芒果UFGT基因的克隆及表达分析

花色素苷的合成是红色芒果果实着色的主要代谢途径,类黄酮糖基转移酶(UFGT)是花色素苷合成的最后一个酶,它可以将不稳定的花色素催化成花色素苷。根据已经报道的UFGT基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE、5'RACE方法,克隆得到芒果果实UFGT基因的全长c DNA序列。该基因开放阅读框为1 392 bp,编码463个氨基酸,分子量为51.15 ku。对基因组扩增得到2 770 bp长度的片段分析发现,该基因含有2个内含子,分别在501~1 095 bp、1 548~2 330 bp。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与荔枝、山竹子等热带果树具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的UFGT基因表达进行分析发现,红色的芒果品种中表达量较高,黄色的芒果品种中表达量较低。     

芒果PAL基因的克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)是酚类物质合成的第一个酶,是催化苯丙烷类反应的第一酶。根据已经报道的PAL基因的序列设计兼并引物,采用3′RACE和5′RACE方法,克隆得到了芒果果实PAL基因的全长cDNA序列。该基因开放阅读框为2160 bp,编码719个氨基酸,分子重量为79.18 kD。对基因组扩增得到了2200 bp长度的片段分析发现,该基因未含有内含子序列。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与问荆、杉木、银杏等植物具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的PAL基因的表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。     

芒果CHI基因的克隆及其表达分析研究

采用RT-PCR和RACE方法从芒果的果实中克隆得到了一个参与花色素苷生物合成的查尔酮异构酶基因(CHI)的全长的c DNA序列,进而对得到的序列采用了TMHMM、DNAman等软件进行生物信息学分析,发现芒果CHI基因包含编码区、3′和5′非翻译区的长度为960 bp的c DNA序列,开放阅读框为753 bp,编码250个氨基酸;等电点为6.46,分子重量为27.03 Kd;对跨膜结构域进行了预测发现,该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-折叠为主;聚类分析发现:该基因与美洲葡萄、葡萄、龙眼和橄榄等植物的亲缘关系较近,而与拟南芥、萝卜、文心兰等亲缘关系较远;分别对红色和绿色的叶片分析发现:该基因主要在红色叶片中表达量比较高。     

越橘查耳酮合酶基因的克隆及表达分析

为研究越橘花色素苷合成的分子机制,利用RT-PCR和RACE技术从越橘(Vaccinium spp.)果实中克隆了查耳酮合酶基因(CHS)的全长cDNA,命名为VcCHS,GenBank登录号为JN654702.VcCHS全长1438 bp,包含107 bp的5 ′非编码区、71 bp的3′非编码区和1个长度为1 260 bp编码419个氨基酸的开放阅读框.该基因编码的蛋白具有CHS家族普遍存在的功能活性位点:Cys(C)164、His(H)303、Asn(N)336和特征多肽序列(RLMMYQQGCFAGGTVLR).多重比对分析发现越橘VcCHS基因编码的氨基酸序列与葡萄(Vitis vinifera)CHS基因编码的氨基酸序列相似性达90.2％.系统进化分析表明,该序列与杜鹃花目的植物聚为一类.VcCHS基因在果实发育的整个过程均有不同程度的转录表达,花期和果实成熟期表达量较高,绿果期表达量最低.VcCHS相对表达量变化与花色素苷相对含量的变化趋势具有一致性,并均在果皮组织中达到最高.     

芒果C4H基因的克隆及其表达分析

肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)是植物苯丙烷合成途径的关键酶之一,其蛋白质活性和转录丰度直接影响植物中黄酮类化合物和芳香族化合物的生物合成量。根据已经报道的C4H基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE、5'RACE方法,克隆得到芒果果实C4H基因的全长cDNA序列为1 680 bp。该基因开放阅读框为1 518 bp,编码505个氨基酸,分子量为58.08 ku。蛋白等电点为9.52,分析发现该基因主要定位在线粒体中。通过软件预测得到3种三级蛋白结构图;通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与橄榄、可可等植物具有较近的亲缘关系。对不同着色的芒果品种的C4H基因表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量最高,而绿色的桂七品种中表达量最低。     

