蒙古扁桃编码Ca~(2+)结合蛋白基因的系统性鉴定和表达分析

为进一步解析蒙古扁桃抗逆境的遗传机理,采用高通量转录组测序技术,结合生物信息学和基因表达分析,在蒙古扁桃体内鉴定到16个编码Ca~(2+)结合蛋白的全长转录本,包括4个Ca~(2+)ATPase(ECA/ACA),3个具有多个跨膜域的新型Ca~(2+)通道蛋白(ERD),5个Ca~(2+)/H+反向转运蛋白(CAX),2个Ca~(2+)依赖的蛋白激酶(CPK)和2个钙调素蛋白(CAM),它们的结构域同拟南芥同源蛋白基本相同。ERD、CAX、CPK和CAM各有1个基因在蒙古扁桃根和叶中有明显表达,其中的ERD、CPK和CAM类的基因表达在不同程度上受干旱和盐胁迫调节,说明有可能调节蒙古扁桃的抗逆能力。     

白芨蔗糖转运蛋白基因BsSUT2的克隆和表达分析

蔗糖转运蛋白(SUTs)在介导蔗糖由源到库器官的长距离运输、植物生长发育以及抵抗逆境胁迫中发挥重要作用,研究白芨蔗糖转运蛋白BsSUT2的序列信息与表达模式,为揭示其蛋白结构及基因功能提供依据。基于白芨转录组数据,采用RT-PCR技术获得白芨Bs SUT2基因CDS全长,通过生物信息学软件分析Bs SUT2编码蛋白的分子特征,并对BsSUT2进行氨基酸序列比对与系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR技术检测BsSUT2基因的组织表达模式。结果表明,克隆获得的BsSUT2基因CDS全长为1 584 bp,编码527个氨基酸。BsSUT2蛋白包含12个跨膜结构域,亚细胞定位预测表明BsSUT2蛋白定位于质膜,与铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰SUT2基因编码蛋白序列一致性高,隶属于SUT4亚族。Bs SUT2基因的表达具有组织特异性,其转录本在白芨幼苗的假鳞茎中表达量最高。推测BsSUT2基因在白芨生长发育和蔗糖的分配中发挥重要作用。本研究对白芨BsSUT2基因的序列特征与组织表达模式进行分析,为阐明Bs SUT2基因在蔗糖运输与分配、生长发育和逆境胁迫中的功能提供实验数据支持。     

玉米异交不亲和基因Ga1-S的蛋白质组分析

为了研究玉米异交不亲和的蛋白表达机制,以玉米(Zea mays L.)异交不亲和基因Gal-S的一对近等基因系W22(GG)与w22(gg)为材料,组配自交(GG×GG)、正交(gg×GG)与反交(GG×gg) 3个组合。首先采用荧光显微技术, 观察比较了3个组合中花粉管在花丝中的生长过程;其次采用IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,比较研究了授粉后10 h自交与反交母本W22(GG)花丝蛋白质组的特异表达差异。结果表明,授粉后10 h,自交与正交花粉管伸长可达花丝基部,而反交花丝基部未观察到花粉管;自交与反交母本W22(GG)花丝蛋白质组共检测到25个差异蛋白质点,其中15个在自交中特异表达,10个在反交中特异表达;通过MALDI-TOF-MS质谱测序和MASCOT序列分析,注释了12个蛋白质点;其中自交中特异表达的蛋白质点11、12、14和异交中特异表达的蛋白质点18、22、24可能与玉米异交不亲和密切相关。     

