烟草根黑腐病拮抗菌的分离鉴定和生防作用特性研究

为挖掘对烟草根黑腐病菌有较强拮抗效果，且可在烟株根部稳定定殖的生防菌资源，以烟草根黑腐病菌为靶标，利用稀释涂布法和平板对峙法分离筛选出高效拮抗活性菌株，对其进行系统发育分析以及粗脂肽抑菌活性检测；并运用PCR技术检测拮抗细菌的脂肽编码基因，利用趋化性及生物膜成膜等试验研究烟草根系分泌物及其产生的各种有机酸对拮抗菌根部定殖的影响。结果表明：从烟草根际土壤中分离得到两株Thielaviopsis basicola高效拮抗菌株S2-1和SNSY15-5,分子鉴定表明，S2-1和SNSY15-5均为芽孢杆菌属细菌；拮抗菌S2-1和SNSY15-5脂肽粗提物对T.basicola毒力较强，EC₅₀值分别为1.93和2.56 mg·mL^-1,SNSY15-5含有参与脂肽类家族细菌素(bmyB)、生物素操纵子(bioA)和假定蛋白(yngG)合成的基因；S2-1菌株中含有参与脂肽类家族生物素操纵子(bioA)合成的基因；烟草品种K326根系分泌物产生的苹果酸对S2-1和SNSY15-5有较强的吸引作用，S2-1和SNSY15-5在苹果酸中的数量分别达到63...     

生物炭肥对易感根结线虫病烤烟根际菌群和理化性质的影响

为明确生物炭肥对烟草根结线虫病及根际土壤的影响,通过田间试验研究拌塘施用不同量生物炭肥对烟草根结线虫病株根际土壤的影响。结果表明,常规施肥减量10%拌塘施用酵素生物炭肥能够显著降低烟草根结线虫病的病情指数,其中酵素生物炭肥施用量为350 g·株^-1时,根结线虫病防治效果较好,防治效果达23.98%,且烟株农艺性状表现较好;根际土壤中过氧化氢酶、脲酶和磷酸酶活性较高,酚酸物质含量降低,化感自毒作用减弱。各处理土壤真菌数量均随生育期的推进呈先增高后降低趋势,其中酵素生物炭肥施用量为350 g·株^-1时,根际土壤中的细菌量随生育期推进逐步降低。各生育期土壤中均表现为真菌数量较高,细菌数量较低,真菌/细菌值较高,说明在烟草种植中,减量施肥10%同时拌塘施用酵素生物炭肥350 g·株^-1能提高土壤中真菌数量,降低土壤中细菌数量,显著提高土壤肥力及土壤酶活性,为生物炭肥对易感根结线虫病根际微生态调控提供了科学依据。     

烟草赤星病拮抗生防菌BS06-1的筛选

[目的]筛选对烟草赤星病具有明显拮抗作用的细菌。[方法]应用平板对峙培养法对从烟草根际分离到的细菌进行烟草赤星病拮抗性鉴定,对其中对烟草赤星病菌拮抗性较高的一株细菌利用细菌16S rRNA通用鉴定引物进行PCR扩增、测序和田间抗病性试验。[结果]共从烟草根际分离120份细菌,有6份对烟草赤星病病原菌具有一定拮抗作用,其中1份细菌拮抗作用明显,定名为BS06-1。将该细菌的16S rRNA测序结果登录NCBI网站进行Blastn序列比对,结果表明该菌株与枯草芽孢杆菌BSD-2同源性达到96%,与枯草芽孢杆菌BCRC 14718同源性达到95%,证明该菌属于枯草芽孢杆菌。田间试验证明该菌株BS06-1对烟草赤星病具有显著的抑菌效果。[结论]BS06-1细菌对烟草赤星病具有明显拮抗作用。     

