降解菌Pseudomonas sp.对阿特拉津的降解条件优化

为微生物降解菌在农药污染土壤修复工程中应用提供参考,以从长期受阿特拉津污染的农田土壤中筛选出的一株降解菌Pseudomonas sp.为研究对象,采用单因素试验研究其在不同培养条件下对阿特拉津的降解效果,并采用正交试验进一步优化该菌的降解条件。结果表明:碳源对降解效果的影响不大;培养时间48h,底物浓度100mg/L,温度25~35℃,pH 5.0~8.0,盐度0.1%~1%时,该菌对阿特拉津的降解效果较好,降解率大于90%;该菌对阿特拉津降解的最佳组合条件为温度30℃,pH 7.0,盐度0.5%;且3因素对降解效果的影响依次为温度pH盐度。     

来源于Thermomyces sp.的植酸酶基因在毕赤酵母中的组成型表达

[目的]研究植酸酶基因在毕赤酵母中的组成型表达。[方法]用PCR方法从嗜热真菌(Thermomyces sp.)中扩增到去除信号肽和内含子后约1.4 kb的phyT基因编码区片段,并对该片段进行克隆与序列测定。[结果]序列相似性分析表明,克隆的植酸酶基因无信号肽和内含子,与报道的嗜热真菌Thermomyces lanuginosus植酸酶基因相似性最高,DNA序列相似性为95%。从验证后的转化子筛选得到了表达嗜热真菌植酸酶的重组毕赤酵母菌株p-phy T,SDS-PAGE分析显示其分子量约为45 kD,重组毕赤酵母成功表达植酸酶。与野生型菌株相比,结果显示重组植酸酶酶活性提高了12.6%,最适温度65℃,75℃仍有64%以上酶活活性;最适pH值为5.5。[结论]嗜热真菌植酸酶基因用组成型质粒能在毕赤酵母中表达。     

嗜盐石油烃降解菌Halomonas sp.1-3降解石油烃特性研究

为研究嗜盐石油烃降解菌在石油烃污染修复中的应用可行性,研究了来自胜利油田油泥中的一株嗜盐石油烃降解菌Halomonas sp.1-3在不同NaCl浓度条件下的生长特性及对石油烃的降解特性。结果表明:菌株在NaCl浓度低于6%条件下培养时表现为延滞期短,快速达到稳定期后随即进入衰亡期;中高盐度(≥9%)条件下培养时延滞期延长,达到稳定期的时间滞后,但稳定期时间长。低盐条件下菌株对石油烃的降解启动快,但不持续;当NaCl浓度为5%~10%时,菌株对石油烃有长效的降解,NaCl浓度为5%时菌株对石油烃降解率最高,对C₁₀~C35不同碳数石油烃的降解率为55%~85%;当NaCl浓度大于10%时,随着NaCl浓度的升高降解率迅速降低,其中碳链较短的石油烃(C₁₀~C₁₄)降解率呈明显下降趋势,而长链石油烃(C₂₉~C₃₆)降解率呈上升趋势。研究表明,菌株Halomonas sp.1-3在盐碱环境中对石油烃具有良好的降解效果。     

Synechocystis sp. strain PCC 6803定量PCR模板制备方法的改进

以Synechocystis sp.strain PCC 6803为实验菌株,设计改良制备定量PCR模板的方法;同时,对Synechocystis sp.strain PCC 6803总RNA的Trizol抽提法进行优化.结果显示,利用改良方法抽提得到的RNA结构更完整;同时,利用改良方法制备的模板可以用于后续定量PCR实验;其中,只有高表达量基因适用于半定量PCR,低表达量基因则需要实时荧光定量PCR检测.     

嗜盐古菌Haloferax sp. H4蛋白质表达差异研究

[目的]研究嗜盐古菌Haloferax sp.H4在不同环境中的蛋白表达差异。[方法]采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测不同NaCl浓度、pH、温度、有氧和无氧条件下的H4菌株蛋白表达差异。[结果]H4菌株在不同NaCl浓度、有氧和无氧条件下的蛋白表达存在明显特异性;而在不同pH和温度条件下,其蛋白表达差异性不明显。[结论]嗜盐古菌对不同环境因子的调控方式可能存在差异。     

烟粉虱内共生菌传毒相关groEL基因dsRNA载体的构建及其在烟草中的表达

烟粉虱内共生菌groEL基因编码一种与植物病毒传毒相关的GroEL蛋白.以B型烟粉虱为研究对象,利用1对特异引物,对B型烟粉虱体内的groEL基因进行PCR扩增,选取502 bp groEL基因片段构建dsRNA,并将其连接植物表达载体pBIN19,将重组质粒电激转化农杆菌菌株LBA4404.采用农杆菌浸染转化本氏烟草,PCR筛选表明,目的片段已整合至转基因植株的基因组DNA;RT-PCR结果表明,502 bp的groEL基因片段在转基因植株中被转录.     

