不同碳源条件下遗传重组大肠杆菌的生长表型研究

为了研究各碳源条件下yfcC基因重组大肠杆菌的生长表型,了解其生长过程,试验分别以LB、M9-葡萄糖、M9-乙酸为培养基对各重组大肠杆菌进行培养,利用紫外-可见分光光度计测定其OD600值,并绘制各细菌的生长曲线。结果表明:在LB和M9-葡萄糖培养条件下,yfcC基因重组大肠杆菌的生长均没有明显差异;在M9-乙酸培养条件下,yfcC基因过表达菌株的生长速度明显快于其他菌株。说明即使在相同的碳源条件下培养,各细菌也可能具有不同的生长表型,而yfcC基因过表达菌株生长较快可能是由于yfcC基因促进乙醛酸代谢导致的。     

共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性研究

为评价共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒(rFPV-AH5AIL6)的遗传稳定性,本研究将其接种CEF,绘制生长曲线.结果显示,该重组病毒与亲本病毒的生长速度及蚀斑大小一致;在CEF 连续培养20代,取第0代、5代、10代、20代重组病毒PCR扩增HA和Ⅱ-6基因进行鉴定,显示HA基因无核苷酸突变,IL-6基因在第20代时有1个氨基酸发生突变,但不影响该蛋白的功能区;间接免疫荧光试验证明所选代次病毒均能够表达HA蛋白,RT-PCR试验表明各代次病毒均可以表达鸡IL-6基因;通过蓝斑鉴定重组病毒纯度,结果显示所有蚀斑均为蓝斑.因此,该重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性,符合兽医生物制品的生产要求.     

表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性

本实验为了评价表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒（rFPV282E4-SF，rFPV Lp-SF）的遗传稳定性，将其在鸡胚成纤维细胞连续培养20代。通过蓝斑来鉴定重组鸡痘病毒纯度，结果所有蚀斑100％变蓝。通过对第0、10和20代F基因扩增并进行序列测定，所有碱基和氨基酸序列均和原始转移载体序列完全一致，没有发生任何改变。随后又通过间接免疫荧光证实rFPV282E4-FS和rFPV LP-FS各个代次F基因的特异表达。所有结果均显示了上述重组鸡痘病毒：艮有良好的遗传稳定性，满足兽医生物制品的遗传稳定性要求。     

共表达NDV F和IBDV VPO基因重组鸡痘病毒遗传稳定性研究

将共表达NDV F和IBDV VP0基因重组鸡痘病毒(重组鸡痘病毒vFV282)接种10日龄～11日龄SPF鸡胚,连续传10代,分别对第5、8、10代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定;重组鸡痘病毒vFV282接种鸡胚成纤维细胞,分别对第1、5、10、15、20、25、30代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定;重组鸡痘病毒vFV282翅翼刺种于鸡体上,连续传8代,对第3、5、8代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定.结果表明,重组鸡痘病毒vFV282在SPF鸡胚上传10代、在SPF鸡胚成纤维细胞传30代、在鸡体传8代后,其毒力未返强,F基因和VP0基因未发生缺失和变异.     

共表达NDVF和IBDV VP0基因重组鸡痘病毒遗传稳定性研究

将共表达NDVF和IBDVVP0基因重组鸡痘病毒（重组鸡痘病毒vFV282）接种10日龄～11日龄SPF鸡胚，连续传10代，分别对第5、8、10代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定；重组鸡痘病毒vFV282接种鸡胚成纤维细胞，分别对第1、5、10、15、20、25、30代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定；重组鸡痘病毒vFV282翅翼刺种于鸡体上，连续传8代，对第3、5、8代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定。结果表明，重组鸡痘病毒vFV282在SPF鸡胚上传10代、在SPF鸡胚成纤维细胞传30代、在鸡体传8代后，其毒力未返强，F基因和VP0基因未发生缺失和变异。     

呼伦贝尔细毛羊遗传稳定性的研究

呼伦贝尔细毛羊是根据呼盟岭东地区的自然环境、经济类型和生产条件培育的毛肉兼用型新品种。以新疆、阿斯卡尼、高加索、斯大夫和东德美利奴等细毛羊品种为父本,当地蒙古羊为母本,经过杂交改良,被毛同质后进行有目的选种选配,横交固定,后期引进中美和澳美种公羊导血,同时不断改善饲养管理条件而形成的体大、毛长、产毛量和净毛率高、适应性强、耐粗饲,具有良好生产性能的品种。     

