新疆双峰驼抗血清中重链抗体的分离鉴定

【目的】初步探讨新疆双峰驼Camelus bactrianus免疫系统中缺失轻链的重链抗体(heavy chain antibody,HCAb)是否具有常规抗体的基本抗原结合功能。【方法】采用本实验室构建的丹毒丝菌表面蛋白A原核表达载体pGEX4T-1-spaA-N,进行诱导表达,纯化获得重组抗原GST-SpaA-N,免疫双峰驼制备抗血清,经Protein A和Protein G亲和层析从抗血清中分离重链抗体及常规抗体,Western blotting鉴定重链抗体的抗原结合特性,间接ELISA比较重链抗体与传统抗体的抗原结合活性。【结果】经过Protein A/G纯化得到了IgG2。对各组分进行分析初步表明重链抗体约占血清IgG的60%—80%。采用GST-SpaA-N免疫双峰驼可以诱导高滴度的IgG2型重链抗体,在5次免疫后,骆驼抗spaA-N特异的重链抗体IgG2多抗血清的效价为1﹕51200。Western blotting结果显示分离的多克隆重链抗体可特异结合SpaA天然抗原,且ELISA分析结果表明重链抗体与常规抗体具有相同的抗原结合活性。【结论】首次从双峰驼抗血清中成功分离获得具有与常规抗体相同生物学功能的多克隆重链抗体,提示重链抗体可能在骆驼免疫防御中发挥重要作用。     

双峰驼血清IgG纯化及其抗血清制备

纯化双峰驼血清IgG并制备兔抗骆驼IgG抗血清,为制备针对特定蛋白的特异性纳米抗体储备材料,利用Protein G纯化双峰驼血清IgG,并用纯化的IgG免疫成年家兔后采用ELISA方法检测抗血清效价;采用间接ELISA方法,利用制备的抗血清检测PCV2 Cap蛋白免疫双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体水平,Western blot技术检测制备的抗血清与从噬菌体纳米抗体库中筛选到的针对不同蛋白的纳米抗体的反应性,以确定抗血清的适用性。结果显示,从双峰驼血清中纯化到骆驼IgG,SDS-PAGE分析显示纯化的骆驼IgG包括3条链,约50ku的传统重链IgG1,约43ku缺失CH1的重链IgG3和约30ku的传统轻链;3次免疫后兔抗骆驼IgG抗血清效价达1∶512 000;应用制备的抗血清检测PCV2 Cap蛋白免疫5次的双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体效价达1∶1 024 000;制备的抗血清可以与原核表达的针对不同病毒蛋白的纳米抗体反应;说明制备的兔抗骆驼IgG抗血清可用于免疫骆驼血清和表达的纳米抗体的检测。研究结果为目标蛋白免疫骆驼后抗体效价检测及纳米抗体文库构建提供关键材料。     

骆驼重链抗体特异性多抗的制备及鉴定

目的:骆驼血清中除了常规抗体Ig G1,还存在两种天然缺失轻链的重链抗体Ig G2和Ig G3,其具有分子量小、稳定性强等优点,但由于缺乏有效的检测手段,使其研究和应用受到了一定的限制,因此制备针对骆驼重链抗体的多抗将具有一定应用前景。方法:本实验中,我们从骆驼抗凝血中分离骆驼血浆,经过Protein G/A Resin柱子对骆驼3种亚型抗体进行了分离和纯化。利用纯化的骆驼Ig G2对家兔进行3次免疫制备了针对骆驼重链抗体的多克隆抗体,并对其活性进行了鉴定。结果:SDS-PAGE凝胶电泳检测结果显示我们成功分离到了骆驼各亚型抗体。间接ELISA测定多抗效价为1:4 096,再通过间接ELISA和Western-blot方法测定多抗的特异性,结果显示制备的多克隆抗体与牛Ig G以及骆驼Ig G1无交叉反应,而与Ig G3抗体具有交叉反应性。结论:实验结果显示我们成功制备了骆驼重链抗体特异性多克隆抗体,将对骆驼抗体资源的开发、利用及对骆驼疾病的检测和研究提供有力支持。     