霜霉病菌诱导PRs基因在大白菜中的表达

为研究病程相关蛋白(PRs)基因与植物对霜霉病原菌抗性关系,本研究以大白菜抗病品种为材料,采用实时定量PCR技术检测接种Peronospora parasitica后4种PRs基因的表达。结果表明,P.parasitica接种处理显著诱导了PR-4和classⅣ几丁质酶基因在大白菜抗病品种中的表达,β-1,3-葡聚糖基因的表达却呈现双峰曲线特点,PR-1基因表达量没有变化。PRs基因的表达特点表明其在大白菜对霜霉病害抗性中起到了不同的作用。     

亚砷酸氧化菌Sinorhizobium sp. GW3的鉴定与亚砷酸氧化酶基因的分离

亚砷酸氧化细菌能够将毒性大的As(Ⅲ)氧化成毒性小的As(Ⅴ),在生物修复砷污染方面具有应用价值。对一株新型亚砷酸氧化菌Sinorhizobium sp.GW3进行了较全面的鉴定,并分离及分析了亚砷酸氧化酶基因aoxAB。形态学、生理生化鉴定和16S rRNA基因等分析结果表明该菌为Sinorhizobium属。该菌对As(III)抗性的MIC(Minimum inhibitory concentration)为9 mmol/L。首次在Sinorhizobium属中分离了包括编码小亚基aoxA和大亚基aoxB在内的亚砷酸氧化酶基因,其编码的大小亚基与已发现的Agrobacterium tumefaciens(ABB51929)的大小亚基在氨基酸水平上分别有86%、80%的同源性。     

一株栖盐田菌Salinicola sp.W1的柴油降解特性研究

结合Plackett-Burman设计与响应面法,以柴油降解率为响应值,对一株栖盐田菌(Salinicola sp.)W1的柴油降解条件进行了优化。Plackett-Burman试验结果显示,Fe SO4浓度、NH4NO3浓度和转速是影响柴油降解的显著因素。利用响应面法对3个因素进行了优化,确定Salinicola sp.W1降解柴油的最佳条件是Fe SO4浓度为0.1 mg/L,NH4NO3浓度为0.7 g/L,转速为118 r/min。在最佳条件下,柴油的最大降解率可达95.2%。该菌株有望应用于高盐环境中柴油污染的微生物修复。     

苯胺降解菌Rhodococcus sp. E2的分离与苯胺氧化酶基因簇的初步鉴定

从江苏省南通市某农药厂的活性污泥中分离出一株苯胺降解菌株E2,根据表型特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析,将其鉴定为红球菌属(Rhodococcus sp.)的细菌。菌株E2降解苯胺的最适温度为30℃、最适pH为7.0,降解苯胺的最高浓度为800 mg·L-1。该菌能降解苯胺、邻甲基苯胺、对甲基苯胺和2,5-二氯苯胺,与已报道的苯胺降解菌的底物谱显著不同。通过扩增高度保守的片段和染色体步移,获得了菌株E2中负责苯胺降解的基因簇,该基因簇在基因组成、排布及同源性方面和已报道的基因簇有较大差异,是研究苯胺降解分子机理的较好材料。     

一株广谱性农药降解菌(Alcaligenes sp.)的分离与鉴定

从杭州农药厂废水排放口污泥中分离到１株能降解部分拟除虫菊酯和一硫代磷酸酯类杀虫剂的广谱性降解菌ＹＦ１１．该菌球杆状，大小（１．５～１．７）μｍ×（２．５～２．８）μｍ，革兰氏阴性，４根周生鞭毛．菌落圆形，边缘整齐，表面光滑，凸状隆起．生长最适温度３０℃，最适ｐＨ７．０～７．５．好氧，氧化酶阳性．能利用蔗糖、阿拉伯糖、山梨糖、乳糖、七叶灵、果糖等，但不能利用淀粉和核糖、ＤＮＡ中Ｇ＋Ｃ含量为６１．７ｍｏｌ％（Ｔｍ）．根据上述特征，分离株被鉴定为产碱菌属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）的一个未知种．该分离株可降解氰戊菊酯、溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯、对硫磷、甲基对硫磷、杀螟松等农药     

