镉对体外培养小鼠肝细胞的毒性效应

【目的】研究不同浓度的镉对体外培养的小鼠肝细胞存活影响。【方法】采用组织块法启动肝细胞的原代培养,胰酶消化法传代培养,利用光镜观察、MTT细胞存活率检测、Hoechst33342荧光染色和DNA琼脂糖凝胶电泳等方法研究氯化镉对体外培养肝细胞存活的毒性作用。【结果】结果显示,在37℃,含20%胎牛血清的DMEM/F12培养条件下,肝脏组织原代培养启动第3天即有不规则多角形的细胞迁出,第8~10天长成细胞单层。5~160μmol/L氯化镉处理可显著降低体外培养的肝细胞的存活率,具有浓度和时间的依赖性,处理24和48 h对肝细胞的半致死浓度分别为30.3和21.0μmol/L。【结论】氯化镉处理导致肝细胞染色质的凝缩和DNA片段化,诱导细胞凋亡。     

马齿苋多糖对小鼠大脑神经细胞代谢损伤修复机制的研究

为探讨马齿苋多糖(Portulaca oleracea polysaccharide,POP)对小鼠大脑神经细胞代谢损伤的修复保护机制,采用原代培养小鼠大脑神经细胞的方法,分别用20μmol/L的β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)处理原代培养细胞、20μmol/L的Aβ加10 mmol/L的POP共同处理原代培养细胞;对处理的原代细胞进行倒置相差显微镜观察与PI-Hochest双染色成活分析,用Western blotting检测处理后的原代细胞P35和P25条带的表达;pEGFP-tau-s3和pcDNA-GSK-3β转染原代培养细胞,pEGFP-tau-s3和pcD-NA-GSK-3β加POP共同转染原代培养细胞,48 h后荧光观察和Western blotting检测GSK-3β的表达。结果显示,倒置相差显微镜下经20μmol/L Aβ处理的原代培养细胞出现了皱缩,部分细胞死亡;经PI-Hochest双染色细胞成活分析,Aβ和POP共同处理的原代培养细胞成活率明显高于只用Aβ处理的原代培养细胞;Western blotting检测到Aβ处理的细胞出现了P25条带,而Aβ加POP共同处理的细胞P25条带明显减弱;Western blotting检测发现,pEGFP-tau-s3和pcDNA-GSK-3β与POP共转染的细胞中,其tau蛋白的迁移率高于只转染pEGFP-tau-s3和pcDNA-GSK-3β的细胞tau迁移率。所以POP对小鼠大脑原代培养细胞Aβ损伤有修复保护作用,并能减少P35到P25的裂解和GSK-3β对tau的磷酸化。     

Cu2+诱导刺激对喜树悬浮培养细胞喜树碱生物合成的影响

[目的]探讨Cu^2＋作为诱导子对喜树悬浮培养细胞喜树碱积累的影响。[方法]在喜树悬浮培养细胞中,细胞生长的不同阶段,添加不同终浓度的Cu^2＋,诱导刺激喜树碱的生物合成。[结果]0.5μmol/L终浓度的Cu^2＋在第8天添加对细胞的生长最有利,而40.0μmol/L终浓度的Cu^2＋在第18天添加对喜树碱生物合成最有利。在第8天添加0.5μmol/L终浓度的Cu^2＋后再在第18天添加40.0μmol/L终浓度的Cu^2＋,可以使喜树碱的产量在第24天达到71.9mg/L,是未经处理的7.9倍。[结论]Cu^2＋诱导刺激可以显著提高喜树悬浮培养细胞喜树碱的产量。     

镉损伤肝细胞体外模型的建立

在建立大鼠原代肝细胞体外培养的基础上,研究了不同浓度的醋酸镉对肝细胞存活率的影响。在原代肝细胞体外培养的不同时间点(4、7、10、24 h),用不同浓度的醋酸镉(0、0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L)处理3 h,MTT法测定细胞的相对存活率。结果显示,随着镉剂量的增加,细胞的相对存活率降低。当醋酸镉浓度为4.0μmol/L,细胞的相对存活率为78.35%,与对照组有极显著性差异(P0.01);用4.0μmol/L醋酸镉在不同时间点处理肝细胞,与对照组相比,细胞存活率均极显著降低(P0.01)。表明镉损害肝细胞具有一定的浓度依赖性。     