烟草青枯病拮抗菌TBWR1的筛选鉴定及防病促生能力

【目的】分离对烟草青枯病菌具有拮抗作用的细菌并对菌株进行分类、鉴定,以丰富烟草青枯病生防菌菌种资源。【方法】从健康烟株根际土壤中筛选拮抗菌株,测定其形态、生理生化特征及16S rDNA序列等,并对菌株进行分类鉴定,通过盆栽试验验证拮抗菌对烟草青枯病菌的拮抗活性及其对烟株的促生作用。【结果】在烟株根际土壤中分离获得1株对烟草青枯病有明显抑制作用的菌株TBWR1,序列基因登录号为EF562603,菌株TBWR1与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis KC849252和Bacillus subtilis MN062963在同一分支上且同源性达85%,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);该菌株对烟草青枯病的生防效果达71.1%,并能显著促进烟草株高、叶长、茎围生长和根系生物量增加。【结论】枯草芽孢杆菌TBWR1可作为烟草病害生物防治的候选菌株,在烟草青枯病防治中具有潜在价值。     

大蒜秸秆对烟草根结线虫病及根际土壤理化性状的影响

以烤烟红花大金元为材料,研究大蒜秸秆无菌化还田对烟草根结线虫病及根际土壤的影响。结果表明,T₃(烟株移栽前,大蒜秸秆一次性施入大田4 500 kg/hm²),根结线虫防治效果较好。各处理土壤养分含量均随生育期推进呈先增加后降低趋势。不同生育期,T₃(烟株移栽前,大蒜秸秆一次性施入大田4 500 kg/hm²)过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶和蛋白酶活性均显著高于其他处理。不同处理土壤酚酸物质含量随生育期推进逐步增加,表现出富集效应,对照处理最为显著。T₃(烟株移栽前,大蒜秸秆一次性施入大田4 500 kg/hm²)能有效降低烤烟根际土壤中酚酸物质含量,减少土壤化感自毒作用。在各生育期,T₃(烟株移栽前,大蒜秸秆一次性施入大田4 500 kg/hm²)根际土壤中真菌数量均较高,细菌数量较低,真菌/细菌较高,这说明烟株移栽前,一次性施入大蒜秸秆4 500 kg/hm²能提高土壤中真菌数量,降低土壤中细菌...     

烟草复合微生物菌剂的构建及其促生抗病效应

植物根际功能菌是微生物肥料的重要菌种资源,在农业生产中发挥重要的作用。利用稀释涂布法对采集自贵州省遵义市发病烟区的健康烟株根际土壤进行根际细菌的分离纯化,研究根际细菌解磷、分泌吲哚乙酸、抗烟草青枯病菌的能力以及功能菌株间的拮抗作用,构建复合微生物菌剂,并对该菌剂的促生抗病效果开展评价。结果表明,烟草根际细菌LSNSY15-4对烟草具有最佳的促生效果,处理的烟草株高、根长和鲜重相对于对照组增幅分别为22.45%、35.57%和155.72%;烟草根际细菌D对烟草青枯病菌具有较好的拮抗效果,抑菌圈直径为21.40 mm,分子鉴定结果表明促生菌株LSNSY15-4为泛菌属(Pantoea)微生物,拮抗菌D为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis);随后,在明确D和LSNSY15-4具有亲和性的基础上,将菌株D和LSNSY15-4体积比1:1混合培养24 h,获得复合微生物菌剂,发现该菌剂可促进烟草植株生长,处理的烟草株高、叶片数和鲜重相对于空白对照组增幅分别为10.21%、32.26%和54.67%,且对烟草青枯病菌抑菌活性具有增效作用,有效地防控烟草青枯病的发病程度。该研究...     