青枯菌定量检测方法的建立及其在花生中的应用

[目的]建立快速、准确的青枯菌定量检测方法,研究青枯菌与寄主植物的互作.[方法]以青枯菌hrpB为靶基因,利用实时荧光定量PCR(RTQ-PCR)方法建立青枯菌的定量检测方法,并利用该方法检测花生接种青枯菌后细菌数量的变化动态.[结果]以提取的细菌DNA为模板和以青枯菌的全细胞为模板均能对青枯菌准确定量,在未富集细菌的...     

应用巢式PCR检测黄瓜尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f．sp．cucumbrum)

文章应用BIK2/BIK3和BIK1/BIK4两对引物,采用巢式PCR(Nested-PCR)技术对镰孢菌属26个菌株(代表了6个镰孢菌种)以及从黄瓜根际分离的20株真菌、6株细菌和7株放线菌共计59个菌株进行了扩增。结果显示,只有3个黄瓜尖镰孢菌的致病菌株能产生一条长度大约为800bp的片断。对接种黄瓜尖镰孢菌的黄瓜植株进行检测结果表明,巢式PCR能从接种5d后的黄瓜病样中特异性地检测出病原菌,而症状的出现需要10～13d时间。该项技术具有较高的灵敏度,适用于黄瓜枯萎病早期侵染检测研究。     

细胞自噬相关基因在水稻纹枯病菌菌核发育过程中的定量分析

在前期研究中,采用RNA-seq技术获得了在水稻纹枯病菌菌核发育过程中差异表达的6个自噬相关基因,为阐明这些基因在水稻纹枯病菌菌核发育过程中的表达模式,提取了菌核发育过程中3个阶段的RNA,根据特异基因的序列设计引物,采用实时荧光定量PCR技术分析这些基因的表达谱。结果表明,丝氨酸/苏氨酸激酶和ssp1、ATG13和Vam6基因的表达量在白色菌核形成阶段的表达量显著升高,而在菌核发育成熟阶段的表达量明显下降。而丝氨酸/苏氨酸-蛋白磷酸酶基因和丝氨酸/苏氨酸激酶受体相关蛋白基因的表达量在菌核发育阶段呈现出连续下降的趋势。研究发现这6个与细胞自噬有关的基因的表达谱与转录组测序的结果一致,表明转录组测序的结果可靠;同时也表明了这些基因高度响应了菌核的发育过程。     

头孢菌素类降解菌Achromobacter sp.YF-1的筛选与功能鉴定

为合理、无污染地利用头孢菌素类废弃药渣,以长期堆放的头孢菌素类药渣土壤为样品源,从中获得浸出液,通过第三代头孢药品头孢克肟驯化、筛选出具有头孢菌素类抗生素降解能力的菌株;利用革兰氏染色法、电镜超薄切片技术双染色法对其进行形态学观察,16S rDNA进行分子生物学序列分析;采用单因素控制变量法对菌株的生长特性及最佳降解条件进行了初步探讨。结果表明:该菌为杆状细菌,无芽孢;经16S rDNA序列比对,进一步确定该菌株属于Achromobacter属,并命名为Achromobacter sp. YF-1;该降解菌在温度37℃、pH 6～7、转速120 r/min培养条件下培养7 d,头孢菌素类抗生素降解率达92.71%;该菌株对头孢菌素类抗生素的降解能力稳定,可用于处理药渣中残留的头孢菌素类抗生素。     

