蔗茅EfNAC44基因克隆与表达分析

为了克隆蔗茅EfNAC44基因,并对其进行生物信息学和基因表达模式分析.本研究通过转录组测序和RT-PCR方法相结合首次从蔗茅野生种无性系'蔗茅99-3'中克隆到一个受低温胁迫响应的NAC家族基因,命名为EfNAC44 (GenBank登录号:MH709118.1),该基因包含一个591个碱基的开放阅读框,编码196个...     

甘蔗野生种质资源抗褐锈病基因Bru1的分子检测

在甘蔗栽培品种‘R570’上发现和定位的甘蔗抗褐锈病主效基因Bru1对世界上不同国家和不同地区的黑顶柄锈菌具有广谱抗性。针对该基因开发的两个分子标记能有效、稳定地检测和筛选含有该基因的种质资源。为筛选甘蔗野生种抗源种质,利用R12H16和9O20-F4两个标记对云南农业大学甘蔗种质资源圃保存的部分野生种质资源进行抗褐锈病基因Bru1的分子检测,包括割手密96份、蔗茅15份、滇蔗茅1份、斑茅11份、河八王4份、金茅2份、五节芒9份,共计138份。结果表明,有7份割手密含抗褐锈病基因Bru1,占参试材料的5.1%。本研究为甘蔗的转基因育种和抗褐锈病杂交育种提供优良抗源材料,为进一步开展甘蔗育种研究提供了科学依据。     

甘蔗与蔗茅杂交亲本及后代材料的抗旱性鉴定

研究旨在筛选出优良抗旱育种材料,为今后甘蔗抗旱育种和抗旱栽培技术提供重要的理论依据。采用盆栽干旱处理,测定蔗茅野生种无性系、甘蔗栽培品种（系）及其杂交后代共12份材料苗期与抗旱相关的8项生理生化指标,利用极点排序法对供试材料的抗旱性进行了综合评价。结果表明：干旱胁迫下,12份供试材料的Pro、MDA、SS及PMP均呈上升趋势,SP、Chl和SOD活性呈下降趋势,CAT活性有升有降。极点排序法分析表明,12个供试材料的抗旱强弱为：‘蔗茅99-2’>‘蔗茅99-1’>‘蔗茅99-4’>‘蔗茅I91-8’>‘蔗茅99-3’>‘蔗茅90-29’>‘滇蔗01-58’>‘滇蔗04-14’>‘滇蔗02-39’>‘蔗茅II91-2’>‘新台糖10’>‘崖城89-9’,说明蔗茅优质抗旱性状可以通过基因渗透方式传递给后代。在苗期干旱胁迫下,‘蔗茅99-2’在渗透调节等方面表现出积极的生理响应。     

甘蔗与滇蔗茅杂交后代F_1、BC_1表型和GISH分析

滇蔗茅是甘蔗重要的近缘植物资源,在甘蔗种质创新和遗传改良中具有重要利用价值。为了鉴定甘蔗与滇蔗茅远缘杂交F_1、BC_1真实性后代种质并探明其遗传物质组成,本研究对远缘杂交组合亲本和后代材料进行了形态学观察、染色体计数、核型分析和染色体荧光原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)分析。结果:(1)表型鉴定结果显示,F1叶片具父本滇蔗茅特征,BC1后代叶片则趋于甘蔗品种。BC1的节间长度和株高表现出一定的杂种优势,茎径和锤度则逐渐趋于甘蔗品种(ROC10);(2)细胞学鉴定结果显示:父本云南95-20 2n=30,核型属2B类型。F1云野03-316 2n=54,属2B类型;3个BC1后代材料2n均为110,其中云野06-278属2B类型,云野06-277和云野06-279属2C类型。(3)GISH结果:在F1和3个BC1材料中均检测到15条滇蔗茅野生种外源染色体,但没有检测到重组染色体。以上结果表明F1和BC1是真实的杂交后代种质,杂交过程染色体遗传方式分别为n+n和2n+n。本研究可为滇蔗茅有利基因向甘蔗转移提供细胞学证据,为滇蔗茅在甘蔗杂交创新中利用方式的制定提供参考。     