秦川牛CDS1基因克隆、分子特征及组织表达分析

为明确秦川牛CDS1基因的编码序列、分子特征及其在不同组织的表达特点，以秦川牛为研究对象，利用PCR扩增技术克隆CDS1基因的全编码区序列，利用生物信息学方法分析其全编码区的序列特征，以GAPDH为内参基因，采用qRT-PCR技术检测CDS1基因在脑、睾丸、胰、肺、脾、肾、瘤胃、背最长肌、肝、肌内脂肪和心组织中的表达水平。结果显示，秦川牛CDS1基因编码区为1 392 bp,编码464个氨基酸，CDS1基因在不同物种间具有较高的保守性，且与瘤牛的同源性最高；CDS1基因编码蛋白为疏水性不稳定跨膜蛋白，主要由α-螺旋及不规则卷曲构成；亚细胞定位分析表明，CDS1蛋白主要分布于内质网和线粒体；蛋白互作分析表明，其与PGS1、PPAPDC1系列、CDIPT、PLD系列、CRLS1等与磷脂合成相关的核糖蛋白存在相互作用，提示CDS1基因参与调节磷脂的合成代谢过程；组织表达分析表明，CDS1基因在各个组织均有广泛表达，且在睾丸中表达量最高，在脑的表达水平也较高，二者均显著高于其他组织的表达水平，在心的表达量最低。     

百合LdGASA1基因克隆与生物信息学及表达分析

本研究从百合小鳞茎发育不同阶段蛋白质组数据中,筛选出调控鳞茎发育的上调表达基因LdGASA1,对其进行克隆、生物信息学分析及表达分析。序列分析显示LdGASA1基因全长725 bp,编码区CDS序列为336 bp,编码111个氨基酸。结构域分析显示,LdGASA1第52至第111个氨基酸含有一个典型的GASA保守结构域。其理化性质分析显示,编码蛋白质理论等电点(pI)为9.1,不稳定系数为35.14,属于稳定的疏水性蛋白,亚细胞定位预测该蛋白最可能定位在细胞质中,其二级结构主要为无规则卷曲(65.86%)和α-螺旋(22.52%),另外含有少量延伸链(12.60)和β-折叠(9.01%)。通过RT-qPCR分析发现LdGASA1基因在小鳞茎出现前表达量相对较低,主要在小鳞茎形态建成和发育阶段表达,且在小鳞茎形态基本建成(35 d)时表达量达到最高。本研究结果为探索GASA基因调控百合生长发育的机制打下基础。     

油茶CoSAUR32和CoSAUR50基因的克隆及表达分析

本研究以油茶‘华硕’为试验材料,通过PCR克隆获得两个生长素响应SAUR (Small auxin upregulated RNA)基因家族的基因,命名为CoSAUR32和CoSAUR50。CoSAUR32基因开放阅读框(ORF)为372 bp,编码123个氨基酸;CoSAUR50基因开放阅读框(ORF)为318 bp,编码105个氨基酸。序列分析发现CoSAUR32和CoSAUR50蛋白均无信号肽与跨膜结构,在叶绿体和细胞核中均可表达。对其进行同源性比对及进化树分析发现,油茶两个SAUR与茶树SAUR亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,CoSAUR32和CoSAUR50基因在自交授粉子房中36 h时的表达量显著高于异交子房,在自交授粉花柱中24 h时的表达量显著高于异交花柱。推测CoSAUR32和CoSAUR50可能参与油茶自交不亲和过程。本研究为挖掘SAUR基因的功能及解析油茶自交不亲和分子机制提供参考依据。     

新疆野扁桃自交不亲和基因SSK1的克隆及生物信息学分析

为了获得新疆野扁桃居群中自交不亲和花粉特异性表达的SSK1基因全长,以新疆野扁桃植物叶片及花粉为试验材料通过rt-PCR技术以及生物测序等技术,克隆得到了一个新的SSK1基因全长c DNA,Pet SSK1。Pet SSK1全长为602 bp,开放阅读框为534 bp,共编码了177个氨基酸,经生物信息学分析,Pet SSK1蛋白的分子式为C910H1421N233O295S6,相对分子质量为20538.0,理论推导半衰期为30 h,等电点为4.52,不稳定指数为41.48,平均疏水指数为-0.567,Pet SSK1蛋白属于水溶性不稳定蛋白。首次从新疆野扁桃植株中克隆得到了SSK1基因全长。通过对该基因的克隆及序列分析,为今后的表达分析以及有效利用该基因获得自交亲和植株奠定了基础。     