1株烟草赤星病拮抗芽孢杆菌的鉴定与活性研究

【目的】筛选对烟草赤星病具有拮抗作用的芽孢杆菌并进行鉴定,同时研究其抗菌作用。【方法】从陕西、云南、湖北和河南4省烟区采集烟草根际土壤和烟叶,从中分离筛选烟草赤星病拮抗芽孢杆菌,并对拮抗性最强的1株芽孢杆菌进行形态学、生理生化特性、16S rDNA序列鉴定及粗提物抑菌作用测定。【结果】从烟草表面及根际土壤分离得到的芽孢杆菌中有10株对烟草赤星病有拮抗效果,将其中效果最好的1株芽孢杆菌定名为M-07C2F,其抑菌条带宽度达14.2 mm;通过16S rDNA测序并结合其形态和生理生化特征,鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。通过显微观察发现,M-07C2F菌株使烟草赤星病病原真菌的菌丝生长出现畸形,菌丝体内部细胞原生质体分布不均匀,部分菌丝内原生质有流出形成空壳的现象。在离体条件下采用生长速率法,测得其对烟草赤星病菌丝生长有抑制作用,EC₅₀为12.82 mg/L;在活体条件下采用田间小区试验,测得当M-07C2F菌株粗提物质量浓度为80 mg/L时,其对烟草赤星病的防治效果达到86.0%。【结论】菌株M-07C2F对烟草赤星病菌的抑菌作用明显,该菌株通过抑制烟草赤星病菌菌丝生长、减少孢子萌发来抑制病菌对植株的侵染,且菌株粗提物质量浓度越高,抑菌能力越强。     

抗烟草黑胫病菌生防细菌筛选、鉴定及体外拮抗机理初探

【目的】从云南烟草黑胫病高发区烟草根际土壤分离对烟草黑胫病菌具有高效拮抗作用的菌株,明确拮抗菌株的分类地位,并进行体外拮抗机理初探,为烟草黑胫病的防治提供生防资源和参考依据。【方法】采用平板对峙法从烟草根际土壤中分离对烟草黑胫病菌具有拮抗作用的菌株,通过生理生化特性及16S rDNA序列分析对具有较强拮抗活性的菌株进行鉴定,并测定生防细菌在体外对烟草疫霉的生物防治活性及作用方式。【结果】从采集的烟草根际土壤样品中共分离出6株对烟草疫霉具有拮抗活性的细菌菌株,其中菌株CD-1表现出最强的拮抗活性,其抑菌带宽度达10.12 mm;根据生理生化特性和16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。菌株CD-1具有广谱抗真菌特性,其胞内和胞外均存在抗真菌物质,其中使用二氯甲烷作为细菌发酵液萃取剂所提取的抗真菌物质的抑制效果最好;在p H 6～8、温度40～80℃时表现出相对稳定的抑制活性;菌株CD-1在NB培养基中培养的上清液提取物和细胞提取物对烟草疫霉均表现出较强的抑制活性,其抑制率分别达76.91%和67.23%;菌株CD-1分泌的抗真...     

枯草芽孢杆菌B2-GFP菌株的构建及其在土壤中的定殖

采用质粒消除与热激法构建枯草芽孢杆菌工程菌株B2-GFP,并测定其生长曲线、稳定性及对烟草疫霉的抑制率;同时,采用灌根和稀释平板法测定该菌株在烟株土壤中的活菌数.结果表明：工程菌株B2-GFP较野生型菌株B2提前1 h进入指数增长期,在培养11 h后同时进入稳定生长期;B2-GFP与烟草疫霉对峙培养后抑菌率达48.30%;在不含卡那霉素的LB固体培养基中继代培养10代后,在荧光显微镜下,菌落及菌体仍具有较强绿色荧光.烟株根际土壤活菌数大于根围土壤活菌数,且均呈现先升后降再趋于稳定的规律.在灭菌土壤中接种工程菌株B2-GFP第14天,烟株根际土壤活菌数达1.61×10⁷ CFU·g^-1;在自然土壤中接种该菌第42天,烟株根际土壤活菌数达1.46×10⁷ CFU·g^-1;接种第70天仍能保持绿色荧光表型.本研究证实工程菌株B2-GFP在烟田土壤中能够定殖并保持其特性.     