共表达NDV F和IBDV VP0基因重组鸡痘病毒遗传稳定性研究

将共表达NDV F和IBDV VP0基因重组鸡痘病毒(重组鸡痘病毒vFV282)接种10日龄~11日龄SPF鸡胚,连续传10代,分别对第5、8、10代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定;重组鸡痘病毒vFV282接种鸡胚成纤维细胞,分别对第1、5、10、15、20、25、30代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定;重组鸡痘病毒vFV282翅翼刺种于鸡体上,连续传8代,对第3、5、8代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定。结果表明,重组鸡痘病毒vFV282在SPF鸡胚上传10代、在SPF鸡胚成纤维细胞传30代、在鸡体传8代后,其毒力未返强,F基因和VP0基因未发生缺失和变异。     

重组质粒pACYC184-hok/sok的构建及稳定性研究

以低拷贝质粒pACYC184为载体,将hok/sok基因插入到载体BamH Ⅰ位点,构建重组质粒pACYC184-hok/sok稳定系统,同时构建hok/sok基因缺失突变重组质粒pACYC184-hok/sok(M).通过对构建的重组菌进行连续传代和对不同代次的重组质粒进行SphⅠ酶切,分析hok/sok基因的引入对宿主细胞生长的影响.结果表明,重组质粒pACYC184-hok/sok在无抗生素筛选压力下连续传代,传至第135代时质粒稳定率仍是100%,且传代前后的质粒SphⅠ酶切图谱没有发生变化,DNA序列测定表明,插入的hok/sok基因没有发生任何突变.突变重组质粒pACYC184-hok/sok(M)传代前后的质粒SphⅠ酶切结果虽没有发生变化,但其相应的重组菌传至第15代,质粒几乎完全丢失.生长曲线的测定结果表明,与舍pACYC184重组菌生长曲线相似,pACYC184-hok/sok重组菌生长较快,而pACYC184-hok/sok(M)重组菌生长缓慢.以上结果表明,含hok/sok稳定系统,其稳定性明显高于无hok/sok稳定系统的质粒pACYC184以及突变质粒pACYC084-hok/sok(M).重组质粒pAqCYC184-hok/sok具有良好的结构稳定性和分离稳定性.     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及对小鼠胚胎稳定性的影响

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）对小鼠胚胎稳定性的影响,运用大肠杆菌表达系统制备了具有生物活性的重组大肠杆菌LT,用重组LT通过腹腔注射处理妊娠小鼠,分析了LT对小鼠胚胎稳定性的影响。首先采用PCR方法从产毒大肠杆菌菌株44815基因组中扩增LT的A、B亚基基因,将其插入到pET-20b（＋）原核表达载体pelB信号肽的下游,分别构建成LTA和LTB分泌型表达载体;将载体分别转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG的诱导下进行表达,利用Ni-NTA琼脂糖凝胶从细菌周质释放液中提取和纯化重组LTA和LTB蛋白;利用细胞毒性试验检测重组蛋白的生物活性。然后用制备的重组LT注射妊娠6d的小鼠,连续注射3d后,统计小鼠的胚胎存活率。同时用ELISA方法检测小鼠血清中与胚胎稳定性密切相关的Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-2）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）及IL-β的表达水平。结果表明,采用分泌性表达策略实现了重组LT在大肠杆菌中的高效分泌表达,LTA和LTB的表达量分别达68、62mg/L。表达的重组LT具有明显的细胞毒性作用;用LT处理妊娠小鼠,胚胎的存活率为32%,明显低于对照组;小鼠血清中Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的含量明显高于对照组（P〈0.01）,分别为对照组的2、3倍。同时细胞因子IL-1β为对照组的2倍（P〈0.01）,而稳定胚胎发育的Th2型细胞因子IL-4、IL-10没有明显变化（P〉0.05）。据此推测,LT可能与大肠杆菌性肠炎引起妊娠家畜流产有关,LT对胚胎稳定性的影响除与LT的直接毒性有关外,可能还与LT介导的免疫调节异常有关。     

食品级重组产朊假丝酵母菌的构建及其遗传稳定性测定

旨在构建食品级酵母工程菌株,并对其遗传稳定性进行评价。采用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)方法,将实验室已构建完成的原核表达载体PGZM18中的原核基因序列删除,设计2组引物,以PGZM18原核载体序列为模板进行引物设计,将片段序列分为2个片段P1-1和P2-1,通过重叠延伸PCR技术删除来自原核的DNA序列(包括抗药性标记Amp在内的细菌质粒序列DNA片段及原核复制区),将最终获得的PCR产物GZM18转化至产朊假丝酵母中,通过菌落计数和PCR方法测定外源基因遗传稳定性。结果表明,食品级产朊假丝酵母工程菌株构建成功,外源基因具有较高的遗传稳定性。研究结果为产朊假丝酵母工程菌在微生物饲料开发方面的应用提供了科学依据。     