甘蔗细茎野生种ScNAC1基因的克隆与功能分析

本研究根据转录组信息从甘蔗细茎野生种(Saccharum Spontaneum)中克隆得到一个抗旱相关的NAC家族基因,命名为Sc NAC1(NCBI accession KP742345)。研究结果显示:该基因包含一个1 212个碱基的开放阅读框,编码403个氨基酸;通过序列比对发现该基因在N端具有保守的NAC结构域,进化树分析显示Sc NAC1属于NAC家族基因的NAP亚家族;通过将Sc NAC1-GFP融合载体转化拟南芥原生质体中,证明Sc NAC1定位于细胞核内;定量PCR检测在甘蔗细茎野生种发育不同时期Sc NAC1对于干旱的响应,发现Sc NAC1在各个时期都受干旱诱导。研究结果可为进一步研究甘蔗干旱响应机理提供参考。     

甘蔗野生种蔗茅的形态多样性分析

蔗茅(Erianthusfulvus)是甘蔗育种中极为重要的野生种质资源,研究其形态性状的遗传多样性对选育抗旱、抗寒、耐贫瘠、高蔗糖分含量的甘蔗新品种极为重要。为深入研究利用蔗茅野生资源,以保育在云南农业大学甘蔗研究所甘蔗种质资源圃的48份蔗茅无性系为试验材料,进行包括株高、叶宽、节间长度、茎径、锤度的田间调查和统计分析。结果表明,48份蔗茅材料在所调查性状上具有显著差异,变异系数介于9.37%~33.52%之间;基于5个性状的聚类分析将所分析材料分为了3类以及很多小类群,表明所研究蔗茅资源具有丰富的遗传多样性。研究结果对蔗茅资源在甘蔗育种中的利用具有重要参考价值。     

斑茅铜锌超氧化物歧化酶基因(SaSOD-1)的克隆与序列分析

斑茅是甘蔗近缘野生种之一,具有较强的抗逆性,研究并开发利用斑茅的强抗逆基因,对甘蔗育种具有重要意义。本研究以高粱Cu/Zn-SOD(登录号:XM 002445626.1)cDNA序列为探针,对甘蔗属EST数据库进行检索、比对、拼接,通过设计特异引物,PCR扩增和序列分析验证,克隆得到2个Cu/Zn-SOD(SaSOD-1a和SaSOD-1b,登录号:KJ001795和KJ001796)基因全序列,其中SaSOD-1a基因组序列全长2 473 bp,SaSOD-1b基因组序列全长2 228 bp,均有8个外显子,7个内含子,其cDNA序列长度均为692 bp,编码206个氨基酸。序列比较分析表明,SaSOD-1a和SaSOD-1b序列相似性为98.6%,有8个单核苷酸多态性位点,蛋白质相似性为99.0%,2个氨基酸变异位点。用推导出的氨基酸序列与其它植物做同源进化分析,与高粱、玉米、谷子等比较均表现出较高的保守性。研究结果可为进一步了解超氧化物歧化酶与斑茅耐旱性的关系奠定基础。     

7个蔗茅野生种及其后代材料苗期耐寒性鉴定

以7个蔗茅野生种及其与甘蔗杂交的3个后代材料[滇蔗品种(系)]为试验材料,在苗期进行低温(3℃)胁迫,测定与耐寒性相关的各项生理生化指标。结果表明:(1)通过极点排序法计算得到电导率,可溶性糖、丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白、叶绿素含量,超氧化物歧化酶活性的权重系数分别为0.109、0.194、0.148、0.133、0.108、0.183、0.124,其中可溶性糖与叶绿素含量的权重系数最大,说明这两项生理指标对甘蔗耐寒性影响较大;(2)在低温(3℃)胁迫下,10个供试材料的耐寒性强弱为蔗茅99-3>蔗茅99-2>蔗茅Ⅱ91-2>蔗茅99-4>蔗茅99-1>蔗茅90-29>蔗茅Ⅰ91-8>滇蔗04-14>滇蔗01-58>滇蔗02-39,表明蔗茅野生种的耐寒性均强于滇蔗品种(系)。     

甘蔗和斑茅Ⅲ型过氧化物酶基因（SoPOD-1和SaPOD-1）cDNA克隆与分析

研究旨在通过克隆甘蔗和斑茅Ⅲ型过氧化物酶基因(Prxs),分析比较2个物种Prxs基因差异,探讨2个物种Prxs功能差异的遗传基础。采用同源克隆方法,以高粱Prxs基因序列为探针,克隆获得甘蔗和斑茅Prxs基因。本研究从斑茅和甘蔗中成功克隆获得了4个Prxs基因cDNA序列,其中斑茅2个基因长度均为1083 bp,存在一个差异位点,甘蔗2个基因长度均为1084 bp,存在11个碱基差异。4个基因开放阅读框均为996 bp,编码331个氨基酸。蛋白质保守结构域分析表明,克隆获得的4个基因均具有Prxs典型保守结构域,为目标基因。系统进化分析表明,克隆获得的基因与高粱、玉米和水稻的同源基因相似性最高,在一些双子叶植物,甚至裸子植物也能找到其同源基因,且氨基酸序列的相似程度与物种分化的程度基本一致,可供植物分类作参考。该试验从斑茅和甘蔗中成功克隆获得了4个Prxs基因cDNA序列,为深入研究Prxs基因在不同植物中功能差异提供了一定的参考。     