观赏海棠McF3'H的克隆及不同品种间表达差异分析

为了探究McF3′H基因与花色苷之间的关系,以苹果属观赏海棠‘王族’叶片总RNA为模板,通过RACE扩增,获得类黄酮3′-羟化酶(Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H)基因序列,其基因编码区共1 536bp,编码511个氨基酸,命名为McF3′H。McF3′H编码的氨基酸序列与其他物种的F3′H蛋白具有较高相似性。对3种不同叶色的观赏海棠品种‘火焰’、‘绚丽’和‘王族’叶片不同发育时期的McF3′H表达量、花青苷含量进行测定分析。结果表明McF3′H基因在3种不同叶色类型的观赏海棠品种叶片中均有表达,常色紫叶类‘王族’叶片McF3′H相对表达量明显高于新叶有色类‘绚丽’和绿色叶‘火焰’,McF3′H表达量与花色苷含量的变化规律较为一致。说明McF3′H在苹果属观赏海棠叶片花青苷代谢及色泽形成过程中具有重要作用。     

观赏海棠McF3′H的克隆及不同品种间表达差异分析

为了探究McF3′H基因与花色苷之间的关系,以苹果属观赏海棠‘王族’叶片总RNA为模板,通过RACE扩增,获得类黄酮3′-羟化酶(Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H)基因序列,其基因编码区共1 536bp,编码511个氨基酸,命名为McF3′H。McF3′H编码的氨基酸序列与其他物种的F3′H蛋白具有较高相似性。对3种不同叶色的观赏海棠品种‘火焰’、‘绚丽’和‘王族’叶片不同发育时期的McF3′H表达量、花青苷含量进行测定分析。结果表明McF3′H基因在3种不同叶色类型的观赏海棠品种叶片中均有表达,常色紫叶类‘王族’叶片McF3′H相对表达量明显高于新叶有色类‘绚丽’和绿色叶‘火焰’,McF3′H表达量与花色苷含量的变化规律较为一致。说明McF3′H在苹果属观赏海棠叶片花青苷代谢及色泽形成过程中具有重要作用。     

芒果LAR基因的克隆及其表达分析

无色花青素还原酶(leucoanthocyantin reductase,简称LAR)基因是植物原花色素的一个关键基因。本研究根据已经报道的LAR基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE和5'RACE方法,从芒果(Mangifera indica)果实中克隆得到1个LAR基因,其全长c DNA序列为1 221 bp。该基因开放阅读框为1 059 bp,编码352个氨基酸,等电点为5.78,分子质量为38.38 ku。利用生物信息学在线分析软件对该蛋白组成成分、疏水性/亲水性、二级结构、功能结构域以及三级结构进行预测和分析。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与棉花、葡萄、蓝莓、柿等具有较近的亲缘关系;对不同芒果品种的LAR基因的表达进行分析发现,绿色的桂七品种中表达量较高,而黄色的金煌品种中表达量较低。     

芒果BCH基因的克隆与表达

β-胡萝卜素羟化酶(BCH)基因是催化玉米黄素合成的关键基因,玉米黄素在植物光保护过程中发挥着重要的作用。采用RACE方法从黄色的金煌芒果的果皮中克隆得到了1个BCH基因,该基因全长cDNA序列为1 160 bp,开放阅读框为888 bp,编码295个氨基酸,分子质量为32.97 ku,分子等电点为9.51。利用生物信息学在线分析软件对其组成成分、疏水性/亲水性、二级结构、功能结构域以及三级结构进行预测和分析。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与温州蜜柑、柚子、大豆、草莓等具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的BCH基因的表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量较高,而黄色的金煌品种中表达量较低。     

越橘VcANS基因的克隆及表达分析

【目的】从越橘果实中克隆花色素合成酶（ANS）基因cDNA,为研究越橘花色素苷合成的分子机制奠定基础。【方法】以越橘（Vaccinium spp.）品种“北陆”（V.corymbosum L.）为试材,并以Illumina测序文库（NCBI登录号：SRA046311）中差异表达的Unigene 38125片段为基础,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得花色素合成酶基因全长cDNA,利用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和系统进化分析,探讨ANS基因在不同组织和器官中的相对表达量及其与对应花色素苷含量的关系。【结果】成功克隆了越橘花色素合成酶基因序列,命名为VcANS,GenBank登录号为JN654701。序列分析结果表明,VcANS全长1 424 bp,包含93 bp的5′非编码区、248 bp的3′非编码区和1个长度为1 083 bp编码360个氨基酸的开放阅读框,该基因编码的蛋白具有ANS家族普遍存在的2酮戊二酸和Fe²⁺依赖的氧化酶超家族的保守结构域。序列比对和系统进化分析表明,VcANS与杜鹃花科植物亲缘关系最近。在越橘果实发育的不同阶段,VcANS相对表达量的变化与花色素苷含量的变化趋势具有一致性。【结论】获得了越橘花色素合成酶基因全长,推测其对越橘花色素苷的形成起调控作用。     