蓖麻类钙调蛋白基因RcCML42克隆与表达载体构建

为了探究类钙调蛋白基因家族成员在蓖麻体内的作用及表达模式，在蓖麻体内挖掘家族基因CML42,并对其进行克隆与表达分析。以哲蓖三号植株为试验材料，克隆获得RcCML42完整编码区序列(CDS),利用生物信息学方法对RcCML42基因序列进行分析，包括编码氨基酸、蛋白分子量及等电点、跨膜结构域、氨基酸序列一致性等内容。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术，检测RcCML42基因在蓖麻植株根、茎、叶位置不同时间点的特异性表达情况。结果显示，RcCML42 CDS长度为597 bp,编码198个氨基酸，含有3个EF-hand钙结合结构域。蛋白分子量为22.27 ku,等电点为4.55,不存在跨膜结构域。氨基酸序列一致性分析表明，RcCML42与巴西橡胶树一致性最高，达86.84%。qRT-PCR结果显示，RcCML42基因在蓖麻根、茎、叶组织中均有表达，在经NaCl处理后，RcCML42在根中的表达量呈现先下降后上升的趋势。RcCML42在茎中12 h高度表达，在叶中为8 h高度表达。且在茎中的表达量显著高于其在根、叶中的表达。CML是植物体内最重要的一类钙感受器，通过与钙调素结合蛋白结合...     

牦牛、犏牛TB-RBP基因克隆及在睾丸组织中的表达

牦牛与普通牛的种间杂种犏牛雄性不育机理一直是畜牧科学研究的热点之一,对牦牛、犏牛睾丸组织特异表达基因的比对分析,可为犏牛雄性不育分子调控机制提供基因参考。通过对牦牛及杂种犏牛TB-RBP基因进行克隆,并利用实时荧光定量PCR技术对候选基因进行组织表达差异分析。结果表明,克隆获得牦牛TB-RBP基因CDS全序列873 bp,犏牛TB-RBP基因部分CDS区序列587 bp;系统进化树显示不同物种TB-RBP基因编码区序列高度保守,遗传相似性较高;蛋白功能预测TB-RBP蛋白属于Translin结合蛋白家族,对精子发生等生物过程具有重要调控作用。TB-RBP基因在犏牛和牦牛的睾丸组织中均有表达,TB-RBP基因的表达水平在牦牛与犏牛组间差异显著(0.01P0.05),牦牛显著高于犏牛。TB-RBP基因是精子正常发育的关键基因,而在犏牛睾丸组织中表达量较低,表明犏牛雄性不育与精子发生异常有关,为今后开展TB-RBP基因与犏牛雄性不育的相关分析以及基因定位、表达调控和牦牛分子育种奠定了理论基础。     

胡桃楸激素调控相关JmDELLA基因克隆与表达分析

为探讨胡桃楸激素调控相关JmDELLA基因在花芽性别分化过程中的调控机理,本研究从胡桃楸转录组测序数据库中筛选出与激素调控相关DELLA基因的差异片段,通过PCR扩增技术获得DELLA基因CDS全长序列,命名为JmDELLA (GenBank登录号:400411)。并利用生物信息学软件对JmDELLA基因进行生物信息学分析,利用RT-PCR对胡桃楸不同器官组织进行表达分析。克隆获得JmDELLA基因的CDS序列全长为1 842 bp,编码613个氨基酸,将该基因编码的氨基酸序列比对和聚类分析,结果表明该基因与核桃(Juglans regia)、薄皮山核桃(Carya illinoinensis)、杨梅(Morella rubra)亲缘关系同源性可以达到80%以上。RT-PCR表达分析表明胡桃楸激素调控相关JmDELLA基因在雌、雄花芽中表达量最高,因此推测该基因参与了胡桃楸花芽性别分化的整个过程。该结果为深入解析胡桃楸雌雄异型异熟性别分化的分子调控机理提供理论依据。     