氯化镉对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性效应

旨在研究不同浓度氯化镉对60~80 代二倍体和三倍体泥鳅鳍细胞系（DIMF和TRMF）的毒性效应,比较不同倍性细胞系间的敏感性差异。采用MTT比色法测定半致死浓度,采用酶活力测定法、微核试验和实时定量PCR法测定了氯化镉对2 种细胞系的细胞毒性和遗传毒性。结果表明：氯化镉处理下DIMF、TRMF细胞系半致死浓度分别为(24.0±0.7)、(27.3±1.3) μmol/L。2 种细胞系的SOD、GSH-Px活性随着氯化镉浓度的增加,呈现先升高后降低的趋势,而GST活性则表现为逐渐降低。随着氯化镉浓度的增加微核率先升高后降低,DIMF、TRMF最大微核率分别为(7.33±0.33)‰、(8.33±0.67)‰。经氯化镉处理的细胞金属硫蛋白(MT)表达量显著增加,30 μmol/L 浓度组表达量最大,分别为对照组的55.6 和57.6 倍。研究表明,氯化镉对泥鳅二倍体和三倍体细胞系具有细胞毒性和遗传毒性,且二倍体细胞系较三倍体细胞系对氯化镉更为敏感。     

仔猪肠黏膜上皮细胞体外培养及其对小檗碱适应性的研究

为了体外分离培养和鉴定仔猪肠粘膜上皮细胞,探讨小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全剂量。本试验取刚出生未吃初乳的仔猪小肠的回肠段,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ进行消化处理,获得原代仔猪肠粘膜上皮细胞,用免疫组化法对培养的仔猪肠粘膜细胞进行鉴定,用MTT检测法测定硫酸小檗碱对仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度。结果表明:免疫组化法分离培养的细胞膜呈棕黄色,为粘膜上皮细胞。硫酸小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度为20μmol/L。     

没食子酸对小鼠TM3细胞凋亡的影响

为了研究植物多酚类化合物没食子酸(Gallic acid, GA)对小鼠TM3睾丸间质细胞凋亡的影响,利用WST-1、JC-1、DAPI以及RT-PCR方法研究GA对体外培养的TM3细胞活力、线粒体膜电位、增殖凋亡相关基因表达的影响。WST-1结果显示,培养体系中添加0,20,100,200,400μmol/L的GA,处理24 h后可抑制TM3细胞活力,且呈剂量依赖性,与对照组相比较,20～400μmol/L处理组TM3细胞活力显著降低(P<0.05)。进一步研究发现,20μmol/L和400μmol/L GA显著抑制细胞增殖相关基因Cyclin B1及PCNA表达(P<0.05),促进细胞凋亡相关基因BAX表达(P<0.05),引起细胞线粒体膜电位降低,细胞核固缩,形成细胞凋亡小体。结果表明,体外培养体系中添加GA可以明显抑制TM3细胞活力,引起细胞细胞凋亡。     

牛磺胆酸对小鼠胸腺细胞凋亡影响的研究

为研究牛磺胆酸(TCA)对体外培养小鼠胸腺细胞凋亡的影响,探讨其免疫调节作用,采用梯度离心法分离获取小鼠胸腺细胞,37℃培养12 h后与不同浓度TCA共孵12 h。以流式细胞术对原代培养胸腺细胞早期凋亡进行定量检测;应用分光光度法检测了凋亡特异性蛋白酶Caspase-9、Caspase-3活性的变化。结果表明,TCA3组(终浓度为0.30μg/m L)与胸腺细胞共孵12 h后,可极显著抑制磷脂酰丝氨酸外翻,抑制细胞凋亡,TCA2组(终浓度为0.15μg/m L)可显著提高Caspase-9、Caspase-3活性,诱导细胞凋亡。说明TCA通过对体外培养小鼠胸腺细胞凋亡的调节作用来调节机体免疫功能。     