芒果ANR基因的克隆及其表达分析

花青素还原酶(anthocyanidin reductase,简称ANR)基因是植物产生原花青素的关键基因,对于研究原花青素的代谢有重要的作用。根据已经报道的ANR基因的序列设计兼并引物,采用3'c DNA末端快速扩增(3'RACE)、5'c DNA末端快速扩增(5'RACE)方法,从芒果果实内克隆到1个ANR基因,其全长c DNA序列为1 201 bp。该基因开放阅读框为1 008 bp,编码335个氨基酸,等电点为5.41,分子量为36.33 ku。对基因组扩增得到了1 810 bp长度的片段,分析发现,该基因含有5个内含子,内含子位置分别为130~646 bp、733~814 bp、1 017~1 080 bp、1 259~1 349 bp、1 563~1 651 bp。通过系统发育树分析发现,该基因编码的蛋白与可可、葡萄等果树具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种中ANR基因的表达进行分析发现,该基因在绿色的桂七品种中表达量较高,而在红色的贵妃品种中表达量较低。     

F3′5′H基因的克隆、表达载体构建与矮牵牛遗传转化

类黄酮3′5′羟基化酶(Flavonoid-3’,5-’hydroxylase;F3′5′H)是花色素苷代谢途径中的一个关键性酶,能使花色素的合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素。从蓝紫色矮牵牛的花瓣中提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到了约1.7kb的F3′5′H片段。F3′5′H的cDNA序列分析结果表明,克隆得到的序列与原序列同源性达到99.34%,开放读码框为1 521 bp,编码507个氨基酸。将推算的氨基酸序列与NCBI登录的氨基酸序列进行分析比较,发现与文献报道的存在2个氨基酸差异,氨基酸同源率为99.6%。将此基因构建到含有35S启动子的植物表达载体PBI-F3′5′H上,并通过农杆菌介导法对粉红色矮牵牛进行了遗传转化,初步鉴定获得了转基因植株。     

甜樱桃MYB转录因子基因的克隆与表达分析

本研究利用转录组测序结果,通过RT-PCR从甜樱桃品种‘美早’果实中克隆出1个MYB转录因子基因,将其命名为PaMYB10,Gen Bank登录号为ALH21137.1。该基因编码的氨基酸序列具有R2和R3保守结构域,属于R2R3-MYB家族基因,与蔷薇科的桃、欧李、梅等作物亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,PaMYB10在红色品种‘美早’的茎、叶、花和果实中均有表达,但表达量存在差异,在成熟果实中表达量最高。‘美早’中花青苷含量随着果实的发育逐渐升高,PaMYB10的表达显著上调;‘13-33’中花青苷含量随着果实的发育变化不明显,基因表达量变化也不明显。在果实发育后期,‘美早’果实中花青苷含量和PaMYB10的表达量均显著高于‘13-33’。推测PaMYB10的高水平表达可能与红色甜樱桃果实花青苷积累有关。     

两个红梨品种花色苷合成相关基因及转录因子MYB10表达模式分析

为研究不同红色梨品种着色差异的原因,以西洋梨品种红星和砂梨品种满天红为试材,通过荧光定量PCR方法,分析果皮中花色苷合成基因PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、F3GT和转录因子MYB10基因在果实不同发育期的转录特性。结果表明,在红星中除PAL外,花色苷合成基因表达量与果皮花色苷含量变化一致,先升高后降低;在满天红中,PAL和F3GT在果实转色期表达量最高,其他基因表达量随果实发育而下降。转录因子MYB10在红星整个果实发育期表达水平都很低,在满天红转色期呈现峰值,且表达量是红星的50倍以上。红星着色程度可能由多个基因协同作用,而满天红着色可能受关键基因F3GT的影响,MYB10可能通过调控F3GT的表达从而调控满天红的着色。     

