳖甲幼虫hsp70对温度胁迫的响应方式。结果显示,在6-7龄幼虫中hsp70基因的表达水平是5龄之前幼虫的3-5倍,表明hsp70具有发育阶段性差异表达;各龄幼虫经42℃高温处理1 h后hsp70基因的表达量都迅速增加并达到高峰,其中2-5龄的响应非常强烈,可达对照的一千至数千倍;冷驯化低温5℃和10℃对不同龄期幼虫hsp70表达的影响有所不同,其中1龄和4龄幼虫对5℃和10℃均有上调响应,且1龄的响应程度远高于4龄;而7龄幼虫的hsp70表达则受5℃抑制,在10℃短时间内受到诱导,长时间则受到抑制;耐寒性测定结果显示,1龄和7龄幼虫无冷驯化现象,而4龄幼虫经过5℃或10℃冷驯化2 h可使其在-10℃的存活率提高25%,表明hsp70基因表达与小胸鳖甲耐寒性无直接相关性。本研究结果将有助于全面认识HSP70在荒漠昆虫环境适应性中的作用机制。     

短时高温胁迫对褐飞虱存活及其热激蛋白基因hsp70表达的影响

为探讨短时高温胁迫对褐飞虱成虫存活的影响及热激蛋白基因hsp70在此过程中的作用,通过室内试验观察羽化24 h内的褐飞虱成虫经过不同高温(31~40℃)暴露和不同恢复时间(1~72 h)后的存活及其体内hsp70表达情况,并构建了褐飞虱hsp70实时荧光定量RT-PCR检测体系。结果表明,褐飞虱在31~39℃下暴露2 h对其成虫存活无显著影响,39.5℃下其存活率显著降低,为44.4%,40℃下无成虫存活;在37℃下暴露2 h后,在12 h的恢复时间内褐飞虱的存活率与对照组无显著差异,但随着恢复时间延长存活率迅速下降。缓和高温(31℃和33℃)对褐飞虱成虫hsp70表达具有诱导作用,其表达量分别为对照组的3.8和6.7倍;在35℃和37℃时达到最高峰,为对照组的291.2和232.5倍;当温度达到39℃和39.5℃时hsp70表达量呈下降趋势,但仍为对照组的46.7和26.2倍。褐飞虱37℃处理2 h后,随着恢复时间的延长,hsp70基因表达水平迅速下降,恢复48、72 h时,仅为对照组的0.4和0.7倍。推测该基因的表达在褐飞虱抵抗短时高温胁迫过程中具有重要作用。     

大豆蚜Aghsp75基因对吡虫啉及温度胁迫的应激表达

热激蛋白在昆虫抵御温度胁迫和药剂胁迫反应中具有重要作用。本试验通过高通量测序获得一条大豆蚜热激蛋白基因的cDNA序列,该序列全长2982 bp,含1个长度为2052 bp的开放阅读框,编码683个氨基酸组成的多肽,多肽等电点约为6.30,分子质量约为77.8 kDa;推导的氨基酸序列与棉蚜Aphis gossypii HSP75同源性高达99.12%,属于hsp 75家族。我们把该基因定名为Aghsp75,已提交至GenBank（登录号为MN068810）。Aghsp75通过不同浓度吡虫啉药剂和不同温度胁迫成蚜后发现,经LC₅₀吡虫啉浓度胁迫3、6和24 h时以及在LC₃₀浓度吡虫啉胁迫12 h时该基因表达量显著升高;经6℃处理6 h时以及36℃处理3 h和6 h时该基因表达量显著升高。本研究表明该基因可能参与大豆蚜的抗逆过程,为利用分子生物技术手段防治大豆蚜提供理论保障。     