近交陆川猪的遗传稳定性研究

旨在探讨高度近交陆川猪的遗传稳定性。本试验采集20头近交和6头非近交陆川猪的耳组织样品进行个体基因组重测序,通过扫描全基因组SNPs分析近交陆川猪群体的遗传多样性,并基于基因组纯合度挖掘近交陆川猪群体中特异的纯合区域(region of homozygosity, ROHs)及相关基因。结果表明,近交陆川猪群体的观察杂合度(0.373)小于期望杂合度(0.491),推测其发生了选择或者近交;系统进化树和群体遗传结构分析发现,近交陆川猪群体在近交过程中分化成为两个近交家系,且230、236、239、132、130及126号个体亲缘关系最近;在近交群体中,基因组纯合度和基因组长纯合片段比例的均值分别为59.64%和0.12,都极显著高于非近交群体53.18%和0.05(P0.01),说明该近交陆川猪群体已达到高度近交;近交群体和非近交群体中分别有1 250和633个ROHs,重叠分析结果显示,特异存在于近交群体中的阳性纯合区域(positive region of homozygosity, pROHs)有224个,其中由于近交产生的纯合突变可能影响参与激素合成过程、胰液分泌、膜脂代谢过程、IgA产生的肠道免疫网络及纹肌细胞分化等相关的1 322个基因。结果提示,近交陆川猪群体的遗传多样性低、基因组纯合度高且已达到高度近交,说明该群体的遗传稳定性高。此外,近交陆川猪群体在近交过程中产生的纯合突变可能与机体的免疫、生长等生产性状相关。     

近交陆川猪的遗传稳定性研究

旨在探讨高度近交陆川猪的遗传稳定性。本试验采集20头近交和6头非近交陆川猪的耳组织样品进行个体基因组重测序,通过扫描全基因组SNPs分析近交陆川猪群体的遗传多样性,并基于基因组纯合度挖掘近交陆川猪群体中特异的纯合区域（region of homozygosity,ROHs）及相关基因。结果表明,近交陆川猪群体的观察杂合度（0.373）小于期望杂合度（0.491）,推测其发生了选择或者近交;系统进化树和群体遗传结构分析发现,近交陆川猪群体在近交过程中分化成为两个近交家系,且230、236、239、132、130及126号个体亲缘关系最近;在近交群体中,基因组纯合度和基因组长纯合片段比例的均值分别为59.64%和0.12,都极显著高于非近交群体53.18%和0.05（P<0.01）,说明该近交陆川猪群体已达到高度近交;近交群体和非近交群体中分别有1 250和633个ROHs,重叠分析结果显示,特异存在于近交群体中的阳性纯合区域（positive region of homozygosity,pROHs）有224个,其中由于近交产生的纯合突变可能影响参与激素合成过程、胰液分泌、膜脂代谢过程、IgA产生的肠道免疫网络及纹肌细胞分化等相关的1 322个基因。结果提示,近交陆川猪群体的遗传多样性低、基因组纯合度高且已达到高度近交,说明该群体的遗传稳定性高。此外,近交陆川猪群体在近交过程中产生的纯合突变可能与机体的免疫、生长等生产性状相关。     

罕山白绒山羊遗传稳定性的研究

利用罕山白绒山羊种公羊和辽宁绒山羊种公羊分别与本地母羊进行杂交 ,观察罕山白绒山羊的遗传稳定性 ,其结果表明 :罕山白绒山羊改良本地山羊与辽宁绒山羊改良本地山羊具有同样的良好效果 ,表现出较高的遗传稳定性。     

罕山白绒山羊遗传稳定性的研究

罕山白绒山羊是引用辽宁绒山羊提高原有白山羊的生产性能,经过不断引血、选育、提高和改善饲养管理条件下形成的具有毛长、产绒量高、适应性和抗病力强、耐粗饲、遗传性能稳定等优点的绒山羊新品种。 为了更好地验证罕山白绒山羊的遗传稳定性,我们于一九九二年十一月份在扎鲁特旗查布嘎吐苏木钢嘎铺和道老杜苏木兽医站羊场进行了两个不同品种羊的杂交对比试验。     