呈色机制不同的桃叶片花色素苷积累及合成相关基因表达的季节性差异

[目的]红叶桃叶片夏季呈现高温"返青"现象,而早熟桃夏季果实采收后叶片逐渐变红,2种桃叶片呈色规律相反。测定其花色素苷生物合成相关结构基因和转录因子表达特性,分析与叶片呈色之间的关系。[方法]以红叶桃品种‘筑波5号’和‘洛格红叶’、早熟桃品种‘早美’和‘春蕾’以及绿叶桃品种‘京蜜’为试材,分别在春、夏、秋3个季节测定其叶片花色素苷含量、叶片色差以及与叶片花色素苷生物合成相关的结构基因(CHS、CHI、F3H、F3'H、DFR、LDOX、UFGT)和调节基因(MYB10、b HLH3、WD40、MYBPA1、MYB15、MYB16、MYB111、MYB123)的时空表达。[结果]2个红叶桃品种花色素苷含量在夏季下降,秋季回升;2个早熟桃品种夏季叶片逐渐变红,花色素苷含量一直增加;而绿叶桃叶片一直处于绿色,花色素苷含量基本保持稳定。结构基因中CHS、CHI、F3'H、DFR、LDOX、UFGT和调节基因中MYB10、MYBPA1、MYB16、MYB111、WD40、b HLH3的表达水平与桃叶片中花色素苷含量呈正相关;而MYB15和MYB123基因的表达水平与桃叶片中花色素苷含量呈负相关。[结论]6个结构基因和6个调节基因表达水平与红叶桃、早熟桃花色素苷积累关系密切,表明其在调控桃叶片着色过程中起重要作用。     

山葡萄F3’5’H基因的克隆与表达及其启动子5′端缺失片段的功能分析

通过克隆山葡萄（Vitis amurensis）类黄酮-3’5’-羟化酶（flavonoid-3’,5’-hydroxylase,F3’5’H）基因及其启动子,并进行基因的原核表达和启动子不同缺失片段的瞬时表达,研究山葡萄不同种类花色苷的形成机制。克隆得到F3’5’H基因全长1 527bp,分析其理化性质发现,‘双红’品种F3’5’H较‘双丰’品种有所差异,通过对F3’5’H重组蛋白体外表达条件的探究,在温度为25℃、培养时间为11h且IPTG浓度为0.8mmol·L-1的条件下,目的蛋白在上清样品中有与预测重组蛋白分子量大小一致且较高浓度的表达带。山葡萄F3’5’H基因启动子序列共1 271bp,启动子序列中除具有核心启动子元件CAAT-box和TATA-box外,还有一系列光响应元件。采用启动子缺失技术研究不同长度缺失片段启动子在烟草中的瞬时表达,发现随着F3’5’H启动子缺失片段长度的增加,GUS酶活性呈先上升后下降的趋势。     

芒果MinSPP基因的克隆及表达载体构建

磷酸蔗糖磷酸酶(sucrose phosphate phosphatase)是合成蔗糖的关键酶,为了研究其在芒果果实中蔗糖合成的作用机制,从芒果果肉中克隆得到1个与蔗糖合成相关的基因,将其命名为MinSPP,其cDNA全长序列为1 561 bp,开放阅读框为1 275 bp,编码424个氨基酸,蛋白质分子量为48.46 ku,等电点为5.34,对MinSPP基因编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与克莱门柚具有较近的亲缘关系。采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的贵妃芒果肉中的表达量进行分析,结果显示从青熟期到成熟期芒果果肉中该基因表达量逐渐上升,从成熟期到完熟期芒果果肉表达量逐渐降低,其中成熟期芒果果肉中表达量较高。本研究深入了解了芒果蔗糖合成的分子机制,进一步构建了pBI121-MinSPP过表达载体,为MinSPP的功能鉴定奠定了理论基础。     

黄鳝性逆转相关基因的克隆和表达

运用cDNA末端快速扩增(Rapid-Amplification of cDNA Ends,RACE)技术和半定量RT-PCR技术,克隆了黄鳝(Monopterus albus)性腺差异表达基因(F64)的cDNA全长序列,分析了该基因于各期性腺组织的表达情况。结果表明,F64基因cDNA全长1 721 bp,含有142 bp的5’-UTR、268 bp的3’-UTR、1 311 bp的开放阅读框(ORF),共编码436个氨基酸;在线SignalP分析表明,F64亚基肽链不存在信号肽,为非经典分泌蛋白;同源性分析结果显示该基因无同源性序列,视为新报道的基因;F64在卵巢发育早期不表达,从排卵的Ⅴ期卵巢开始表达,随着卵巢的败育和精巢的发育,表达量明显升高。     

甜瓜果实八氢番茄红素脱氢酶基因（CmPDS）的克隆与表达

以甜瓜自交系‘M01-3’果实cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了甜瓜果实八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因cDNA全长序列,命名为CmPDS（基因注册号：KC507802）。序列分析表明,该基因有开放阅读框1731 bp,编码576个氨基酸,与其他植物PDS氨基酸序列具有较高的同源性,尤其与黄瓜、南瓜、苦瓜PDS氨基酸序列高达92.6%~87.8%。荧光定量分析表明,该基因在甜瓜不同器官中均有表达,在叶片和授粉后25 d的果实中表达量较高,在根中表达量最低;随果实发育成熟,该基因表达量呈现先升高后降低趋势。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.