生物羊粪对烟株农艺性状及其根际土壤微生物与酶活性的影响

为明确生物羊粪对烟株农艺性状及其根际土壤微生物数量和酶活性的影响,在团棵期、旺长期和采收期分别测定了烟草的农艺性状,并采集烟株根际土壤,以稀释涂布平板法检测土壤样品中微生物数量,并测定了土壤的脲酶、磷酸酶、过氧化氢酶、蔗糖酶的活性。结果表明,每公顷烟田施用生物羊粪3000 kg、一体肥300 kg、硫酸钾150 kg、硝酸钾60 kg,在烟株旺长期,烤烟的平均株高、茎围、叶片数与叶面积分别比对照增加了18.03%、3.46%、4.07%与2.45%;根际土壤中微生物菌落总量分别比对照增加了46.92×10⁵ CFU/g;细菌与放线菌菌落数分别比对照增加46.11×105 CFU/g;细菌与放线菌菌落数分别比对照增加46.11×10⁵、2.22×105、2.22×10⁵ CFU/g;脲酶、磷酸酶与过氧化氢酶分别比对照增加了12.45%、11.04%与3.95%;蔗糖酶较CK减少了3.31%。由此可知,施用生物羊粪,可增加烟株根际微生物数量,提高土壤酶活性,进而促进烟株的生长发育。     

烟草赤星病生防芽孢杆菌的筛选鉴定及其生长条件研究

为获得对烟草赤星病有效的生防菌,通过平板对峙培养法和双层平板打孔法从贵州省瓮安县植烟土壤中筛选对烟草赤星病菌有较强拮抗作用的细菌;通过菌株形态、生理生化特征,结合16S r DNA及gyrA联合基因序列分析对筛选出的菌株进行鉴定;采用单因素试验对生防菌株的生长条件进行初步研究。结果表明,筛选出对赤星病菌有较强拮抗作用的生防菌株F11,其无菌发酵上清液对病原菌生长的抑菌带可达23. 5 mm,根据菌株形态、生理生化特性、16S r DNA及gyrA联合基因序列分析,将生防菌F11鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。该菌株在10～45℃、pH值3. 5～10. 0条件下均能生长,对碳源、氮源利用较广泛,最适生长条件为:培养时间18 h,温度35℃,pH值6. 0,葡萄糖作为碳源,蛋白胨作为氮源。菌株F11对烟草赤星病菌抑菌作用较强,具有应用于该病害生物防治的潜力。     

烟草青枯病病株根际土壤可培养细菌多样性特征分析

【目的】解析保山植烟土壤罹患烟草青枯病病株根际土壤可培养细菌种群多样性特征,揭示烟草青枯病害发生与根际可培养微生物种群间的关系,为利用微生物功能多样性防控烟草青枯病提供理论支撑。【方法】采集隆阳区和施甸县10个乡(镇)、30个村的30份患病烟株根际土壤样品和30份健康烟株根际土壤样品,利用稀释涂布平板法获得可培养细菌种群,基于Illumina MiSeq高通量测序结果,分析健康烟株和患病烟株根际土壤可培养细菌种群结构组成和多样性的差异。【结果】健康烟株和患病烟株根际土壤可培养细菌的OTU数量和α多样性指数间差异不显著。与健康烟株相比,在门分类水平上,患病烟株根际Proteobacteria和Bacteroidetes的相对丰度提高,Firmicutes和Actinobacteria的相对丰度降低;在纲分类水平上,γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和拟杆菌纲(Bacteroidia)的相对丰度提高;杆菌纲(Bacilli)和放线菌纲(Actinobacteria)的相对丰度降低;在属分类水平上,假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacte...     

烟草根际与非根际细菌的系统发育多样性研究

运用纯培养法和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析对烟草根际与非根际土壤中可培养细菌多样性进行了研究。用NA、1/10NA、R2A、1/10R2A培养基分别从烟草根际与非根际土壤中分离了17株与28株细菌。16S rRNA序列分析结果表明,17株根际细菌可分为5个属6个种,7株属于厚壁菌门(Firmicutes,41.18%),4株属于变形菌门α-变形菌纲(Alphaproteobacteria,23.53%),4株属于放线菌门(Actinobacteria,23.53%),2株属于变形菌门β-变形菌纲(Betaproteobacteria,11.76%);28株非根际细菌可分为9个属17个种,15株属于厚壁菌门(Firmicutes,53.57%),6株属于放线菌门(Actinobacteria,21.43%),4株属于变形菌门β-变形菌纲(Betaproteobacteria,14.29%),2株属于变形菌门α-变形菌纲(Alphaproteobacteria,7.14%),1株属于拟杆菌门(Bacteroidetes phy.nov.,3.57%)。芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属。1株细菌可能为新种或属。研究表明烟草根际与非根际土壤中含有较为丰富的微生物资源。     