纳米酶免疫层析试纸条法检测玉米褪绿斑驳病毒

【目的】建立纳米酶免疫层析试纸条(Nanozyme Immuno-chromatographic Strip Assay, NISA)检测玉米褪绿斑驳病毒方法。【方法】采用双抗夹心法,将纳米酶标记的鼠抗体IgG与McmV结合后,再与硝酸纤维素膜质控线上的鼠抗体结合,二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)滴加显色。【结果】采用研制的NISA和反转录PCR法(RT-PCR)对玉米褪绿斑驳病毒梯度稀释的研磨液进行检测,灵敏度分别为10^-7和10^-5;用其他4种病毒作对照进行特异性实验,无交叉反应;用该试纸条对供试样品进行检测,并以RT-PCR方法及基因测序方法对检测结果进行验证,三者检测结果一致。【结论】该试纸条检测McmV的灵敏度高、特异性强,可用于科研、农业生产单位和口岸机构对McmV的检测。     

骆驼血清中不同抗体亚型对除草剂麦草畏的性能研究

为构建麦草畏快速检测技术,本研究通过rProtein A/G Beads 4FF重力柱和rProtein G Beads 4FF重力柱对经免疫后的双峰驼体内3种亚型的IgG抗体进行分离纯化,得到常规抗体IgG1和天然缺失轻链的重链抗体IgG2和IgG3,并检测了3种不同抗体亚型对麦草畏的亲和性和特异性的差异。结果显示,IgG1、IgG2和IgG3的IC50值分别为0.11、0.10和0.19μg/mL,线性范围分别为0.002～5.47,0.012～2.97和0.013～2.98μg/mL。特异性检测试验结果显示,IgG1对麦草畏的结构类似物2,3,6-三氯苯甲酸具有一定的交叉反应,交叉反应率为52%,而IgG2和IgG3无交叉反应。IgG2和IgG3是获得高灵敏性和特异性纳米抗体的重要基础,本研究将为双峰驼体内麦草畏纳米抗体的筛选工作奠定了重要基础。     

兔出血症病毒VPg蛋白的原核表达及抗体制备

【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Western blot检测其特异性。【结果】构建了pET-30a/VPg原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,成功表达了VPg蛋白。用该蛋白免疫试验兔后,制备的多克隆抗体能与VPg蛋白特异性反应。【结论】成功表达了RHDV VPg蛋白,并制备了特异性良好的多克隆抗体。     

采用CDR3亲和力转移方法快速获得抗FSHR抗体

【目的】评价骆驼来源的纳米抗体c Ab BCII10作为非抗体亲和力转移骨架的潜能,采用亲和力转移的方法,将FSHR结合肽段移植到c Ab BCII10的抗原结合区以快速获得抗FSHR抗体。【方法】将FSHR结合肽FSH33-53编码序列,分别移植入纳米抗体c Ab BCII10的CDR1和CDR3区域中,命名为VHH-h FSH1和VHH-h FSH3。采用DNA合成方法获得VHH-h FSH1,VHH-h FSH3和c Ab BCII10的DNA编码序列,把这些DNA序列克隆到p ET22b载体上,将其转化到BL21(DE3)感受态细胞中。经过诱导和表达再用Ni离子亲和纯化获得纯的单域抗体。采取ELISA方法鉴定纯化的c Ab BCII10,VHH-h FSH1、VHH-h FSH3与FSHR的结合能力及特异性。【结果】通过框架移植获得的VHH-h FSH1,VHH-h FSH3和c Ab BCII10蛋白均在细菌胞间质可溶性表达。将FSHR结合肽FSH33-53移植到c Ab BCII10的CDR3获得的VHH-h FSH3具有特异结合FSHR活性。【结论】c Ab BCII10可以作为移植的框架,FSH和FSHR结合肽段移植到c Ab BCII10的CDR1和CDR3区可以获得亲和性较高的抗FSHR抗体。     