砂藓(Racomitrium canescens)RcRab基因的克隆及生物信息学分析

本研究以砂藓(Racomitrium canescens)为材料,从砂藓干旱处理转录组数据库中筛选获得小G结合蛋白基因Rab的mRNA序列,通过RT-PCR法扩增,得到RcRab基因的CDS序列,并对其进行了生物信息学分析。结果表明,该基因c DNA全长为1171 bp,包含636 bp的开放阅读框,编码211个氨基酸。预测该基因有Rab家族的保守结构域-G结构域。RcRab蛋白分子质量为23.29 kD,理论等电点为5.76,具有亲水性,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。进化树分析表明,RcRab蛋白质与小立碗藓(Physcomitrella patens)Rab蛋白质亲缘关系最近。本研究可为进一步探索RcRab基因在苔藓植物中的抗旱机制提供数据基础。     

棉花GhMGL11基因的克隆和表达分析

为研究陆地棉甲硫氨酸裂解酶(Methionineγ-lyase)基因的结构与功能,本研究以陆地棉中9807叶片为试验材料克隆得到棉花甲硫氨酸裂解酶(Methionineγ-lyase)基因c DNA全长,命名为GhMGL11(Cottongen:Gh_A12G2168)。蛋白序列分析该基因的编码区序列全长1 359 bp,编码452氨基酸;GhMGL11蛋白属于亲水性蛋白,预测含有41个磷酸化位点;亚细胞定位显示位于细胞质,无信号肽。序列比对分析,该基因含有Cys_Met_Meta_PP家族特有的保守结构域Cys_Met_Meta_PP,属于PLP(Pyridoxal phosphate)依赖性氨基转移酶中的一种。系统进化分析,陆地棉GhMGL11蛋白与可可(Theobroma cacao)亲缘关系较近。在陆地棉中发现23个与GhMGL11基因同源的含有Cys_Met_Meta_PP结构域的基因。组织特异性分析,GhMGL11基因在棉花根、茎、叶中均有表达,其中在根中的表达量最高;碱胁迫处理后不同时间内,该基因的表达量先升高后降低,说明该基因表达受碱胁迫影响。     

条锈菌诱导的小麦MBF1转录辅激活因子基因的克隆及其特征分析

应用电子克隆和RT-PCR方法,从小麦叶片中分离出一个条锈菌诱导的编码MBF1基因的cDNA序列,暂被命名为TaMBF1a。TaMBF1a包含一个完整的429 bp的开放阅读框,编码142个氨基酸,具有MBF1保守结构域;小麦TaMBF1a氨基酸序列与水稻OsMBF1相似性达92%,与拟南芥AtMBF1a相似性达80%。TaMBF1a编码的蛋白可能是核蛋白,且该基因在小麦根、茎、叶组织中表达量基本一致。在小麦与条锈菌的亲和、非亲和互作中,TaMBF1a基因均受条锈菌诱导高水平表达,且非亲和组合表达量高于亲和组合。外源植物激素水杨酸、乙烯、脱落酸也可诱导该基因快速上调表达,表明TaMBF1a可能通过水杨酸、乙烯等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应。     

TaRanGAP2在小麦抵抗叶锈菌侵染中的作用

为研究TaRanGAP2在小麦抵抗叶锈菌侵染的HR诱发中的作用,阐明小麦抗叶锈病分子机制,为小麦抗叶锈病育种给予分子水平的指导.以小麦近等基因系TcLr26及其轮回亲本Tc分别与叶锈菌生理小种260组成不亲和组合(TcLr26×260)及亲和组合(Tc×260),生物信息学分析发现,TaRanGAP2的CDS全长为16...     