重组人白细胞介素6表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

本研究合成了两个成熟人IL-6cDNA引物.采用PCR法扩增出了成熟人IL-6基因片段,并在其5’端加入了一个Eeo RI部位和ATG,3’端加入了一个Bam HI部位和TAA.利用pBV220质粒构建成功了pBV220 IL-6表达载体.将该重组质粒导入E.coli DH5α中,经30℃扩增和42℃诱导,表达出了分子量为21000的预期蛋白.经SDS-PAGE分析与薄层扫描测定,重组IL-6的含量约占全菌体总蛋白的27％以上.菌体裂解液用7TD_1细胞测定,证明具有明显的IL-6活性.实验还对工程菌的IL-6表达动态和包涵体提取进行了研究,从而为工程菌发酵与IL-6纯化提供了工作基础.     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性

将表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗连续传代至30代，取第10、20、30代重组病毒作为受检代次，进行外源基因片段的克隆与测序，以间接免疫荧光试验检验各代次的表达，并以第10、20、30代重组鸡痘病毒疫苗进行免疫保护效力试验。对各代次模板进行PCR反应，分别扩增出特异的1．7kb外源基因片段，酶切位点与原始代次相同；各代次外源基因序列与原始序列相比，仅有1个碱基发生变化，不涉及氨基酸的变化；免疫荧光试验显示各代次均有显著表达；各免疫组在免疫后第7、10、14、20天的HI抗体效价(log2)逐渐上升；攻毒后第5天各免疫组排毒率与对照组相比差异显著，各免疫组之间无显著差异。结果表明：此重组载体疫苗具有较好的遗传稳定性，经过30代的传代后外源插入基因及其表达未见变化，免疫保护效力亦与原代一致。     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性评价

为了检测表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因重组鸡痘病毒（rFPV-ILTVgB)的稳定性，我们对重组病毒进行6代和16代克隆纯化，对纯化后的病毒通过转瓶连续培养传20代，结果发现第6代纯化病毒（rFPV-ILTVgB-C6)在传代过程中有白斑出现，说明病毒纯度不够；经过16代纯化的病毒（rFPV-ILTVgB-C16)对细胞的嗜性加强，病毒的效价进一步升高，20代传代后蓝斑率仍然为100％，PCR的检测进一步证明插入的外源基因能在病毒的长期传代过程中稳定地遗传。抽取病毒细胞传代过程中的第5，10，15，20代次的病毒翅膀内侧无血管处皮下接种2周龄SPF鸡，20天后分为两组，分别用传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒102株攻击，结果不同代次的重组病毒均可以使免疫鸡抵抗传染性喉气管炎病毒和鸡痘病毒强毒的攻击，鸡体内病毒传代试验表明，重组病毒在接种部位仅存在6天，之后就检测不到病毒，重组病毒通过SPF鸡连续传代，不存在病毒返祖的可能，由此可以得出一个结论：rFPV-ILTVgB在结构上和免疫原性上是稳定的，无论是在体外传代，还是在体内均可以稳定遗传，不存在因为接种重组疫苗而给免疫鸡群带来安全威胁的可能，完全可以作为疫苗毒株进行商品化开发。     

6种中药提取物消除大肠杆菌耐药性的研究

通过对15株致病性大肠杆菌耐药谱的调查,采用浓度为1000mg/L的地锦草提取物、黄芩苷提取物、苍术油、连翘提取物、雪胆提取物和十大功劳提取物对大肠杆菌作用20h,观察作用前后大肠杆菌对6种抗生素的耐药率的变化。耐药谱调查结果显示,10耐及10耐以上的大肠杆菌达80%。经不同中药提取液作用后,地锦草提取液具有比较好的耐药性恢复作用,十大功劳、黄芩和雪胆提取物的效果次之,而苍术油和连翘提取液并无恢复耐药性的作用。说明部分中药可恢复耐药性大肠杆菌对抗生素药物的耐药性。     

鸡新城疫C30毒株稳定性试验研究

鸡新城疫C_(30)毒株系从V.P.Vaccine nobilis clone 30冻干疫苗中分离的,该毒株经试验研究证明毒力、免疫性比现在我国生产的Lasota系弱毒疫苗优越,为了探索该毒株的稳定性,特做试验研究。现将结果报告如下。     

仔猪大肠杆菌感染和遗传性质的关系

新生仔猪感染K88阳性大肠菌后发生下痢,通常经过2～3天死亡,此种埃希氏大肠菌多数可同时产生柔毛抗原和肠道毒素,受各种不同的质粒所支配,如把该质粒人工接种于其他大肠菌,是可能成功的。SMITH利用这种性质,进行了详细的遗传工程的研究,柔毛抗原K88和产生肠道毒素是埃希氏大肠菌的毒力因子。据