气象因素对甘蔗生产的影响及环境互作基因研究进展

甘蔗产量与蔗区的自然条件、生产条件、耕作制度、栽培管理技术措施和品种特性有密切关系,而与气象因素也息息相关。降雨量对甘蔗伸长期,成熟期有关键影响,与产量有正相关关系,挖掘利用不同作物的抗旱基因,可以提高甘蔗抗旱能力。大气相对湿度、温度、光照是影响甘蔗伸长、糖分累积和单产的重要因素。甘蔗的产量和含糖量受干旱、台风、洪涝灾害、低温高湿等气候因子的影响。本研究通过分析蔗区降水量、湿度、日照等气象因素对甘蔗产量的影响,结合甘蔗抗逆基因的研究进展,提出发展分子标记用于辅助选择甘蔗育种,研究不同灾害性天气对甘蔗产量性状之间的影响,对于甘蔗的生产有着指导性意义和巨大的经济意义。     

蔗茅(Erianthus fulvus)的特异性状及其与甘蔗杂交F1代的染色体和RAPD鉴定研究

本文以我们的前期研究为基础,综述蔗茅(Erianthus fulvus)野生种的一些特异性状及其在甘蔗育种中的利用价值.对蔗茅花粉进行低温贮存,克服其与甘蔗花期不遇的障碍,获得两个杂交组合共310株实生苗.采用染色体计数和RAPD分子标记的方法鉴定杂种F1代真实性.结果表明,供试材料杂种01/47、01/85、01/120的2n＝79-82,染色体遗传方式为"n+2n";用110个随机引物进行RAPD扩增,63个引物可获得双亲的RAPD多态性,其中3个引物(OPC-19、OPE-2、OPF-4)可在杂种01/64和01/120的 RAPD扩增标记中显示出双亲的特征谱带,分别为父本3500bp和母本1300bp、父本1350bp和母本900bp、父本550bp和母本900bp.本研究探索杂种实生苗早期鉴定的可行之法,为分子标记辅助选择(MAS)、缩短甘蔗育种年限奠定工作基础.     

蔗茅(Erianthus fulvus)的特异性状及其与甘蔗杂交F1代的染色体和RAPD鉴定研究

本文以我们的前期研究为基础,综述蔗茅(Erianthus fulvus)野生种的一些特异性状及其在甘蔗育种中的利用价值.对蔗茅花粉进行低温贮存,克服其与甘蔗花期不遇的障碍,获得两个杂交组合共310株实生苗.采用染色体计数和RAPD分子标记的方法鉴定杂种F1代真实性.结果表明,供试材料杂种01/47、01/85、01/120的2n＝79-82,染色体遗传方式为“n 2n“;用110个随机引物进行RAPD扩增,63个引物可获得双亲的RAPD多态性,其中3个引物(OPC-19、OPE-2、OPF-4)可在杂种01/64和01/120的 RAPD扩增标记中显示出双亲的特征谱带,分别为父本3500bp和母本1300bp、父本1350bp和母本900bp、父本550bp和母本900bp.本研究探索杂种实生苗早期鉴定的可行之法,为分子标记辅助选择(MAS)、缩短甘蔗育种年限奠定工作基础.     

甘蔗谷胱甘肽硫转移酶基因SoGST-1a的克隆与表达分析

克隆甘蔗谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferase,GST)基因,并分析其序列特征和表达谱,为甘蔗抗旱育种提供基因来源。本研究采用电子克隆和RT-PCR技术从甘蔗品种‘新台糖22号’中克隆到一个甘蔗GST基因,命名为SoGST-1a。通过生物信息学软件分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR检测其表达谱。序列分析表明该基因cDNA全长702 bp,编码224个氨基酸,预测的蛋白分子式为C₁₁₁₇H₁₇₅₀N₃₀₀O₃₂₈S₆,蛋白分子量为24.82 kDa,等电点为5.96。蛋白疏水性分析推测其为亲水性蛋白。保守结构域预测表明SoGST-1a蛋白具有2个GST结构域。系统进化树分析表明该基因与玉米Zeta类GST蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,干旱胁迫下SoGST-1a基因下调表达。研究结果表明,SoGST-1a基因可能在甘蔗干旱胁迫中并不发挥一定作用。这些结果为深入了解SoGST-1a基因的生物学功能奠定了基础。     