7种五味子木脂素对草鱼原代肝细胞的毒理研究

为研究五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酯甲和五味子酯乙这7种木脂素对草鱼肝细胞的毒性作用和安全浓度,采用草鱼原代肝细胞作为实验模型。实验组加入1~1 000μmol/L不等的待测木脂素,溶剂对照组加入等体积的二甲基亚砜,阳性对照组加入8 mmol/L的四氯化碳。培养22 h后,采用CCK-8细胞毒性实验评价木脂素的细胞毒作用,并检测培养上清GPT和GOT评价肝细胞膜通透性的改变。结果显示,醇乙在≥700μmol/L、乙素在≥100μmol/L时有细胞毒性,但均未见GPT和GOT的升高;醇甲在最高1 000μmol/L、甲素丙素在最高100μmol/L、酯甲酯乙在最高50μmol/L时均未见明显的细胞毒性。结果表明,醇乙和乙素具有一定的肝细胞毒性,主要表现为细胞代谢水平的下降,但不足以引起细胞膜通透性的显著改变;其余5种木脂素无明显肝细胞毒作用。     

山羊睾丸支持细胞分离培养及其氧化应激效果研究

为探究在体外培养过程中山羊睾丸支持细胞(GSCs)存在的氧化应激问题,采用2步酶消化法分离和纯化GSCs,通过形态学观察、MTT法、油红染色和流式细胞鉴定细胞活度和纯度,再用不同浓度的H2O2处理GSCs,研究GSCs的活性、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性及其DNA指数(DI)的变化。结果表明:GSCs形态为多角形状;在培养至第5天时GSCs活性最强;油红O染色鉴定多数细胞胞质含有红色的脂滴;GATA4阳性细胞率达到88.27±3.29%;添加50μmol/L H2O2组细胞存活率与对照组相比差异不显著(P0.05),其它各组均显著低于对照组(P0.05);添加50μmol/L H2O2组MDA含量和SOD的活性均与对照组无显著性差异(P0.05),而其他各组均与对照组有显著差异(P0.05);细胞DNA倍体检测发现添加50μmol/L H2O2时,细胞DI为1.08±0.01,未出现异倍体;其他各组细胞DI分别为1.15±0.02、1.20±0.03、1.26±0.03和1.32±0.01,均有异倍体产生。本研究分离纯化了GSCs,并进行培养和鉴定,200μmol/L H2O2处理GSCs后,SOD活性显著降低,MDA含量显著增加,出现明显的异倍体,200μmol/L H2O2是建立GSC氧化应激模型的适宜浓度,以此为后期建立GSC氧化应激模型提供研究基础。     

Aβ1-42对神经干细胞的增殖和分化的影响

取新生1d的ICR小鼠的脑,经过机械分离和体外培养获取神经千细胞.利用免疫组化和RT-PCR对神经干细胞进行鉴定,发现原代的神经干细胞的纯度能达到95%以上.通过计数绘制第1代和第4代神经干细胞生长曲线图,发现二者生长曲线非常相似,说明第4代的神经干细胞仍具有较强的生长能力.在体外利用聚合后0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、2.5μmol/L的Aβ1-42寡聚体分别作用于神经干细胞8h、24h和48h,通过MTT和克隆球计数法检测Aβ1-42对神经干细胞的增殖的影响,结果表明,随着Aβ1-42浓度增加和作用时间的延长,细胞的存活率逐渐降低.通过双盲法,免疫荧光下统计Aβ1-42寡聚体作用后神经干细胞的转分化率,检测Aβ1-42对神经干细胞的分化的影响,发现Aβ1-42对神经干细胞的分化没有明显影响,且对Aβ1-42浓度和作用时间也无依赖性.     

T-2毒素对小鼠睾丸间质细胞活力和功能的影响

目的研究T-2毒素对睾丸间质细胞活力和功能影响。方法对分离出的4~5周龄BABL/c小鼠睾丸间质细胞进行体外培养,将培养的细胞分别接种于96孔培养板和24孔培养板里,T-2毒素药物处理后培养24 h,弃去96孔培养板里的培养液,添加MTT溶液,继续培养4h后检测睾丸间质细胞的活力情况;收集24孔培养板里的培养液用于睾酮水平的测定。结果贴壁细胞继续培养24 h后,当T-2毒素浓度10ng·m L-1h CG+10-9mol·L-1时,MTT吸光度值(P0.01)和睾丸间质细胞分泌睾酮的浓度(P0.05)与对照组相比差异显著;而10ng·m L-1h CG+10-10mol·L-1T-2毒素试验组睾酮分泌量与对照组相比差异不显著(P0.05)。结论 T-2毒素浓度10-9mol·L-1时对体外原代培养的小鼠睾丸间质细胞活力和功能均有显著毒性作用,且随T-2毒素浓度增加,毒性作用增强。     

