西瓜花叶病毒2号外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

以郑州地区西瓜花叶病病叶分离物－西瓜花叶病毒２号（２－ＷＭＶ－２）为毒源，从繁殖寄主西葫芦病叶中分离，鉴定了病毒，以病毒基因组ＲＮＡ为模板，逆转录合成ｃＤＮＡ，通过多聚酶链式反应（ＰＣＲ），从ｃＤＮＡ中扩增和克隆了病毒外壳蛋白（ＣＰ）基因，其中包括３’端非编码区，完成了全部核苷酸序列分析，ＣＰ基因全长１０９９个核苷酸，其中编码区长９０３个核苷酸，编码３０１个氨基酸，３’端非编码区长１９６个核苷酸。     

南京市郊番茄病毒病毒原的初步鉴定

从两年（１９８１—１９８２年）四季自南京市郊１１个公社和本所共采集７６３个番茄病毒病标样，测试结果，不论何种栽培方式，春季以Ｔ Ｍ Ｖ为主，占５２．２—５６．９％，Ｃ Ｍ Ｖ占３４．２—３４．６％，秋季以Ｃ Ｍ Ｖ为主，占７４．２一７８．１％，Ｔ Ｍ Ｖ只占１４．４—１５．６％。再从６５份代表毒株在亮黄烟上测定，Ｔ Ｍ Ｖ番茄系占９６．８％，Ｔ Ｍ Ｖ番茄系和烟草系混合感染占３．２％。并以 Ｐ ｅｌｈａｍ ０株系占多数，广泛分布南京市郊，达总标样的７６．９％；Ｐ ｅｌｈａｍ１株系只发生在本所和个别公社的少数大队，占１３．８％， Ｐｅｌｈａｍ２株系仅在本所个别番茄品种上露头，占９．２％；病毒提纯液经电镜观察，病毒粒体呈棒状颗粒。番茄条斑病是南京市郊危害番茄生产的潜在威胁，根据标样分析，以ＴＭＶ和ＣＭＶ单一条斑为主，极少二者的复合感染，ＴＭＶ＋ ＰＶＸ或其他复合感染尚未发现，标样中有３０份表现各式病毒症状的毒株，不明所属，有待今后进一步探讨。     

北京地区番茄病毒病毒原种类的监测与黄瓜花叶病毒株系的鉴定

北京地区番茄病毒病的主要毒原种类有番茄花叶病毒（ＴｏＭＶ）、黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）、马铃薯Ｘ病毒（ＰＶＸ）、马铃薯Ｙ病毒（ＰＶＹ）、烟草蚀纹病毒（ＴＥＶ）和苜蓿花叶病毒（ＡＭＶ），分别占样本的６５．２％、３０．１％、６．８％、２．５％、１．３％和１．２％。保护地及春露地番茄生长前期主要受ＴｏＭＶ的侵染，５月底以后ＣＭＶ的为害显著加重，甚至造成夏番茄绝产。番茄上ＣＭＶ可划分为４个株系，即轻花叶株系、重花叶株系、坏死株系及黄化株系。分别占分离物的２３．５％、６４．７％、５．９％和５．９％。     

猕猴桃成熟果实中脂氧合酶基因的克隆

采用ＰＣＲ扩增方法,从成熟猕猴桃果实组织中克隆到一个８２４ｂｐ的脂氧合酶（ＬＯＸ）基因片段（ｐＫＬＣ１）,该片段含有２７５个氨基酸组成的开放阅读框架,它与拟南芥菜、黄瓜、豌豆、土豆、水稻、大豆、烟草和番茄的核苷酸同源性为５９．０％～７４．６％,氨基酸同源性为６３．１％～７６．３％。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明,ｐＫＬＣ１片段为一低拷贝数基因家族所编码。     

