朱顶红SRAP-PCR反应体系的建立和优化

本研究采用L_(16)(4~5)正交试验设计方法,对朱顶红SRAP-PCR反应体系中的5种因素(Mg~(2+)浓度,d NTPs浓度,引物浓度,DNA模板量和Taq DNA聚合酶用量)进行优化,结果表明各因素对朱顶红SRAP-PCR扩增反应影响大小依次为:d NTPs浓度引物浓度Mg~(2+)浓度DNA模板量Taq DNA聚合酶用量。优化获得的朱顶红最佳SRAP-PCR反应体系为:1×PCR Buffer、Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L、d NTPs浓度0.2 mmol/L、引物浓度0.25μmol/L、20μL体系中DNA模板量80 ng以及Taq DNA聚合酶用量0.5 U。用10个朱顶红品种基因组DNA对所得最优体系进行验证,证明该体系具有较高的稳定性和重复性,能够为朱顶红遗传多样性研究和遗传图谱构建等提供重要技术支持。     

丝瓜ISSR反应体系的优化

以丝瓜基因组DNA为模板,对ISSR反应中主要5个影响因素Mg~(2+)浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度和DNA模板浓度,建立丝瓜ISSR-PCR反应的体系。根据实验确定的最佳反应体系为:25μL ISSR体系:50 ng DNA,0.2 mmol/L dNTP,1 U Taq酶,0.4μmol/L的单条引物,2.5μL 10×Buffer,2.0 mmol/L Mg~(2+)。在此基础上,对12个引物的退火温度进行优化。最终选用60份丝瓜品种对所确定的扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、亮度高和重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于丝瓜的ISSR分子标记为丝瓜种质资源的鉴定、分类和丝瓜的杂交育种提供参考依据。     

杜鹃花SCoT-PCR反应体系的优化及引物筛选

本试验以马银花(R.ovatum)DNA为模板,采用L16(45)正交试验对目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)体系中5因素(Taq聚合酶用量,Mg~(2+)浓度,模板DNA用量,dNTPs浓度,引物浓度)进行了优化,建立了杜鹃花植物SCoT-PCR反应体系。结果表明,在20μL的反应体系中,模板DNA 1.00 ng/μL,Mg~(2+)为3.00 mmol/L,dNTPs为0.25 mmol/L,引物为0.50μmol/L,Taq DNA聚合酶为2.00 U。比较了各因素对反应体系的影响,发现引物物浓度的差异对体系影响显著,各因素影响的先后顺序为引物Taq DNA聚合酶dNTPsMg~(2+)模板DNA。并运用了杜鹃属的4个不同种对最优体系进行了稳定性验证,选择了10个通用性的引物进行筛选,发现10个引物均能扩增出条带,其中有6个引物能够得到清晰可辨、多态性丰富的条带。该体系的建立将为杜鹃花遗传多样性、差异基因的表达分析,分子辅助育种、遗传图谱构建等研究提供技术支持。     

海南油茶SCoT反应体系建立与多态性引物筛选

SCoT-PCR是一种单引物扩增分子标记。为了将SCoT分子标记应用于海南油茶的分子鉴定和遗传多样性评价中,本研究采用单因素试验和正交试验结合方法,分析模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶及引物4种因素对海南油茶SCoT-PCR扩增结果的影响,构建海南油茶SCoT-PCR体系,并筛选多态性引物。单因素试验结果表明：DNA浓度对海南油茶扩增效率影响不大,高浓度dNTPs利于扩增产物,而Taq酶和引物扩增高效率偏于中浓度。正交试验结果表明：各因素对海南油茶SCoT-PCR扩增影响大小依次为引物>Taq DNA聚合酶>dNTPs>模板DNA;总体系为20μL时,最佳反应体系中模板DNA用量为30 ng,dNTPs浓度为0.30 mmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.00 U。利用构建的SCoT-pcr体系对80条SCoT单引物进行筛选,最终筛选出16条SCoT条带清晰的多态性引物,多态性比率平均值达到76.25%。本试验结果可为海南油茶的遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究提供参考数据。     

二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合二月兰的SSR-PCR反应体系,采用正交试验设计方法对影响二月兰SSR反应体系的5个因素(DNA模板、Mg~(2+)、d NTPs、引物和Taq聚合酶)进行优化试验,筛选出每个因素的最佳水平。结果表明,10μL反应体系中,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,d NTPs浓度0.4 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,DNA模板量20 ng,Taq聚合酶量0.6 U。以3份二月兰基因组DNA为模板,利用优化后的SSR-PCR反应体系进行引物筛选,从50对SSR引物中成功筛选出扩增条带清晰、具有多态性的引物有12对,证明该反应体系具有较好的稳定性和通用性。研究建立和优化的二月兰SSR-PCR反应体系,为进一步利用SSR标记技术开展二月兰分子生物学研究提供了理论依据和技术参考。     