朊蛋白多肽PrP 106-126对小鼠成神经瘤细胞N2a的毒性研究

采用Annexin V-FITC/PI双重染色的流式细胞检测和细胞凋亡的形态学观察,探讨了朊蛋白多肽PrP106-126对小鼠成神经瘤细胞系N2a细胞的毒性作用.结果表明:15、25和50μmol/L浓度的PrP 106-126作用于N2a细胞24 h均引起了细胞明显的形态学变化,提高了细胞凋亡率(P＜0.05),且浓度越大,凋亡效果越明显;在浓度为25μmol/L时,PrP 106-126作用N2a细胞48 h引起的毒性作用明显大于24 h,而100μmol/L PrP 106-126作用N2a细胞12 h并未引起细胞凋亡(P＞0.05).试验还表明PrP 106-126对神经细胞产生的毒性是淀粉样纤维物质作用细胞逐渐造成的结果.     

去铁胺对T淋巴细胞体外增殖、活化以及细胞周期的影响

分别采用MTT法、CFSE染色结合流式细胞术、双色荧光抗体染色结合流式细胞术、PI染色法检测去铁胺(DFO)对小鼠T淋巴细胞的药物毒性、对T淋巴细胞增殖、对Con A刺激下的小鼠T细胞CD69表达和淋巴细胞周期的影响。研究结果表明:DFO对淋巴细胞的毒性T细胞体外增殖、活化和细胞周期无影响;不同浓度的DFO(5、10、20、40μmol/L)能显著抑制受Con A刺激48 h和72 h后的T淋巴细胞增殖;低浓度的DFO(5、10μmol/L)对小鼠T淋巴细胞CD69的表达没有影响,高浓度(20、40μmol/L)的DFO可抑制T淋巴细胞CD69的表达;Ph能将T淋巴细胞抑制在G0/G1期。说明DFO除可通过抑制T淋巴细胞活化外,可能还通过其他机制抑制T淋巴细胞增殖,且DFO可以将淋巴细胞周期抑制在G0/G1期,可望发展成为一种新的免疫抑制干预药物。     

脱落酸对烟草腋芽生长及叶片碳氮代谢的影响

为提高烟草的产质量，以K326为试材，采用盆栽方法研究不同浓度脱落酸（ABA）溶液（90μmol/L和228μmol/L）对烟草打顶后腋芽生长及对应节位叶片主要碳水化合物及含氮化合物的影响。结果表明：ABA处理的第7～10天及停止处理后第1～8天烟草第1节位、第2节位和第3节位腋芽长度均显著低于对照（蒸馏水，CK）；停止处理后第12天和第14天烟草第1节位和第2节位腋芽长度显著低于CK，90μmol/L处理第3节位腋芽长度显著低于228μmol/L和CK。停止处理后第4天时，228μmol/L处理的叶片氨基酸、总糖、还原糖、淀粉含量最高，其中氨基酸含量与CK差异显著；停止处理后第8天时，228μmol/L处理的氨基酸、总糖、还原糖含量和α-淀粉酶活力最高，90μmol/L处理的淀粉含量最高；停止处理后第12天时，228μmol/L处理的α-淀粉酶活力最高，90μmol/L处理的淀粉含量最高。ABA停止处理后第4天和第12天第2节位和第3节位对应叶片的可溶性蛋白含量低于CK。可见，ABA对烟草腋芽的生长具有一定的抑制作用，且各浓度对不同部位腋芽生长及对应节位叶片碳氮代谢的影响效应存在差异。     

重铬酸钾对泥鳅鳍细胞系的毒理学研究

为探究重铬酸钾的毒性机制,建立适合监测铬污染的体外检测系统,以体外培养的泥鳅Misgurnus anguillicaudatus鳍细胞系(DIMF)为试验材料,研究了重铬酸钾的毒性效应。结果表明:通过噻唑蓝(MTT)比色法测定重铬酸钾染毒后细胞的24 h半致死浓度为(25.3±1.2)μmol/L;暴露在浓度为0~30μmol/L的重铬酸钾中,细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性随着染毒浓度的增加而增大;谷胱甘肽超氧化物酶(GSH-Px)在重铬酸钾浓度为0~20μmol/L时活性升高,当染毒浓度为30 mol/L时,活力开始下降;谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性则随重铬酸钾浓度的升高而降低;微核试验显示,DIMF微核率随染毒浓度的增加呈先升高后降低的趋势,其中最大微核率为0.733%;实时定量PCR结果显示,对照组的金属硫蛋白(MT)基因表达量很低,经重铬酸钾诱导后MT基因表达量显著升高(P0.01)。研究表明,重铬酸钾可对细胞的酶系统和遗传物质造成一定的损伤。     