逆境启动子的鉴定及在大豆中的应用

为减少抗逆分子育种中因引入外源抗性基因造成的基因多效性,降低外源基因对植物的伤害,本研究设计并合成逆境响应顺式元件不同组合的启动子,将其连上GUS报告基因后转化为拟南芥野生型Col-0;通过转基因拟南芥中GUS报告基因的表达强度分析各种启动子对干旱和盐害的响应情况,筛选出了在正常条件下无渗漏、在干旱和盐害胁迫下被诱导的启动子AXpro。然后,利用发根农杆菌介导转化大豆,发现干旱诱导生物钟基因GmTIC的沉默能提高大豆的抗旱能力。研究结果为农林业的抗逆分子育种提供了理论基础和应用方法。     

甘蔗磷脂酰肌醇转运蛋白基因ScSEC14响应干旱和盐胁迫

Sec14-like磷脂酰肌醇转运蛋白(Sec14-like phosphatidylinositol transfer proteins, PITPs), 广泛存在于真核生物细胞中, 参与肌醇磷酸代谢、膜运输、极性生长、信号转导、逆境胁迫等多种重要的生命过程。甘蔗中响应干旱和盐胁迫的Sec14-like基因尚未见报道。本研究从甘蔗受黑穗病胁迫的转录组数据库中获得一条SEC14基因序列, 并利用RT-PCR技术克隆得到甘蔗SEC14基因cDNA全长序列, 命名为ScSEC14 (GenBank登录号为MG571103)。生物信息学分析显示, ScSEC14基因全长1617 bp, 包含一个1008 bp的完整开放阅读框, 编码335个氨基酸; ScSEC14为不稳定的亲水性蛋白, 不存在信号肽; 蛋白二级结构元件多为α-螺旋, 具有典型的SEC14结构域和CRAL_TRIO_N结构域。此外, 系统进化树分析揭示, 该蛋白属于Sec14-like蛋白家族的SSH (soybean Sec14 homolog group)亚家族。亚细胞定位结果表明, ScSEC14蛋白主要定位于细胞膜。实时荧光定量PCR分析发现, ScSEC14基因在甘蔗中组成型表达, 在蔗皮中的表达量最低, 蔗叶中的表达量最高, 约为蔗皮的4.9倍; 该基因在PEG、NaCl、CaCl₂和水杨酸(SA)胁迫下的表达量均上调。因此, 甘蔗ScSEC14基因可能参与Ca ²⁺和SA介导的抗逆信号通路, 积极响应逆境胁迫, 尤其调节了干旱和高盐环境下的抗逆性。     

割手密SsWRKY1基因的克隆与表达分析

为了克隆割手密SsWRKY1基因,并对其生物信息学和表达模式进行分析。本研究通过转录组测序和RT-PCR方法相结合首次从割手密中克隆到一个WRKY基因,利用生物信息学工具对其进行分析,并利用荧光定量PCR分析其在干旱胁迫下的表达模式。从割手密中克隆到一个全长1083 bp编码360个氨基酸的WRKY转录因子的基因,含有一个WRKY基因保守结构域和一个Cx4-5Cx22-23HxH的锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员,命名为SsWRKY1,GenBank登录号为MH687932。荧光定量分析表明,随着干旱胁迫时间的延长,其表达量呈持续上调的表达模式,说明该基因是干旱胁迫诱导型基因。SsWRKY1基因在割手密应答干旱胁迫等非生物胁迫中可能起重要的调控作用,为进一步研究割手密的抗旱机制和甘蔗抗旱新品种的选育提供了科学依据。     