烟草炭疽病拮抗菌分离及其发酵条件优化

为获得烟草炭疽病拮抗菌及其最适发酵条件,对烟草根际土壤和根茎叶中细菌进行分离,结合平板对峙法及液体发酵法筛选烟草炭疽病拮抗菌并鉴定,采用液体摇瓶发酵单因素试验和基于Box-Behnken设计的响应面法优化菌株发酵条件。结果表明:烟株根际土壤和根茎叶中共分离出31株对烟草炭疽病有拮抗作用的菌株,其中抑菌率>30%的菌株10株,抑菌率最高的菌株为C-4,抑菌率达72.14%,经16S rRNA序列分析初步鉴定其来自芽孢杆菌属。响应面法优化的Bacillus C-4最适发酵条件为接种量4%,初始pH 7.1,培养温度25.5℃,装液量84.5 mL,摇床转速180 r/min,培养时间48 h;经验证,在最适条件下,发酵液OD₆₀₀值为1.859,为优化前的1.62倍,抑菌率提高了8.4%。该研究为防治烟草炭疽病微生物菌剂的研制提供了备选菌种资源,同时也证明了响应面法用于优化烟草病害拮抗菌发酵条件的可行性。     

烟草黑胫病拮抗芽孢杆菌的筛选及生防效果评价

为了防治烟草疫霉对烟草引起的病害,从不同烟田健康烟株根际土壤中筛选分离42株根际细菌,经平板对峙初筛、细菌发酵液115℃处理后复筛得到10株对烟草黑胫病病原菌(Phytophthora parasitica)具有较好抑制效果的芽孢杆菌。经分子生物学鉴定可将其分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)3类。选取枯草芽孢杆菌GJ1、解淀粉芽孢杆菌GJ7和贝莱斯芽孢杆菌GJ11对各类芽孢杆菌进行纤维素酶和蛋白酶分泌特性检测、烟草根际土壤、根和茎定殖能力检测以及田间试验,得出这3种芽孢杆菌均可分泌纤维素酶和蛋白酶,均能在烟草根际土壤、根和茎中定殖,在根际土壤中定殖能力为GJ1GJ7GJ11,在根和茎中定殖能力均为GJ7GJ1GJ11。GJ1、GJ7、GJ11对烟草黑胫病田间相对防治效果分别为33.33%、80.00%、28.60%,初步确定拮抗芽孢杆菌田间防治效果取决于其在烟草内定殖能力。     

高碳基土壤修复肥对连作烟田土壤改良及烤烟生长发育的影响

为解决烟区长期单一种植模式造成的土壤质量退化与减产问题,以中烟100为材料,在河南省驻马店大田设置高碳基土壤修复处理试验,通过对土壤微生物群落、土壤酶、土壤养分、烟草基因表达和生长发育的全面系统分析,评价施用高碳基肥改良土壤的效果。结果表明:施用高碳基土壤修复肥能够增加驻马店烟区土壤中根际土壤细菌数量,降低根际真菌数量,改善土壤微生物群落组成;提高土壤pH值,增加土壤转化酶、脲酶、磷酸酶的活性,促进土壤养分的转化,提高土壤水解性氮、有效钾、速效磷、有机质含量;增加根系养分吸收相关基因的表达,提高土壤养分利用效率,促进烟株生长发育;在所有处理中,常规施肥(减209.89 kg烟草专用肥/hm²)+高碳基土壤修复肥750 kg/hm2)+高碳基土壤修复肥750 kg/hm²+重茬抗病肥298.5 kg/hm2+重茬抗病肥298.5 kg/hm²处理的效果最佳,表现出协同效应     