郁金香SSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立郁金香SSR-PCR反应体系,本研究以36个荷兰引进的郁金香栽培品种和5个产于中国新疆的野生种为试验材料,采用单因素试验和L_(16)(4~5)正交设计相结合的方法,对影响郁金香SSR-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA、Taq酶用量进行优化,建立最佳的SSR-PCR反应体系,并利用3对引物在41份郁金香材料中验证反应体系的稳定性。结果表明:在20μL的PCR反应体系中,10×PCR Buffer (Mg~(2+)free) 2μL、Mg~(2+)2.0 mmol/L、dNTPs 0.75 mmol/L、引物2.0μmol/L、模板DNA 10 ng、Taq酶0.15 U为最优体系;通过正交试验确定5个因子对SSR-PCR体系的影响程度为:模板DNATaq酶引物Mg~(2+)d NTPs。筛选出的3对引物在41份郁金香材料中均可扩增出目的条带,表明该体系的稳定性好。本研究建立SSR-PCR反应体系,为郁金香SSR标记的开发以及遗传多样性分析、品种指纹图谱构建、种质资源鉴定等方面提供了帮助。     

沙棘SCoT-PCR反应体系的优化及引物筛选

为获得沙棘SCoT-PCR最佳反应体系并筛选出适用引物,本研究采用正交试验设计与单因素试验设计的方法对其反应体系进行优化,并在此基础上对设计的80条引物进行筛选.试验结果表明:沙棘SCoT-PCR最佳反应体系(20μL)为:2×Taq PCR预混试剂Ⅱ用量9.8μL,模板DNA用量25 ng,引物浓度0.9 μmol/...     

郁金香ISSR-PCR体系建立与优化

本研究以22个郁金香品种为材料,采用正交设计试验和单因素试验对ISSR-PCR反应中的5个影响因素:Mg~(2+)、d NTPs、Taq酶、引物、模板DNA进行4个水平的优化试验。结果表明最佳反应体系为:25μL体系中Mg~(2+)1.0 mmol/L、d NTPs 0.15 mmol/L、Taq酶0.25U、引物0.2μmol/L、模板DNA 100 ng。退火温度为58℃。该体系的建立有利于ISSR分子标记技术研究郁金香种质资源遗传多样性。     

丝瓜SRAP反应体系的优化

以丝瓜基因组DNA为模板,对SRAP反应中主要五个影响因素d NTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、DNA模板浓度、Mg~(2+)浓度进行优化,建立丝瓜SRAP-PCR反应的体系。根据实验确定的最佳反应体系为25μL SRAP体系。25μL SRAP体系为:75 ng DNA,0.2 mmol/L d NTP,1.25 U Taq酶,0.16μmol/L的单条引物,2.0 mmol/L Mg~(2+),2.5μL 10×Buffer。选用33个丝瓜品种对所确立扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、亮度高、重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于丝瓜的SRAP分子标记。     

凤仙花ISSR-PCR体系建立与优化

建立最适的PCR反应体系是成功进行ISSR-PCR的关键,且反应的扩增效果易受多种因素的影响,本研究采用正交试验和单因素筛选试验两种方法,选用凤仙花叶片DNA为实验材料,针对影响凤仙花ISSR-PCR反应较大的 Mg~(2+)、dNTPs、Taq酶、引物、模板DNA这5个因素进行优化并筛选,最终建立凤仙花ISSR-PCR最佳反应体系:25μL PCR反应体积中, Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L、引物浓度为0.4μmol/L、模板DNA浓度为150 ng、dNTPs浓度为0.15 mmol/L、Taq酶为0.5 U。利用该体系筛选出14条可用于凤仙花ISSR-PCR扩增的引物。通过建立凤仙花属最佳ISSR-PCR反应体系,为研究凤仙花属植物提供分子标记水平上的理论依据和技术方法。     

