烟草质子泵互作蛋白NTPpi1基因的克隆及其生物信息学分析

为了能够更好地选育高钾烟草品种,本研究根据烟叶钾元素含量全基因组关联分析结果,克隆了烟草质子泵互作蛋白NTPpi1的基因序列。生物信息学分析发现,NTPpi1基因长度为1 834 bp,开放读码框为981 bp,编码的蛋白质序列由326个氨基酸组成;蛋白质分子量为145.3 kD,蛋白质等电点为5.00;通过在线软件TMHMM 2.0 Server预测发现,该蛋白存在一个跨膜的螺旋结构,且跨膜长度有23个氨基酸。氨基酸序列多序列比对分析结果显示,NTPpi1的氨基酸序列与其他植物Ppi1氨基酸序列的一致性为80.82%。通过NetPhos 3.1 Server软件对质子泵互作蛋白NTPpi1的磷酸化位点进行预测,发现有29个可以磷酸化的位点,其中第321位的Threonine磷酸化位点位于跨膜区域,推测这个位点可能是该蛋白与ATP酶质子泵相互作用的位点。以上结果的发现为高钾烟草品种的选育提供一定的理论支持。     

软枣猕猴桃饮料工艺的研究

以软枣猕猴桃为主要原料,添加适量糖、柠檬酸及其他辅料,研制出口感优良、风味独特的软枣猕猴桃饮料。试验结果显示,酶的添加量为0.08%,酶解时间为8h的出汁率最高。采用正交实验确定了饮料最佳配方,即果汁15%,糖12%,柠檬酸0.1%,稳定剂0.05%。     

木薯MeSAUR1互作蛋白的筛选及鉴定

木薯MeAGPS1a基因编码的小亚基是淀粉合成关键酶AGPase的催化中心,前期研究发现MeSAUR1转录因子可结合MeAGPS1a基因启动子并调控该基因表达。采用酵母双杂交技术筛选MeSAUR1转录因子的互作蛋白,可进一步解析MeAGPS1a基因表达的分子调控网络。本研究构建了MeSAUR1的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-MeSAUR1,采用酵母双杂交技术从木薯cDNA文库中筛选MeSAUR1的候选互作蛋白,结果共筛选出31个阳性克隆。通过酵母双杂交点对点实验验证了候选互作蛋白MePP2C与MeSAUR1的互作关系,本研究结果有助于揭示Me SAUR1蛋白调控木薯淀粉合成的互作网络。     

水稻抽穗期基因定位及其环境互作研究

为构建SSR分子标记技术构建其遗传图谱,利用由小穗小粒型品种‘密阳46’和大穗大粒型品种FJCD建立的一个包含130个家系F10的重组自交系群体,测定武夷山和莆田环境下水稻群体的抽穗期,并进行了QTL的定位及环境互作研究。结果表明,在武夷山环境下仅检测到一个与抽穗期相关的加性QTL,位于6号染色体上,解释了25.63%;1个位点存在显著的加性×环境互作效应,而GE互作效应对表型变异贡献几乎为0,表明控制水稻抽穗期基因的表达有显著的环境特异性。     

花生AhHDA1互作蛋白AhGLK的筛选及特性分析

通过酵母双杂交系统,以花生组蛋白去乙酰化酶AhHDA1为诱饵,对花生cDNA文库筛选并分析互作蛋白的生物学特性。结果获得一个AhHDA1互作蛋白Arachis hypogaea L.Golden 2-like(AhGLK);体外荧光双分子试验证实,AhHDA1与AhGLK蛋白存在相互作用;利用生物信息学软件分析表明,AhGLK含有MYB保守域,其氨基酸序列与大豆(Glyine soja)GsGLK、拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGLK分别具有较高同源性;AhGLK定位在细胞核中并具有转录因子活性,主要在花生的叶片中表达;在30%PEG条件下,AhGLK表达下调。     

赤霉素对东北软枣猕猴桃种子萌发的影响

为了找到有效打破软枣猕猴桃种子休眠、提高种子发芽率的方法,以软枣猕猴桃种子为材料,研究不同浓度赤霉素对软枣猕猴桃种子萌发的影响.结果表明,赤霉素处理可以有效地打破软枣猕猴桃种子体眠,对种子的发芽率、发芽势、发芽指数等有显著的促进作用,可使发芽率提高50％以上,也可缩短种子萌发时间,提前7～8 d萌发,提旱达到发芽高峰,发芽持续时间较长,提高发芽速度.不同浓度之间存在差异,以750 mg/L赤霉素浓度最为适宜.     

酵母双杂交系统筛选马铃薯StMAPKK1互作蛋白及其生物信息学分析

促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应是参与植物生长发育、激素及胁迫的响应信号通路中重要而复杂的信号网络之一.促分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAPKK)是其主要成员之一,是该级联反...     