荔枝SUMO结合酶基因LcSCE1的克隆与表达分析

通过RT-PCR和RACE技术,从荔枝胚性愈伤组织中克隆得到了SUMO结合酶1基因的全长cDNA序列,命名为LcSCE1。LcSCE1 cDNA全长为840 bp,CDS全长483 bp,预测可编码160个氨基酸。生物信息学分析发现:LcSCE1为带负电的亲水不稳定蛋白,没有信号肽和跨膜结构域,进化上,LcSCE1与麻风树SCE1蛋白亲缘关系最近。利用Real-time PCR技术研究了LcSCE1在不同组织部位的表达情况,发现该基因在"元红"荔枝各组织器官中均有表达,在新叶与芽中表达量最高,膨大期果核中该基因的表达量也显著高于成熟果核(p0.01)。此外,本研究还比较了该基因在醮核和正常核中LcSCE1的表达情况,发现它在醮核中的表达量显著高于正常核(p0.01)。本研究结果表明LcSCE1可能在荔枝生长发育及醮核产生过程中发挥着重要作用。     

甘蔗Ca~(2+)/H~+反向运转体基因的克隆与表达分析

CAX(Ca~(2+)/H~+antiporter)是植物细胞膜Ca~(2+)主动运输体系的一个大类。本研究以高粱的CAX1基因(GenBank登录号为XM_002441593)为探针,利用电子克隆并结合RT-PCR技术,获得甘蔗CAX1基因的1条cDNA序列,命名为Sc CAX1(GenBank登录号为KT799799)。生物信息学分析显示,ScCAX1基因全长784 bp,包含1个645 bp的开放阅读框,编码1个214个氨基酸的蛋白质。ScCAX1蛋白被定位于叶绿体类囊体膜,为稳定的疏水性蛋白,不存在信号肽。蛋白二级结构元件多为α-螺旋,具有1个Na_Ca_ex superfamily。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗ScCAX1基因的表达具有组织特异性,在各组织中均表达,但在茎中表达量最低,叶中的表达量最高。在PEG、NaCl、SA、ABA和Me JA胁迫过程中,ScCAX1基因的表达均受到调控。其中ABA、SA和PEG胁迫下表达量上调,均在胁迫24 h达到最大值。SA胁迫24 h的表达量为对照的5.47倍,而ABA胁迫24 h的表达量为对照的3.5倍。NaCl胁迫6 h的表达量达最大值,为对照的2.14倍。推测ScCAX1基因能够响应逆境胁迫,其表达可能与甘蔗的抗盐、抗渗透胁迫性状有关。     

水稻逆境响应蛋白OsSGL的生物信息学分析及原核表达条件优化

水稻OsSGL (Oryza sativa stress tolerance and grain length)基因表达响应多种非生物逆境,参与调控水稻产量及耐旱性。该基因CDS全长768 bp,编码一个包含DUF1645 (Domain of unknown function protein family 1645)结构域的功能蛋白。生物信息学分析预测显示该蛋白分子量为26.73 kD,理论等电点为9.35,为亲水性蛋白且没有跨膜区域,蛋白二级结构中α螺旋占15.69%,β转角占3.14%,延伸链占14.51%,无规则卷曲占66.67%。OsSGL基因CDS序列中稀有密码子的比例高达29.69%,且有多个串联稀有密码子。为进一步在生化水平研究OsSGL蛋白,本研究拟在原核表达系统中大量表达、纯化并鉴定His标签融合表达的OsSGL蛋白。在不改变氨基酸序列的前提下,通过全基因合成技术,根据大肠杆菌密码子偏好性对OsSGL CDS序列进行优化、合成并连接到pET-32a表达载体中;然后将重组质粒pET-32a-OsSGL转化大肠杆菌,经体外表达条件优化大量合成融合His标签表达的OsSGL蛋白。结果显示,OsSGL基因在大肠杆菌中可实现诱导表达,融合蛋白分子质量约为45.7 kD。最优诱导表达温度、时间、IPTG浓度和摇床转速分别为16℃、16 h、0.5 mmol/L和120 r/min。利用His抗体进行Western blotting进一步检测到纯化的His-OsSGL融合蛋白。OsSGL蛋白体外表达体系的建立有利于在生化水平上深入解析OsSGL参与的信号调控通路。     