水稻条纹病毒胁迫对灰飞虱mucin基因表达量的影响

为分析灰飞虱mucin基因在水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)侵染过程中的作用,采用荧光定量PCR的方法分析了RSV 胁迫条件下灰飞虱mucin基因mRNA表达量的变化。饲喂RSV病叶1天和2天时灰飞虱mucin基因的表达量没有明显变化,而在3天和7天时灰飞虱mucin基因的表达量增加了3.60倍和1.97倍。饲喂健康水稻叶片1、2、3和7天后,灰飞虱mucin基因的表达量分别为饲喂前的1.07、1.12、0.78和0.34倍,而饲喂病叶1、2、3和7天后,mucin基因的表达量分别为饲喂前的1.15、1.19、3.19和1.01倍。结果表明,病毒胁迫使灰飞虱体内mucin基因的表达量增加,暗示mucin基因在RSV与灰飞虱互作过程中起着重要作用。     

温度胁迫下沙葱萤叶甲小热激蛋白基因GdHsp20.6的克隆及表达分析

为明确小热激蛋白在沙葱萤叶甲Galeruca daurica应对温度胁迫中的作用,采用PCR方法克隆沙葱萤叶甲小热激蛋白基因Hsp20（GdHsp20.6）完整的开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,应用在线软件对GdHsp20.6基因进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达及纯化其编码蛋白,并通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）技术分析不同温度胁迫下GdHsp20.6基因的表达量。结果显示,GdHsp20.6基因ORF序列长度为543 bp,编码180个氨基酸,预测分子量为20.6 kD,无跨膜区和信号肽。GdHsp20.6氨基酸序列有高度保守的α-结构域。GdHsp20.6氨基酸序列与其它鞘翅目昆虫的Hsp20氨基酸序列有较高的一致性,其中与花绒寄甲Dastarcus helophoroides的Hsp20.99氨基酸序列的一致性最高,为63%。GdHsp20.6基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）细胞系中成功表达,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG）诱导后GdHsp20.6蛋白成功表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和Western-blot分析表明融合蛋白大小与预测大小一致,并纯化获得了纯度较高的目的蛋白GdHsp20.6。低温（-10~5℃）和高温（35~40℃）处理1 h以及处理后25℃恢复30 min均能诱导GdHsp20.6基因表达上调,并且0℃处理30~120 min也能诱导GdHsp20.6基因表达上调。表明GdHsp20.6基因在沙葱萤叶甲应对低温和高温胁迫中可能起着重要作用。     

小麦白粉菌HSP70基因的克隆及高温胁迫对其表达的影响

小麦白粉病是由专性寄生菌Blumeria graminisf.sp.tritici引起的一种重要的气传真菌病害,该病曾于1990-1991年两年在我国发生大流行,近年来其发生面积也一直维持在500万公顷以上,给我国小麦生产造成了严重的损失.已有的研究结果表明,温度不但影响小麦白粉病的发生和流行,而且温度胁迫作用还会对白粉病菌群体产生影响,从而使病菌群体对温度的敏感性降低.目前已发现在我国白粉病菌群体中存在抗高温或耐高温的菌株,而且这些菌株在较高的温度下其寄生适合度要高于对温度高敏感性的菌株[1].由于病菌群体对温度敏感性的变化有可能影响病害越夏和越冬的范围,进而影响病害的发生和流行程度,因此,有必要对其耐高温的分子机制进行研究,这对于了解小麦白粉菌对温度的适应性以及气候变暖对此病害发生和流行的长期影响具有重要的意义.     