槟榔黄叶病毒1外壳蛋白的互作蛋白筛选

为明确槟榔黄化病致病机理,探究槟榔黄叶病毒1 (areca palm leaf yellowing virus 1, APLYV 1)病毒与宿主蛋白之间相互作用的机制,本研究以槟榔叶片为材料,构建槟榔cDNA酵母双杂交文库,以APLYV 1的外壳蛋白(coat protein, CP)为诱饵,构建诱饵载体pGBKT7-CP,采用酵母双杂交技术,从槟榔cDNA文库中筛选与其互作的蛋白。结果表明,成功构建槟榔酵母文库,文库容量达1.1×10⁷以上,重组率为100%,插入片段平均长度>1 000 bp。成功构建诱饵载体pGBKT7-CP,通过自激活实验检验,阳性对照在四缺培养基平板上能正常长菌且显蓝,阴性对照和实验组在二缺培养基平板上能正常长菌,在三缺和四缺培养基平板上未长菌,表示构建成功的重组诱饵载体无自激活活性,可用于筛库实验。共筛选出13个阳性克隆,经NCBI网站与槟榔转录组库进行比对,最终得到10个候选槟榔蛋白,包含sHSP (small Heat Shock Protein)与DnaJ蛋白等。选择DnaJ蛋白,通过理化性质分析和蛋白二级结构预测,发现该槟...     

拟南芥LBD15互作蛋白的筛选和鉴定

为了进一步挖掘拟南芥LBD逆境胁迫响应基因在植物非生物逆境胁迫应答中的作用,探究拟南芥逆境胁迫响应机理,将前期筛选到的LBD15基因构建到pGBKT7酵母表达载体上,筛选与LBD15互作的蛋白。利用酵母双杂交技术筛选了拟南芥全长均一化的酵母文库,在本次筛库试验中,146个样有107个测出序列,通过NCBI Blast分析,其中有96个获得了基因号,占总数的87.9%。根据基因号进行分类,得到了48个蛋白,在筛选到的48个蛋白中有59%的蛋白都是有重复的。然后把基因号通过网站TAIR(www.arabidopsis.org/index.jsp)查找其蛋白序列,通过亚细胞定位预测网站(http://cello.life.nctu.edu.tw/)分析其亚细胞定位,定位分析结果表明,这些蛋白主要定位于叶绿体、细胞质和细胞核。利用Blast2GO进行Gene Ontology注释显示互作蛋白共参与了14个生物过程,包括细胞过程、代谢过程、刺激响应、生物过程的调控、单组织和多组织过程及发育进程调控等。对得到的可能互作蛋白随机挑选了5个进行了互作蛋白的分离和回复验证,结果发现,AP19蛋白及其他一些蛋白的菌落能够在营养缺陷型的平板上正常生长,进一步证实了其为互作蛋白。酵母双杂交文库的成功筛选为进一步研究拟南芥LBD15的分子作用机制奠定了基础。     

拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22互作蛋白的筛选与分析

前期研究中从拟南芥突变体库中筛选获得一株对灰霉病菌侵染表现为感病的突变体。利用TAIL-PCR等技术克隆获得拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22。为了进一步明确T1N6_22在拟南芥抗灰霉病过程中的调控机制,利用酵母双杂交技术(Y2H),以构建成功的p AS1/T1N6_22蛋白为诱饵,筛选拟南芥的cDNA文库。通过酵母双杂交筛选,共获得28个酵母克隆。利用T1N6_2基因特异性引物鉴定酵母阳性克隆,并进行测序。共获得了4个可能与T1N6_22互作的蛋白AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400。Blast分析发现,AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400分别为核小体装配蛋白、功能未知蛋白、假定的泛酸还原酶和硫胺二磷酸盐结合折叠超家族蛋白,分别参与到核糖体装配、泛酸盐合成、植物代谢等过程中。研究结果为确定T1N6_22蛋白的互作蛋白,阐明其调控拟南芥抗灰霉病的分子机制奠定了基础。     

木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选

Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上,筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明,该基因在叶片特异表达,受干旱、低温负调控,同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现,MeMYB60可以在保卫细胞表达,预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中,具有转录激活活性,其转录激活结构域在蛋白C端第194～343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1～194氨基酸残基片段为诱饵,从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白,酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。     

青稞酵母双杂文库的构建及HVUL0H33228.2互作蛋白的筛选

白粉病是青稞生产中危害最为严重的病害之一,会造成产量严重下降。本实验室前期筛选到一个白粉菌诱导后上调表达的NF-YB转录因子HVUL0H33228.2。为了进一步明确该基因的作用机制,本研究构建了青稞受白粉菌诱导的酵母双杂交cDNA文库,以HVUL0H33228.2为诱饵进行酵母双杂交筛选。结果表明：所获得的cDNA文库滴度为5.6×10⁸CFU/mL,插入片段长500～2 000 bp,重组率为94%,符合酵母双杂文库质量要求。利用酵母双杂交系统在该文库中筛选到6个与HVUL0H33228.2相互作用的蛋白,分别为铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶、核酮糖二磷酸羧化酶、叶绿素a/b结合蛋白2和6、光合系统Ⅱ反应中心蛋白CP43和醛缩酶型TIM桶家族蛋白。本研究为进一步揭示HVUL0H33228.2应答白粉菌侵染的分子机制提供了参考依据。     