基于转录组及WGCNA的甘蔗干旱响应调控网络分析

干旱是制约甘蔗产业发展的重要因素之一。前人研究表明,斑茅具有良好的抗性基因,可以通过远缘杂交遗传给后代。本研究以斑茅与甘蔗杂交F1代无性系YCE96-40为材料,对苗期干旱处理0 h和24 h后的叶和根进行转录组测序分析,比较了根和叶在转录水平上响应干旱的差异,鉴定出21,885个(DR vs CR:10176, DL vs CL:7907)差异表达基因(DEGs),根中差异表达基因多于叶中,说明根对干旱胁迫响应更为剧烈。GO功能富集分析发现,根和叶中DEGs均富集到与脱水反应相关及激素信号转导过程相关的条目,比如“对渗透胁迫生物过程的响应”和“对缺水生物过程的反应”等。与叶不同的是,根中大量DEGs显著富集到与细胞膜相关的条目。在根中鉴定出多个木质素相关DEGs,表明木质素参与了根的干旱响应。通过对所有DEGs进行WGCNA分析,共鉴定出11个基因共表达模块,其中与干旱处理后的根显著相关有5个模块,与干旱处理后的叶显著相关的有2个模块。进一步筛选出了26个转录因子为甘蔗干旱响应的候选转录因子,构建了调控网络。研究结果为进一步理解甘蔗抗旱性的分子机制及甘蔗抗旱性育种提供了理论指导。     

准噶尔无叶豆EsDREB2B基因在烟草中的抗逆功能分析

DREB(dehydration responsive element binding protein)转录因子在植物响应非生物胁迫上具有重要作用,是颇具潜力的植物抗逆育种候选基因。本研究旨在通过烟草体系,验证前期从准噶尔无叶豆中克隆的Es DREB2B基因在种子萌发和成苗成长阶段的抗逆功能,并初步探究其调控的下游靶基因。结果表明:转基因株系在干旱、高盐、冷和热胁迫处理下的萌发率都高于野生型烟草,其中盐和热胁迫下萌发率差异尤为显著;两月大转基因烟草与野生型植株进行干旱、高盐、冷和热胁迫处理后,转基因较野生型植株叶片萎蔫,黄化和伤害程度较轻,在热胁迫下差异最为显著;恢复培养后,大多野生型烟草表现为枯死状态,转基因植株则叶片萎蔫减轻并开始生长,并且转基因烟草存活率显著高于野生型,均达到了野生型的3~4倍。ERD10B和Hsp70基因在四种胁迫后的转基因烟草中的表达量均较野生型高,Hsp90在热胁迫下较野生型表达量升高,而Mn SOD,P5CS等基因的表达量变化不显著。以上结果表明,Es DREB2B基因能提高烟草抗干旱、高盐、冷和热胁迫的能力,是具有潜力的抗逆分子育种候选基因。     

蔗茅野生种响应低温胁迫的数字基因表达谱

以蔗茅野生种(昆明蔗茅99-1)为材料,利用数字基因表达谱(DGE)技术,对4℃低温胁迫处理后的蔗茅野生种构建的c DNA文库进行差异基因表达谱分析。结果表明,低温处理24 h(ER-LT1)有2 391个基因,低温处理72 h(ER-LT2)有4 892个基因因低温处理而发生表达变化。GO功能显著性富集分析表明,差异基因主要涉及对非生物刺激反应、氧化还原过程、能量代谢以及催化活性。KEGG富集分析表明,两个不同处理时间下共同富集的通路主要为植物激素信号转导途径、植物-病原体互作通路、光合作用通路、淀粉和蔗糖代谢途径和苯丙烷生物合成途径等。利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证2个在低温胁迫条件下的差异表达基因,其结果与DGE分析结果基本一致,证实了DGE测序结果的可靠性。     

甘蔗赤霉素氧化酶基因ScGA20ox1的克隆及功能分析

GA20-氧化酶(GA20-oxidase,GA20ox)是赤霉素(gibberellic acid,GA)合成过程中的关键限速酶,但甘蔗GA20ox1基因(ScGA20ox1)的功能及其表达模式尚未明确。本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆了甘蔗GA20-氧化酶基因(ScGA20ox1), ScGA20ox1基因全长1574 bp,含有一个1125 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF),编码375个氨基酸。ScGA20ox1蛋白分子量为42.3 kD,理论等电点为5.95,不含信号肽,不含跨膜结构域,为可溶性蛋白。实时荧光定量PCR结果表明该基因在甘蔗幼苗中茎秆的表达量最高,叶片次之,根的表达量最低;干旱、低温和赤霉素处理均会改变该基因在不同组织的表达模式。利用农杆菌介导法转化拟南芥,获得过表达ScGA20ox1的转基因拟南芥植株,转基因拟南芥植株存在株高增高,节间长度增长的表型变异。本研究结果表明,ScGA20ox1参与甘蔗的生长发育并在响应非生物逆境中发挥重要调控作用,过表达转基因拟南芥形态发生变化,这为深入探究ScGA20ox1生物学功能,...