桃果实ACC合酶cDNA的克隆

根据其它植物ＡＣＣ合酶氨基酸保守区设计两组简并引物,用套式ＰＣＲ技术从桃成熟果实ｃＤＮＡ中扩增出１．１ｋｂ大小特异性片段,将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,对重组克隆ｐＰＡＣＳＩ进行全序列测定表明,插入片段全长１１００个碱基,编码３６６个氨基酸,该基因与番茄、笋瓜、小西葫芦、康乃馨、苹果ＡＣＣ合酶ｃＤＮＡ氨基酸序列同源性分别为７２．７％,７１．３％,７１．１％,６９．１％,６５．４％。ＲＮＡ点杂交表明ｐＰＡＣＳＩ基因随着桃果实成熟表达活性增强,乙烯处理能诱导桃果实该基因的表达。     

桃ACC氧化酶基因的克隆和植物表达载体的构建

以‘玉露’桃叶片基因组ＤＮＡ为模板,用ＡＣＣ氧化酶基因特异寡聚核苷酸为引物进行ＰＣＲ扩增,得到１．３ｋｂ左右的扩增产物,将其克隆到ｐＵＣ１９加Ｔ载体上,组建亚克隆并进行序列测定,结果表明,该基因全长有１２８８个碱基,由４个外显子和３个内含子组成。外显子由９５７碱基组成,编码３１９个氨基酸。该基因与桃、番茄、矮牵牛、康乃馨、苹果ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ氨基酸序列同源性分别为９９．３％,８３．０％,７６．８％,７４．０％,７５．０％。ＲＮＡ点杂交表明,该基因在未成熟果实检测不到杂交信号,随着成熟度增加,硬度下降,基因表达增强。将ＡＣＣ氧化酶基因分别正向和反向克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１中,并通过酶切分析,ＰＣＲ和点杂交鉴定重组质粒正确。将重组表达质粒导入根癌农杆菌中,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定证实质粒已被导入。     

金针菇WF菌株深层发酵工艺的研究

金针菇ＷＦ（Ｆｌａｍｍｎｌｉｎａｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）菌株是我们从区内收集和分离的１０个菌株中，经筛选获得的一株适合深层发酵的高产优质菌株。本文报道了适宜发酵培养基，摇瓶发酵条件，结果表明，其适宜发酵培养液，玉米２％，蔗糖２％，ＫＨ２ＰＯ４０．３％，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．１５％，适宜的摇瓶发酵条件为：培养温度２０～２２℃，培养基起始ｐＨ６．０～６．２，摇瓶转速１４０～１６０ｒ／ｍｉｎ，菌丝体干收率３．０％（Ｗ／Ｖ）为工业化生产发酵菌丝体准备了良好的条件。     

猕猴桃ACC氧化酶cDNA克隆及全序列测定

从‘秦美’猕猴桃（ＡｃｔｉｎｉｄｉａｄｅｌｉｃｉｏｓａＣ．Ｆ．ＬｉａｎｇｅｔＡ．Ｒ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ．ｃｖ．Ｑｉｎｍｅｉ）呼吸高峰跃变初期的果实中提取总ＲＮＡ，然后纯化得ｍＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）作为引物反转录合成ｃＤＮＡ第一链，以此为模板，用人工合成的寡聚核苷酸作为引物进行扩增，得到大小约０．９５Ｋｂ基因片段，并将其克隆到ｐＧＥＭ－５ｚｆ（＋）载体上。经限制性内切酶图谱分析，组建亚克隆并进行了全序列测定，在其开放读码框架内，由９５７个ｂｐ编码３１９个氨基酸组成，该ｃＤＮＡ与海沃德ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ的核苷酸和氨基酸残基同源率分别达９５．０１％和９５．６１％，证明己克隆到完整的秦美猕猴桃ＡＣＣ氧化酶基因编码区。     