橡胶草及其近缘种ISSR反应体系及扩增程序的优化

本研究旨在建立和优化橡胶草及其近缘种ISSR (Inter-simple sequence repeat)反应体系和扩增程序。以橡胶草及其近缘种叶片为供试材料,采用单因素试验方法,正交试验方法 L16(44)和极差分析方法,对橡胶草ISSR-PCR反应中4个主要影响因素(dNTP浓度, DNA浓度,引物浓度和Taq DNA聚合酶浓度)进行优化,并在最优反应体系的基础上进行引物和退火温度的筛选。结果表明:dNTP和DNA对PCR扩增结果有较为显著的影响,引物和Taq酶的浓度变化对扩增结果无显著影响。最后确定橡胶草及其近缘种ISSR-PCR反应体系(20.0μL)为:双蒸水14.2μL,10×Buffer (含Mg2+) 2.0μL,DNA模板50.0 ng,10 mmol/L引物1.2μL,2.5 mmol/L dNTP 1.6μL,5 U Taq DNA聚合酶0.1μL。PCR扩增程序为:94℃5 min,94℃45 s,退火1 min,72℃70 s,45个循环,72℃10 min,4℃保存。本研究为橡胶草及其近缘种的遗传多样性和交配系统等后续研究提供理论参考。     

辽东地区胡桃楸天然林ISSR分子标记体系的建立和优化

为建立胡桃楸天然林ISSR-PCR反应体系,本实验从DNA的提取到扩增进行了研究。通过对比CTAB和试剂盒两种方法,发现胡桃楸最佳DNA提取方法为试剂盒法。利用正交试验设计法确定了胡桃楸ISSR-PCR反应最佳体系,并对影响胡桃楸PCR反应的Taq酶浓度、Mg~(2+)浓度、dNTP浓度等因素进行了优化。最终获得胡桃揪ISSR-PCR反应的最优扩增程序为:95℃预变性3 min,95℃变性30 s,48.3℃复性30 s,72℃延伸1 min,28次循环,最后72℃终延伸5 min。优化胡桃楸ISSR-PCR的最佳反应体系为:Taq DNA聚合酶浓度为0.75 U/20μL、Mg~(2+)浓度为1.75 mmol/L、dNTP浓度为0.20 mmol/L、引物浓度为0.35μmol/L、DNA模板浓度为150 ng/20μL。该研究为以后利用ISSR分子标记技术研究胡桃楸的亲缘关系和遗传多样性提供高效的技术手段。     

濒危藏药桃儿七ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为通过ISSR分子标记研究桃儿七遗传多样性,建立并优化桃儿七的ISSR-PCR反应体系。使用正交设计辅以单因素试验,对桃儿七ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA,Mg~(2+),Taq DNA酶,d NTPs及ISSR引物)进行筛选优化,选取甘肃碌曲县西仓神山山顶桃儿七居群样本验证该反应体系。正交试验各因素显著性为引物Taq DNA酶DNA浓度dNTPsMg~(2+),桃儿七ISSR-PCR反应的最佳体系为(25μL):2.5 mmol/L Mg~(2+),0.2 mol/L dNTP,0.4μmol/L引物,0.5 U Taq DNA酶,40 ng DNA,2.5μL 10×Buffer。该体系具有高稳定性,多态性丰富的特点,为野生桃儿七遗传多样性及保护策略研究提供了技术支持。     

云南高海拔地区桃种质资源ISSR体系的建立和优化

本试验以云南高海拔地区桃种质资源的样本为试验材料,从提取的100余份DNA样品中随机抽取1份,再用初筛的引物UBC-891,用于ISSR体系的优化。根据单因素试验和正交试验设计,本研究发现了最佳ISSR-PCR反应体系。研究结果表明:25μL的ISSR反应体系中,2.5μL 10×PCR buffer(含 Mg~(2+)),1.5 mmol/L Mg~(2+),2.0 U Taq-DNA聚合酶,0.10 mmol/L dNTPs,0.40μmol/L引物,45 ng DNA组合最佳。Taq-DNA聚合酶浓度对反应影响最大。本研究为引物筛选和云南高海拔地区桃种质资源ISSR遗传多样性研究提供了理论基础。     

软枣猕猴桃RAPD分子标记反应体系的优化

以长白山地区及韩国等9个采样点采集的软枣猕猴桃新鲜幼叶为试材,进行RAPD分子标记反应扩增体系的优化。对实验结果影响较大的5个因素(模板DNA浓度,引物浓度, MgCl_2浓度, dNTP浓度, Taq DNA聚合酶浓度)进行单因素设计,以寻找最佳反应浓度。结果表明,总反应体积为20μL时,模板DNA 40 ng、引物浓度0.3μmol/L、MgCl_2浓度2.0 mmol/L、dNTP浓度250μmol/L、Taq DNA聚合酶2.0 U。此时扩增条带多、电泳结果清晰稳定,表明该体系是一个适合软枣猕猴桃RAPD分子标记反应的体系。该体系的建立有利于软枣猕猴桃的亲缘关系和遗传多样性分析。     