脱落酸对烟草腋芽生长及叶片碳氮代谢的影响

为提高烟草的产质量,以K326为试材,采用盆栽试验研究不同浓度脱落酸(ABA)溶液(90μmol/L和228μmol/L)对烟草打顶后腋芽生长及对应节位叶片主要碳水化合物及含氮化合物的影响。结果表明:ABA处理的第7～10天及停止处理后第1～8天烟草第1节位、第2节位和第3节位腋芽长度均显著低于对照(蒸馏水,CK);停止处理后第12天和第14天烟草第1节位和第2节位腋芽长度显著低于CK,90μmol/L处理第3节位腋芽长度显著低于228μmol/L和CK。停止处理后第4天时,228μmol/L处理的叶片氨基酸、总糖、还原糖及淀粉含量最高,其中氨基酸含量与CK差异显著;停止处理后第8天时,228μmol/L处理的氨基酸、总糖、还原糖含量和α-淀粉酶活力最高,90μmol/L处理的淀粉含量最高;停止处理后第12天时,228μmol/L处理的α-淀粉酶活力最高,90μmol/L处理的淀粉含量最高。ABA停止处理后第4天和第12天第2节位和第3节位对应叶片的可溶性蛋白含量低于CK。可见,ABA对烟草腋芽的生长具有一定的抑制作用,且各浓度对不同部位腋芽生长及对应节位叶片碳氮代谢的影响效应存在差异。     

吡啶甲酸铬对猪肝细胞生长的影响

对7日龄仔猪的肝脏细胞进行体外培养,研究不同浓度吡啶甲酸铬对猪肝细胞生长的影响。结果表明,随着吡啶甲酸铬添加浓度的逐渐升高,肝细胞密度先增多后减少,8μmol/L吡啶甲酸时细胞密度最多,400μmol/L吡啶甲酸铬细胞密度最少。     

盐酸法舒地尔对C3H10T1/2细胞增殖与 成脂分化的影响

【目的】探讨Rho分子信号通路阻断剂盐酸法舒地尔(HA1077)对C3H10T1/2细胞体外增殖及成脂分化的影响。【方法】体外培养C3H10T1/2细胞株,用HA1077浓度梯度培养液(0(对照组),20,40,60,80,100μmol/L)对其进行处理,通过MTT比色法和油红O染色法分别检测C3H10T1/2细胞的增殖和分化情况。【结果】HA1077对C3H10T1/2细胞的体外增殖有一定的抑制作用,且呈现出一定的浓度依赖性。但HA1077可提高C3H10T1/2细胞的成脂分化效率,也呈浓度依赖性;且当HA1077浓度大于60μmol/L后,细胞成脂分化率与对照组差异极显著(P<0.01)。【结论】HA1077可抑制C3H10T1/2细胞的增殖,但同时可以促进其成脂分化。     

WY14643对附植前小鼠胚胎体外发育及活性氧的影响

为研究人工合成的过氧化物酶体增值物激活受体α特异性受体激活剂(WY14643)对附植前小鼠胚胎体外发育的影响,以及WY14643对附植前小鼠胚胎内部活性氧的影响,通过H2O2诱导建立胚胎氧化损伤模型,添加不同浓度WY14643对胚胎进行体外培养,利用2’7’二氯荧光素二乙酸盐(DCHFDA)测定胚胎内部H2O2含量。结果表明:不同浓度WY14643处理2 h后,0.1μmol/L WY14643处理组4-细胞发育率、囊胚率显著高于其他各组(P0.05);经0.1μmol/L WY14643和H2O2联合处理后,其胚胎发育率显著高于单独H2O2处理组和对照组(P0.05);DCHFDA荧光检测发现,WY14643添加组胚胎内部各时期H2O2水平显著低于其他各组(P0.05),并且胚胎内部H2O2呈一定的变化规律。说明适宜浓度的WY14643能够增加体外发育胚胎的发育率,减少胚胎内部活性氧水平,并且胚胎内部H2O2水平在4-细胞时期达到最高,囊胚时期显著下降。