姬松茸菌丝深层培养及氨基酸分析研究

姬松茸（ＡｇａｒｉｃｕｓｂｌａｚｅｉＭｕｒｉｌ）是一种美味的食用兼保健的食用菌。本文探讨姬松茸深层培养的条件并对菌丝体氨基酸组成进行分析。试验结果表明：选用３％玉米淀粉、２％蔗糖、０．５％酵母粉、０．３％ＨＫ２ＰＯ４、０．３％ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／１００ｍｌＶＢ１的发酵培养基，在ｐＨ５～６的条件下发酵７天，菌丝体生长最佳。经测定菌丝体氨基酸含量丰富，且种类具全     

栽培甜菜（BetavulgarisL.）和白花甜菜（B.corolliflora Zoss）种间杂…

栽培甜菜Ｂ．ｖｕｌ．ｇａｒｉｓ Ｌ．，ＰＴ６，２ｎ＝１９）与白花甜菜（Ｂ．ｃｏｒｏｌｌｉｆｌｏｒａＺｏｓｓ．，２ｎ＝３６）杂交获得ＶＣ８８－１杂种Ｆ１，其染色体组为ＶＶＣＣ，２ｎ－３６．ＶＣ８８－１类似于异源多倍体，减数分裂基本正常，以其为母本与栽培甜菜（２ｎ＝１８）回交，或与其它物种如Ｂ．ｍａｒｉｔｉｍａＬ．杂交，皆获大量后代（Ｂ１０，Ｂ１４等），其染色体组为ＶＭＣ，ＶＶＣ等，２ｎ＝２７．以Ｂ１     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析

将来自北京地区甘蓝和芥菜上的TuMV外壳蛋白基因片段分别克隆到pMD18-T载体中,测序并进行序列分析。结果表明:两者CP基因序列长度均为867个核苷酸,编码288个氨基酸,它们的核苷酸同源性为97·2%,氨基酸同源性为97.6%;两者与GenBank中的部分CP基因序列的核苷酸同源性在87.8%~97.8%之间,氨基酸同源性在91.7%~99.0%之间;分子进化树分析两者可归属World-B组。     

部分蔬菜CMV分离物CP基因的克隆及序列分析

 对来自国内不同地区、不同蔬菜作物上的8个黄瓜花叶病毒分离物, 采用一步法RT-PCR扩增得到CP基因全长片段, 分别克隆到pMD-18T载体并测序。结果表明, 本研究8个分离物的CP基因均为657个碱基, 可编码218个氨基酸, 它们之间的核苷酸序列同源性较高, 达92.8% ～99.1%; 将它们与GenBank中部分CMV CP基因序列比较, 显示出与CMV亚组Ⅰ株系的核苷酸序列同源性达90.7%～98.0%, 而与亚组Ⅱ株系的核苷酸序列同源性仅有75.8%～78.1%。因此, 这8个分离物应归属于CMV亚组Ⅰ。     

苹果茎沟病毒KRL-1分离物外壳蛋白基因序列测定

以KRL-1(库尔勒香梨分离物)总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增外壳蛋白(CP)基因的cDNA片段,将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定,分析结果表明:KRL-1CP基因由714个核苷酸组成,编码237个氨基酸。KRL-1与ASGV其它分离物CP基因的核苷酸同源性为90%-93%,氨基酸同源性为94%-98%。根据KRL-1与其他分离物CP基因序列和生物学症状上的差异,可推断KRL-1存在较大的分子变异。     

侵染白菜的黄瓜花叶病毒分离物基因组的全序列分析

对浙江省杭州地区白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. commuis Tsen et Lee.）上获得的CMV分离物（CMV-CTL）进行了全长克隆和基因组序列分析。结果显示：CMV-CTL的RNA1（GenBank序列号：EF213023）全长为3357个核苷酸（nt）,编码993个氨基酸（aa）的1a蛋白;RNA2 （GenBank序列号：EF213024）全长为3047 nt ,编码858 aa的2a蛋白和111 aa的2b蛋白;RNA3 （GenBank序列号：EF213025）全长为2217 nt,编码278 aa的MP蛋白和218 aa的CP蛋白。序列相似性分析表明,CMV-CTL与CMV亚组IB中株系IA相似性最高,RNA 1、RNA 2和RNA3与该株系的相似性分别为91.3%、91.3%和93.6%。CP基因和RNA 3 的5' NTR核酸序列系统发生树分析表明,CMV-CTL与中国大多数CMV分离物一样,属于CMV亚组IB。     