共生菌群在熊蜂生长发育过程中的动态变化

【目的】了解人工饲养的兰州熊蜂（Bombus lantschouensis）肠道内共生菌群的组成,探明主要肠道共生菌群在熊蜂生长发育过程中的变化规律,为进一步开展熊蜂共生菌功能的研究奠定基础。【方法】以兰州熊蜂肠道总DNA为模板,使用细菌通用的774F和1391R引物进行PCR扩增,构建细菌16S rDNA文库,挑取单克隆菌落测序,测得序列去除chimera后,以序列相似性97%为标准,划分分类操作单元（operational taxonomic units,OTU）,采用BLASTn进行序列同源性分析,确定细菌种类,分析熊蜂肠道菌群的组成。根据克隆文库测得的Gilliamella apicola和Snodgrassella alvi细菌16S rDNA序列设计特异性引物。用G. apicola和S. alvi的特异性引物进行PCR扩增,构建重组子质粒,构建好的质粒经浓度测定后,10倍梯度稀释成5个浓度梯度,进行荧光定量PCR检测,绘制标准曲线。以兰州熊蜂的卵、幼虫、蛹以及0、5、10、15、20日龄的工蜂肠道DNA为模板,采用熊蜂β-actin为内参基因,对样品中的共生菌G. apicola和S. alvi进行荧光定量PCR分析,并比较不同日龄、不同虫态每微升肠道基因组DNA样品中检测到的细菌16S rDNA基因的拷贝数,分析共生菌数量在熊蜂生长发育过程中的变化。不同日龄、不同虫态之间相对表达量的显著性差异用软件SPSS19.0的单因素ANOVA方差分析进行统计。【结果】从文库中随机挑选213个单克隆进行测序,经过Chimeras分析后,共得到202个有效序列,这些序列共划分为16个OTU。测得的序列与登录的相应细菌16S rDNA序列的相似性在93%-99%。在克隆文库测得的细菌16S rDNA序列中,G. apicola占45%、S. alvi占30%、Bifidobacterium占10%、Fructobacillus fructose占5%、Lactobacillus占2%、Flavobacterium aciduliphilum占2%,其他细菌占6%。其中G. apicola和S. alvi为兰州熊蜂肠道内的主要共生菌,qPCR结果表明两种共生菌在不同日龄、不同虫态的熊蜂肠道内都能检测到,两种细菌的数量在熊蜂发育过程中的变化趋势相似,即先增加后减少,最后达到稳定状态。G. apicola和S. alvi在熊蜂的卵、幼虫和蛹中数量都较少,在5日龄时的数量达到峰值,显著高于其他日龄,之后又逐渐减少,在15日龄后趋于稳定,第15、20日龄之间差异不显著。【结论】人工饲养的兰州熊蜂肠道中主要有4个种属的常见共生菌：G. apicola、S. alvi、F. fructosus和Bifidobacterium,其中G. apicola和S. alvi是其体内的优势菌。G. apicola和S. alvi在熊蜂中都具有水平和垂直传播的特性,两种共生菌在熊蜂的卵、幼虫和蛹中都检测到,但数量较少,工蜂出房后细菌大量增殖并在出房15 d左右形成稳定的共生菌群。熊蜂生长发育过程中体内共生菌数量的变化可能与这两种细菌对熊蜂的作用有关。     

盐田土中中度嗜盐菌Pontibacillus sp. Y32的分离与鉴定

从江苏盐城三圩盐田土样中分离到一株中度嗜盐菌Y32并对其进行了系统鉴定。结果表明,综合该菌形态学、生理学和16S rRNA基因序列等特征,该菌为Pontibacillus属的一个新种,命名为Pon-tibacillus sp.Y32。菌种已送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏号为CCAM 100050。     

套式 PCR方法在泰泽氏菌检测中的应用和验证

用泰泽氏菌 RJ株感染的大鼠肝组织匀浆腹腔注射 Scid小鼠和 BALB/c小鼠,提取注射后小鼠肝、肾、肺、脾的 DNA, PCR扩增,核酸杂交.根据泰泽氏菌的保守序列合成引物扩增泰泽氏菌的基因组 DNA,建立了泰泽氏菌的套式 PCR方法,并将此方法应用于 Scid小鼠和 BALB/c小鼠以及可疑样品的检测,其中 Scid小鼠的肝、肾组织和 BALB/c小鼠的肝组织及可疑组织得到特异性扩增带,其他动物样品和组织 DNA均为阴性结果.进一步对该 DNA片段进行核酸杂交,结果证实,凡 PCR套式扩增为阳性的,均有杂交带.因此,泰泽氏菌套式 PCR方法在实际检测中是切实可行,其具有敏感性和特异性高的优点.