水稻热休克蛋白HSP70基因克隆、表达分析及原核表达

为明确水稻热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）基因在逆境胁迫下的表达特征,以日本晴粳稻水稻品种为材料,通过基因克隆方法获得水稻HSP70基因cDNA全长序列,并采用生物信息学的方法分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术测定不同水稻组织、不同激素、不同温度以及不同逆境下HSP70基因的相对表达量,同时对其原核表达条件进行优化。结果表明,水稻HSP70基因全长1 950 bp,预测蛋白大小为71.18 kD,等电点为5.10,亚细胞定位于细胞质内,有较强的亲水性。水稻HSP70蛋白序列与香蕉HSP70蛋白序列的亲缘性较高;水稻HSP70基因表达具有组织特异性,在茎中的相对表达量最高,在根中最低;低温胁迫后,水稻HSP70基因在12 h内基因相对表达量相对稳定,在24 h时相对表达量达到峰值,为9.60;高温胁迫后,在较短时间内水稻HSP70基因显著上调并达到峰值,为79.10;激素吲哚乙酸、脱落酸和油菜素内酯均能诱导水稻HSP70基因表达;但在甘露醇模拟干旱和NaCl盐胁迫处理下,水稻HSP70基因的相对表达量呈现先升后降的趋势。水稻HSP70蛋白的最佳诱导温度是30℃,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷最佳诱导浓度为1.2 mmol/L。     

莲草直胸跳甲热激蛋白90基因的分子特征、表达模式及对温度胁迫的响应

莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila是世界性入侵杂草空心莲子草Alternanthera philoxeroides的专食性天敌,冬季低温和夏季高温会影响其种群数量从而降低防控效果。为进一步探讨莲草直胸跳甲对温度胁迫适应性的分子生态机制,本研究对其热激蛋白90(AhHSP90)进行了蛋白结构、磷酸化修饰及系统发育等生物信息学分析,并采用荧光定量PCR检测了AhHSP90基因的时空表达动态及不同温度胁迫后的表达。RT-qPCR结果显示,AhHSP90在莲草直胸跳甲整个生活史及雌成虫各组织中均有表达;高温(30、35和40℃)、低温(-5、0、5、10、15和20℃)胁迫2 h后,AhHSP90在高温40℃下表达显著升高,但在其他温度下无显著差异。根据对AhHSP90分子特征、表达模式以及对温度胁迫的响应等方面的综合分析,推测其可能在莲草直胸跳甲发育及抵抗高温过程中发挥着重要的作用。     

Effects of temperature on fitness costs, insecticide susceptibility and heat shock protein in insecticide-resistant and -susceptible Plutella xylostella

Effects of high temperature on insecticide susceptibility and fitness were studied in the field population of Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae) (R DBM) and a susceptible field-insectarium population of P. xylostella (S DBM). R DBM displayed 18.3-fold resistance to methamidophos and 74.0-fold resistance to avermectin. The population growth tendency index (I) values were 41.8 (S DBM) and 27.7 (R DBM) at 25 °C, and 1.19 (S DBM) and 0.23 (R DBM) at 33.5 °C. The level of methamidophos resistance in the progenies of R DBM declined sharply when reared at high temperature for one generation. The increase of susceptibility to methamidophos appeared to pass from generation to generation. S DBM displayed higher up-regulation of Hsp70 expression at high temperature than R DBM. It was suggested that low fitness in R DBM caused by high temperature might be involved in the sharp decline of methamidophos resistance under high temperature conditions.     

芽胞杆菌CQBS03抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

为了探讨柑桔溃疡病生防菌芽胞杆菌Bacillus CQBS03菌株TasA基因的功能,采用PCR方法从CQBS03基因组DNA中扩增出编码TasA基因的全长DNA序列,并构建pEASY-E1/TasA原核表达载体,经大肠杆菌Escherichia coli表达获得TasA基因的融合表达蛋白,纸碟法检验融合蛋白对柑桔溃疡病菌Xanthomonas citri citri的抑制作用。结果显示,CQBS03菌株的TasA基因包含1个786 bp的完整开放阅读框（GenBank登录号为JQ309841）,编码261个氨基酸残基;该序列与来源于解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens的1个已知同源TasA基因序列FJ713580的相似性达99.75%。原核表达产物经SDS-PAGE分析,检测到约31 kD的融合蛋白;纯化后的融合蛋白对柑桔溃疡病菌有明显的抑制作用,72 h后抑菌圈直径达11.5 mm。研究表明TasA基因是生防菌芽胞杆菌CQBS03抑制柑桔溃疡病菌的功能基因之一,并且该基因对原核表达宿主没有抑制作用,具有较好的开发利用前景。