猪c-Myc蛋白多克隆抗体的制备

【目的】克隆猪c-Myc基因CDS序列并构建其原核表达载体，同时纯化c-Myc蛋白并以此为抗原制备多克隆抗体，为进一步研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Rep蛋白与宿主c-Myc蛋白之间的交互作用奠定基础。【方法】根据猪c-Myc全基因序列(GenBank No. NM＿001005154)设计引物，以反转录PCR方法扩增c-Myc基因CDS序列，经Nde I/Xho I双酶切后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+)；转化至Arctic-Express^TM大肠杆菌后诱导表达；表达产物经变性、复性和His-Band Ni+层析柱亲和纯化后免疫新西兰白兔。抗原亲和层析法纯化抗体后，用间接ELISA法测定其效价，用Western blot检测其特异性。【结果】经检测，克隆产生的猪c-Myc基因CDS序列长度为1 359 bp,c-Myc-His重组蛋白主要以包涵体形式出现，分子质量约为63 kDa，由此蛋白制备的多抗效价可以达到1∶1 093 500，并能特异性识别猪c-Myc蛋白和重组蛋白c-Myc-His。【结论】...     

黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳的制备及免疫佐剂效应研究

【目的】筛选制备W/O型黄芪多糖(APS)、紫锥菊提取物(EM)纳米乳佐剂的最佳配方,并考察该纳米乳佐剂的免疫效应。【方法】根据伪三元相图中纳米乳区面积的大小并结合肉眼观察,筛选制备黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳佐剂的配方,观测制剂的形态、粒径分布、pH、黏度及稳定性;以卵清白蛋白(OVA)为模式抗原,用含不同质量黄芪多糖与紫锥菊提取物的纳米乳佐剂免疫小鼠后,测定并比较血清OVA诱导特异性抗体水平的变化。【结果】制备黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳的配方中,Tween 80、Span 80、石蜡油、乙醇、水的体积比为3∶1∶1.5∶0.5∶1;所得纳米乳为淡黄色透明液体,透射电镜下呈圆球形,平均粒径45.2nm,pH 6.71,黏度4.60s,理化性质较稳定。用黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳和抗原同时免疫小鼠后,未见任何不良反应,且用黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳免疫的各试验组小鼠,其血清OVA特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平均显著高于OVA抗原对照组(P<0.05),而各试验组的IgG、IgG1和IgG2a抗体水平无显著差异;只有APS 200μg+EM 200μg+OVA抗原组和APS400μg+EM 200μg+OVA抗原组的IgG、IgG1和IgG2a抗体水平显著高于铝胶(Alum)+OVA抗原组(P<0.05),且以APS 400μg+EM 200μg+OVA抗原组的3种抗体水平最高。【结论】黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳佐剂制备方法简单,稳定性好,能显著增强机体抗体的产生能力,同时可以增强Th1和Th2的免疫应答反应,具有开发佐剂的应用价值。     

CD58抗体的制备及其检测方法的建立

【目的】建立CD58特异性抗体的制备方法,及检测CD58抗体的间接ELISA方法。【方法】用CD58混合弗氏佐剂和兔淋巴细胞吸附CD58的方法免疫家兔获取CD58的抗体,双向免疫扩散试验检测抗体特异性,间接ELISA检测抗体水平。【结果】两种方法都能够使动物机体产生免疫应答;双向免疫扩散试验证实,弗氏佐剂法获得2种抗体,淋巴细胞吸附法制备抗原可获得1种抗体;间接ELISA检测法CD58的最适包被浓度为10.0μg/mL,最佳封闭液为10 g/L明胶,辣根酶标记的羊抗兔IgG工作浓度为1∶2 000。【结论】兔淋巴细胞吸附法可制备针对CD58的单一抗体,间接ELISA检测方法可以用于CD58抗体水平的检测。     