豇豆健、病株根际微生态研究及拮抗菌的初步筛选

从豇豆煤霉病病区分离健株根际真菌菌株88个，优势菌群为青霉属和镰孢菌属，分别占84．7％和13．6％，病株根际分离菌株70个，优势菌群为青霉属和曲霉属,分别占74．2％和10％，键株根际分离出细菌菌株19株，其中杆菌17株，占89．5％，具荧光反应的9株，占47．4％；病株根际离出细菌菌株23株，其中杆菌16株，占68．2％。具荧光反应的6株，占26％，所分离的42个细菌菌株对青枯菌均无拮抗反应，对大白菜软腐病菌有拮抗作用的分别为5株和4株，分别占所测菌株的26．4％和17．4％，对瓜果腐霉病菌有拮抗作用的都为2株，分别占所测菌株的10．5％和8．7％。     

烟草黑胫病拮抗细菌菌群的筛选

从湖南烟区烟草黑胫病重发田块采集根际土壤样品共900份,经富集培养后筛选出195个对烟草黑胫病菌有拮抗效果的细菌菌群。菌群Miseq高通量测序结果表明:不动杆菌属(Acinetobacter)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)为拮抗细菌菌群共有的优势属。挑选5个抑菌效果较好菌群施入烟田土壤,B44R菌群对烟草黑胫病防效达51.56%。将这5个细菌菌群进行拮抗菌株分离筛选,获得的拮抗菌株分别属于芽孢杆菌属、不动杆菌属、寡养单胞菌属和克雷伯氏菌属。施入菌群后的土壤高通量测序结果显示这些拮抗细菌菌群可在土壤中定殖,其中不动杆菌属和芽孢杆菌属的种群数量显著增加。     

菌株YC-25的分离鉴别及其对烟草的促生作用

为获得优质根际促生细菌资源，采用平板分离技术对烟草根际土壤中的可培养细菌进行分离，通过平板拮抗试验筛选抑菌活性菌株，同时进行解磷、解钾、产吲哚乙酸（IAA）活性检测，采用盆栽试验验证菌株对烟草的促生效果，并对目标菌株进行了多相分类学鉴定。结果表明：从烟草根际土壤分离获得35株不同形态菌株，依次编号为YC-1至YC-35；平板拮抗试验筛选发现YC-25抑菌最广，同时对6种病原真菌具有较为显著的抑制作用，平均抑菌率达到48%；促生功能活性鉴别显示，YC-25还具有溶无机磷、解钾、分泌IAA和产纤维素酶能力；多相鉴定结果表明，菌株YC-25为不动杆菌属（Acinetobater）的一个种，暂命名为Acinetobater pittii YC-25；盆栽试验结果显示，YC-25处理下的烟草株高增加26.29%，茎围增加27.54%，最大叶面积增加17.26%，说明菌株YC-25对烟草的农艺性状促生效果良好，作为烟草专用微生物菌剂备选遗传资源开发前景广阔。     

烟草青枯病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及其抑菌活性初探

【目的】从不同烟区健康烟草的根际土壤样品中筛选对烟草青枯病具有较强拮抗作用的芽孢杆菌,为防治烟草青枯病提供生防资源。【方法】随机从福建龙岩、四川德昌、陕西汉中等地健康烟草根际土壤中采集30份土壤样品,采用平板稀释法从中分离芽孢杆菌,以烟草青枯病菌为靶标菌筛选拮抗芽孢杆菌,并通过培养特性、菌体形态、生理生化特征分析及16SrDNA序列分析,对筛选的拮抗芽孢杆菌菌株进行鉴定;采用温室盆栽试验,测定拮抗芽孢杆菌的促生作用、定殖能力和抑菌活性。【结果】从健康烟草根际土壤中分离得到1株抗烟草青枯病菌活性较好的菌株LW-4,经鉴定其为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。LW-4菌悬液对烟草青枯病菌的防治效果为70.37%,其可定殖于烟草根际土壤,具有良好的定殖能力。LW-4对烟草有明显的促生作用;用饱和度为25%的硫酸铵获得的LW-4抑菌物质对烟草青枯病菌的抑菌活性较高,抑菌圈直径达37.82mm。【结论】菌株LW-4在烟草青枯病防治中具有潜在的利用价值。