水稻酵母双杂交文库构建及PID2胞内结构域互作蛋白的筛选

为了进一步挖掘水稻PID2胞内互作蛋白质,阐明Pid2介导的稻瘟病抗性机制。本研究利用SMART技术,构建了受稻瘟病诱导后不同时间段的含抗性基因Pid2水稻材料的cDNA文库;通过PCR扩增获得PID2胞内结构域编码片段Pid2-JM,构建了诱饵表达载体pGBK-Pid2-JM,并进一步利用酵母双杂交技术筛选Pid2-JM的互作蛋白。结果表明,构建的cDNA酵母文库细胞密度为9.0×10⁷Cells/mL,文库插入片段在500～2 000 bp之间,重组率为100%,诱饵载体无自激活活性;利用诱饵载体经筛选文库后,新发现一个能与Pid2-JM互作的U-box类E3泛素连接酶PBP1,经回转试验验证了PBP1与Pid2-JM可在烟草细胞内互作。综上,本研究成功构建了稻瘟病诱导下的水稻酵母双杂交文库,并筛选到一个能与PID2胞内结构域互作的U-box类E3泛素连接酶,该结果为进一步揭示水稻抗稻瘟病信号转导机制提供参考。     

软枣猕猴桃酵素可吸果冻加工工艺研究

以软枣猕猴桃为原料,经发酵、调配制作软枣猕猴桃酵素可吸果冻,在单因素试验基础上,采用正交试验对工艺进行优化,通过感官品质评价确定软枣猕猴桃酵素果冻配方,通过测定总酚、类黄酮和VC指标,对本产品与市售猕猴桃可吸果冻、果汁的营养物质含量进行比较。结果表明,软枣猕猴桃酵素果冻的最佳工艺配方为:软枣猕猴桃酵素添加量35%,白砂糖添加量5%,柠檬酸添加量0.06%,卡拉胶添加量0.8%。由该配方制作的可吸果冻入口细腻、酸甜适口,具有软枣猕猴桃独特果香,且营养物质(总酚、类黄酮、VC)含量均显著高于市售产品。综上所述,该产品是一款风味独特、具有保健功能、有广阔发展前景的新型可吸果冻。     

微生物效应蛋白在植物-微生物互作中作用的研究进展

微生物效应蛋白在植物与微生物的相互作用过程中发挥种间的信息交流功能,起到重要的桥梁作用。它通过抑制植物受体诱导的免疫、调控植物基因转录、酶激活或抑制等方式为微生物侵染植物提供便利。不同类型微生物效应蛋白发挥的功能不同,作用方式和分子机制也不尽相同,且研究状况存在一定的差异,本研究通过回顾近些年来微生物效应蛋白的研究结果,对其在细菌、真菌、卵菌等病原菌及有益共生菌侵染宿主过程中的作用和分子机制进行总结,为植物-微生物相互作用机制深入研究提供相关理论依据。     

西瓜减数分裂相关基因ClSPO11-1的互作蛋白筛选

减数分裂是有性生殖的关键过程.Ⅱ型拓扑异构酶SPO11是在植物减数分裂过程中起重要作用的一类酶,然而,该类酶在减数分裂过程中的具体分子作用机制目前尚有待鉴定.本研究以西瓜花蕾cDNA为模板,首次克隆获得西瓜拓扑异构酶基因ClSPO11-1的CDS全长1 095 bp,编码394个氨基酸.为了进一步研究ClSPO11-1...     

水稻胞质不育相关蛋白ORF290及互作蛋白对酵母生长的影响

orf290是本实验室从红莲型水稻细胞质雄性不育品种‘粤泰A’(YTA)中克隆的一个与雄性不育相关的线粒体基因,前期通过膜蛋白酵母双杂交获得了2个与ORF290互作的蛋白APX8和E37。为探讨ORF290与APX8和E37发生相互作用时对酿酒酵母NMY51生长的影响,本实验利用膜蛋白酵母双杂交DUAL membrane系统,分别将诱饵蛋白和互作蛋白基因构建到pBT3-SUC-和pPR3-N-载体上,获得pBT3-SUC-orf290、pPR3-N-APX8和p PR3-N-E37质粒,然后分别单转和共转(pBT3-SUC-orf290与pPR3-N-APX8, pBT3-SUCorf290与pPR3-N-E37)酵母NMY51菌株。在RNA和蛋白水平分别证实相关基因在转化酵母中高效表达,并且相关蛋白以膜蛋白的形式存在。含不同质粒酵母生长曲线测定结果表明,宿主菌NMY51、单独转化pBT3-SUC-orf290、p PR3-N-APX8和pPR3-N-E37的NMY51酵母生长曲线相近,体内ATP含量无明显差异,而共表达ORF290与APX8或E37的酵母菌株的生长明显低于对照组,AT...