牛冠状病毒核衣壳蛋白原核表达及鉴定

【目的】 诊断致犊牛腹泻冠状病毒。【方法】采集石河子、沙湾、奎屯等10个规模化奶牛场141份腹泻犊牛粪样,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行冠状病毒检测,PCR方法进行核酸复检。同时根据GenBank登录的牛冠状病毒 N基因序列,设计特异性引物,对Mebus分离株N基因进行扩增,克隆到PMD 19-T载体后,将测序正确的基因片段经EcoRI和HindIII双酶切后连接到PET-28a和PET-32a载体中,构建重组表达载体PET-28a-N和PET-32a-N,进行测序,亚克隆入BL21(DE₃)表达载体,用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。【结果】所采集141份腹泻犊牛粪便中,用ELISA检测阳性率70.21%;再用RT-PCR检测出阳性率为61.7%同时,克隆了牛冠状病毒N基因,片段大小为1 400 bp,双酶切鉴定目的条带正确,测序结果与标准序列的进行比对同源性达到98.22%,通过SDS-PAGE分析证实表达的重组蛋白PET-28a-N-DE₃相对分子质量为54KD;重组蛋白BCV-32a-N-DE₃相对分子质量为70KD,Western blot分析表明该重组蛋白BCV-32a-N-DE₃和BCV-28a-N-DE₃和可以与牛冠状病毒阳性血清发生特异性反应。【结论】犊牛冠状病毒是导致石河子、沙湾、奎屯等10个规模化奶牛场和部分肉牛场犊牛腹泻的主要病原;ELISA方法和RT-PCR方法结合应用检测犊牛冠状病毒效果具有参考意义。获得的牛冠状病毒N蛋白具有很好的免疫反应性,为牛冠状病毒诊断试剂研发奠定基础。     

几种不同巴旦木花粉生活力及柱头可授性比较分析

【目的】 研究巴旦木花粉生活力,比较分析柱头可授性,为巴旦木人工授粉及相关研究和巴旦木良种选育提供理论依据。【方法】 以6个国内外巴旦木品种为材料,采用I₂-KI染色法、离体萌发法法测定不同开花天数的巴旦木花粉活力的变化;用联苯胺-过氧化氢法测定巴旦木各品种的柱头可授性。【结果】 2种方法测定的花粉活力最大的为米星,最小的为麻壳;石头、尖嘴黄、鹰嘴的雌蕊在花开放后第2 d花柱长度达到最大且具有较强的可授性,米星、布特、麻壳的雌蕊在花开放第3 d花柱长度达到最大且具有较强的可授性。【结论】 采集花后第2 d的花粉对花后第2 d的石头、尖嘴黄、鹰嘴和第3 d的米星、布特、麻壳柱头进行人工授粉。     

石竹叶斑病病原鉴定

[目的]研究鉴定引起新疆石河子地区石竹叶斑病的病原,为石竹叶斑病的防治提供理论基础.[方法]采集典型石竹叶斑病发病叶片利用常规组织法分离和纯化,选取8个代表性菌株,采用菌丝块贴接法和喷雾法测定致病性;应用病菌形态学和rDNA-ITS区、组蛋白3和β-微管蛋白序列进行比对和分析,建立多基因联合系统发育树,确定病原菌的分类...     

棉秆腐熟过程中相关指标及可培养微生物数量的变化

【目的】 研究不同添加物配方对棉秸秆腐熟过程中相关指标和微生物数量的变化。【方法】 以棉秸秆为原料,设置不同的添加物配方,进行棉秸秆堆肥腐熟发酵。对其发酵相关指标(温度、pH、电导率、速效氮、磷、钾浓度)及主要微生物变化进行测定分析。【结果】 3种处理的温度、pH、电导率、速效氮磷钾的变化趋势基本相同,但相对含量不同,不同处理下的微生物数量也均不同。【结论】 处理3(基础配方+磷酸二氢钾2%)堆肥发酵效果最优,pH值为8.59~8.89,EC值为4 ms/cm左右,更适宜堆肥发酵。     