西番莲科龙珠果ISSR-PCR体系的建立和优化

为了获得适于龙珠果ISSR-PCR的反应体系,本研究以龙珠果叶片为试验材料,提取基因组DNA,采用L16(45)正交设计试验,对影响龙珠果ISSR-PCR扩增结果的Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度和模板DNA量进行优化,并筛选了最适退火温度。试验结果分析表明,各因素影响显著性为dNTPs浓度>Taq DNA聚合酶用量>Mg²⁺浓度>模板DNA量>引物浓度。在20μL反应体系中,dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、Mg²⁺浓度2.0 mmol/L、模板DNA 25 ng、引物浓度0.4μmol/L为最佳用量。实验从100条UBC引物中筛选得到22条多态性较好的引物。本研究为龙珠果ISSR标记开发、种质资源鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助选择育种等提供科学依据。     

濒危藏药桃儿七cpSSR-PCR引物开发与反应体系优化

利用桃儿七叶绿体全基因组开发cpSSR引物,使用正交设计试验,对桃儿七cpSSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA,Mg~(2+),Taq DNA酶,dNTPs及ISSR引物)进行筛选优化来研究桃儿七遗传多样性。选取甘肃碌曲县则岔石林桃儿七居群样本及13个不同桃儿七居群验证该反应体系。正交试验表明:各因素显著性为Mg~(2+)引物Taw酶DNA浓度dNTPs,桃儿七cuss-PCR反应的最佳体系为(25μL):DNA20 ng/μL,Mg~(2+)1.5 mmol/L,dNTPs 2.0 mmol/L,Taq DNA酶0.5 U,引物1.0μmol/L,2.5μL 10×Buffer。该体系具有很高的稳定性和重复性,并为野生桃儿七遗传多样性及保护策略研究提供了技术支持。     

元宝枫SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究采用改良的CTAB法提取元宝枫基因组DNA,并使用L_(16)(4~5)正交试验设计。通过5因素4水平实验,筛选Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物浓度、Mg~(2+)、模板DNA浓度及其用量,建立并优化元宝枫(Acer truncatum)的最佳SSR-PCR反应体系,即总体积20μL,Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、Mg~(2+)和模板DNA浓度分别为1 U/20μL、0.2 mmol/L、0.6 mmol/L、1.25 mmol/L和75 ng/20μL。扩增实验结果表明,该反应体系稳定性较好,可重复性高,具有较好的分辨率。可从59对引物中筛选出14对适用于元宝枫并具有较明显的多态性的SSR引物,为进一步研究元宝枫的分子标记辅助育种、SSR遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了良好的基础。     

珍稀植物浙江雪胆SCoT-PCR体系的建立及优化

为建立浙江雪胆SCoT-PCR的最佳反应体系,本研究采用正交实验对dNTPs、引物、模板DNA及Taq聚合酶等的浓度进行筛选,并对采自景宁畲族自治县的材料进行验证。结果表明,PCR体系中各因素用量对多态性结果的影响大小依次是引物>dNTPs=Taq酶>模板DNA,最佳反应体系(20μL)为0.7μL dNTPs(10 mmol/L),0.3μL引物(20μmol/L),0.4μL Taq酶(2 U/μL),1.2μL DNA模板(20 ng/μL),2μL 10×缓冲液(含20 mmol/L Mg²⁺),dd H₂O 15.4μL;筛选出11条稳定性好、多态性高和重复性好的引物,同时优化了它们的最佳退火温度;对10份种质资源进行验证,结果表明该体系扩增的结果稳定、扩增条带清晰。浙江雪胆SCoT-PCR体系的建立和优化,为后续开展遗传多样性研究、资源保护和分子育种提供了依据。     

高粱抗丝黑穗病基因SRAP体系优化

为建立高粱抗丝黑穗病基因最佳的SRAP-PCR反应体系,进一步筛选与抗病基因相关的SRAP标记。本研究采用单因素与正交设计相结合的方法,对影响高粱SRAP-PCR体系的5个因素Taq酶、Mg2+、模板DNA、d NTPs和引物进行优化,以期筛选出最优的高粱抗丝黑穗病基因SRAP-PCR反应体系。研究表明:在优化得到的20μL的高粱SRAP-PCR体系中,模板DNA的用量为20.0 ng,Taq DNA聚合酶的用量为0.14 U,Mg2+的浓度为3.0 mmol/L,d NTPs浓度为0.3 mmol/L,引物的浓度为0.5μmol/L。各因素对反应体系影响大小依次为:引物浓度DNA用量Taq DNA聚合酶浓度Mg2+浓度=d NTPs浓度。本研究将为高粱抗性基因的定位与功能研究提供基础数据与技术支持。