含CBS结构域的小麦TaCDCP1基因的克隆及其表达分析

利用电子克隆和RT-PCR技术,在本实验室前期构建的非亲和互作的SSH文库基础上,从条锈菌侵染的小麦水原11叶片中首次分离出一个含CBS结构域蛋白的基因,暂命名为TaCDCP1(Triticum aestivum CBS domain containing protein 1)。TaCDCP1包含一个完整的654 bp的开放阅读框,编码217个氨基酸。推测该基因拟编码的蛋白具有2个CBS保守结构域,不含跨膜区且无信号肽,定位在叶绿体基质内;经过同源比对,小麦TaCDCP1氨基酸序列与大麦、水稻和玉米等的同源序列的相似性较高;该基因表达量在小麦叶中显著高于在根和茎中;在小麦与条锈菌的非亲和、亲和组合中,TaCDCP1基因均受到条锈菌诱导,分别在接种后18 h和96 h达到表达高峰,非亲和组合表达量在侵染前期(接种后18~48 h)高于亲和组合,而在侵染后期(接种后96~120 h)低于亲和组合;外源植物激素脱落酸诱导该基因上调表达,苄基腺嘌呤,乙烯,赤霉素,茉莉酸甲酯和水杨酸处理后其表达量在不同程度上受到抑制;TaCDCP1在低温和干旱条件下表达量上升,在机械伤害和高盐处理下表达量无明显差异。表明TaCDCP1可能通过脱落酸等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应,同时参与低温和干旱环境下的信号转导途径。这些结果对于明确CBS结构域的功能以及CBS结构域蛋白尤其是TaCDCP1在小麦与条锈菌互作中的作用奠定了基础。     

甘蓝型油菜磷脂二酰甘油酰基转移酶(BnPDAT1) cDNA的克隆和功能鉴定

磷脂二酰甘油酰基转移酶(phospholipids:diacylglycerol acyltransferase, PDAT1)是植物三酰甘油(triacylglycerol, TAG)合成的关键酶。本文在甘蓝型油菜湘油15号cDNA中克隆到3个PDAT1全长编码序列(coding sequence, CDS), 经比对分别定位于A02、A10、C09染色体, 分别命名为BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和BnPDAT1-C09, 其序列长分别为1998、2002和2005 bp, 各自编码665、666、667个氨基酸。预测BnPDAT1基因编码蛋白定位于细胞质膜, 具有典型的PDAT1保守结构域。多序列比对和进化分析表明BnPDAT1基因编码蛋白与甘蓝、拟南芥、亚麻芥PDAT1蛋白具有较高的同源性。酵母互补实验证实该基因编码蛋白具有PDAT1酶活性。BnPDAT1基因在湘油15号中的表达现先上升后降低趋势, 在开花后25~30 d达最大值, 但3个拷贝的表达变化规律存在差异。     

芸芥中DnaJ同源基因的克隆与表达分析

为研究芸芥自交亲和机理,采用mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)分析技术,从芸芥自交亲和系开花前柱头中获得1条差异片段。测序及DNA序列的生物信息学分析表明,该差异片段与拟南芥DnaJ蛋白同源基因At J3有较高同源性,暂命名为esAtJ3基因。该序列含有一个长度为297 bp的完整开放阅读框,编码98个氨基酸残基,含有一个DnaJ-C保守结构域,属于植物DnaJ超家族。esAtJ3基因编码的蛋白无信号肽,是一个亲水性蛋白,该蛋白主要由不规则卷曲和α螺旋组成。实时荧光定量PCR分析表明,esAtJ3基因在芸芥SC系开花前柱头中表达量较高,初步推测该基因可能参与芸芥亲和性调控。