双斑长跗萤叶甲对13 种挥发物的触角电生理反应

【目的】研究双斑长跗萤叶甲对13 种挥发物的触角电生理反应,为筛选对双斑长跗萤叶甲成虫有活性的信息化合物。【方法】采用触角电位技术(EAG)测定双斑长跗萤叶甲雌、雄成虫对13种棉花、玉米和双斑长跗萤叶甲成虫粪便挥发物的触角电位反应。【结果】双斑长跗萤叶甲雌雄虫均对庚烯,橙花叔醇,水芹烯,β-蒎烯,反-2-己烯醛,反-2-己烯-1-醇,己二酸二辛酯,叶醇的EAG反应值相对较大,对壬酸、十九烷、十七烷反应不明显。雌虫对叶醇反应之最大,为2.306 mV;雄虫对β-蒎烯反应之最大,为2.309 mV。雌虫对十六烷,葎草烯的反应较雄虫更为敏感。【结论】在13种挥发物中,双斑长跗萤叶甲雌虫对叶醇反应最敏感,雄虫对β-蒎烯反应最敏感。     

外源MeJA对芜菁幼苗生长及抗氧化酶活性的影响

【目的】研究外源茉莉酸甲酯(MeJA)对芜菁幼苗形态指标及抗氧化酶活性的影响,为茉莉酸参与芜菁抗逆机理提供理论参考。【方法】以温州盘菜和卡玛古两个商业品种的芜菁作为材料,将萌发的芜菁种子培养于添加不同浓度MeJA的1/2MS培养基中,7 d后测定芜菁幼苗的生长指标、渗透调节物质含量、抗氧化酶活性等生理指标。【结果】随着MeJA浓度增加,芜菁幼苗长度及干、鲜重呈降低趋势,叶片中SOD活性先升高后降低,POD、CAT、APX活性逐渐增高,渗透调节物质可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量逐渐增高,MDA、H₂O₂和O₂·^-含量逐渐增高,叶绿素含量逐渐降低。【结论】施加外源MeJA增加了芜菁幼苗的抗氧化酶活性,降低了芜菁幼苗的生长指标,抑制了幼苗的生长。     

双斑长跗萤叶甲成虫对α-红没药醇等棉花和玉米挥发物的嗅觉行为反应

【目的】 筛选对双斑长跗萤叶甲Monolepta hieroglyphica (Motschulsky)成虫有引诱或趋避活性的植物挥发物。【方法】利用“Y”型嗅觉仪测定对双斑长跗萤叶甲有引诱或趋避作用的挥发物。【结果】10 μg/mL的α-红没药醇和α-蒎烯对双斑长跗萤叶甲雌雄成虫有明显的引诱作用,配方1、2、6对双斑长跗萤叶甲雄成虫有明显的引诱作用,配方2、6对双斑长跗萤叶甲雌成虫有明显的引诱作用。【结论】10 μg/mL的α-红没药醇和α-蒎烯对双斑长跗萤叶甲有明显的引诱趋性,可作为该叶甲的引诱剂成分。     

成龄枣树光合特性与光响应曲线模型

【目的】 不同灌溉定额条件下,研究红枣光合特性变化规律及适用于滴灌模式下红枣的光响应曲线模型,为红枣滴灌决策提供数据支撑和理论依据。【方法】 以新疆南疆阿克苏地区进行地表滴灌的6年生红枣树为研究对象,通过田间试验测定不同水分处理条件下的光合-光响应曲线。【结果】 6年生红枣在20、30 m³667 m²灌溉水量区间内,最大净光合速率呈递减趋势。拟合模型针对新疆南疆成龄枣树叶片适用性排序为直角双曲线修正模型＞非直角双曲线模型＞指数模型＞直角双曲线模型。通过对比分析4种不同模拟机制的模型。【结论】 在轻度水分胁迫条件下有利于提高净光合速率及水分利用效率;直角双曲线修正模型对于南疆成龄枣树叶片的适用性最好。