马铃薯Y 病毒河北分离物外壳蛋白基因序列分析和株系鉴定

 对河北张家口感病马铃薯的一个马铃薯Y病毒分离物( PXY-HBEI) 的外壳蛋白基因进行了克隆和序列分析。以提取的RNA为模板, 应用RT-PCR扩增目的基因, 扩增产物克隆到质粒pGEM-T, 上并序列分析。结果表明, 克隆cDNA片段由801个核苷酸组成, 编码267个氨基酸。与基因库中PVY代表株系相比, 它们的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.6%～98.8%和93.3% ～98.5% , 与PVYN 和PVYO株系的氨基酸序列同源性分别为93.6%和97.8% , 确定PVY-HBEI归属于普通株系( PVYO株系) , 同时建立了快速、灵敏、简便的PVY RT-PCR检测方法。     

番茄环斑病毒悬钩子分离物复制酶基因的克隆及序列分析

番茄环斑病毒(ToRSV)是一种高风险的检疫性有害生物,可侵染桃、李、葡萄、苹果、樱桃等多种植物。2000—2001年,我国从法国进口的葡萄插条上检出过此病毒。以ToRSV悬钩子分离物(Rasp-2)总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增病毒复制酶基因(RdRp)的cDNA片断并将其克隆到pMD18-T载体上。序列测定结果表明,Rasp-2RdRp基因由2133个核苷酸组成,编码711个氨基酸;Rasp-2半胱氨酸蛋白酶和RdRp之间的蛋白酶切割位点为Q/V。Rasp-2与其他分离物及株系RdRp基因的核苷酸序列同源性为79%～84%,氨基酸序列同源性为89%～94%。聚类分析结果显示,葡萄黄脉株系(GYV)与其他分离物及株系关系最远,Rasp-2与其他分离物及株系亲缘关系较近。证实Rasp-2与另外2个悬钩子分离物Rasp和Rasp-1的核苷酸序列存在明显变异。     

感染北京地区大葱的胡葱黄条病毒外壳蛋白基因的克隆及分析

以感染胡葱黄条病毒（Shallot yellow stripe virus,SYSV）的大葱为材料,通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）获得包含SYSV-CP全部编码序列、NIb蛋白基因5′端的部分序列和3′UTR的2个基因片段,分别命名为SYSV-CP1和SYSV-CP2,它们的编码区碱基数均为774 bp,均编码258个氨基酸|在该编码区内存在2个碱基的差异,编码的蛋白存在1个氨基酸的差异。系统进化树分析表明：SYSV分离物可以区分为两个主要群体,SYSV-CP1和SYSV-CP2位于第Ⅱ组内,它们与来自浙江的SYSV的分离物亲缘关系最近,表现出一定的地理分布相关性。     

Cloning and sequencing of encoding region of heme oxygenase-1 gene from Tibetan antelope

AIM: To clone and analyze the encoding region of heme oxygenase-1(HO-1) gene from Tibetan antelope(Pantholops hodgsonii). METHODS:The total RNA was isolated from the liver of Tibetan antelope and the HO-1 gene was amplified by RT-PCR. The PCR product was cloned into pGEM-T vector and sequenced. The nucleotide sequences were compared with the data from GenBank by BLAST method. RESULTS:The encoding region of HO-1 gene from Tibetan antelope was obtained and deposited in GenBank as accession number JQ809687. The encoding sequence was 897 bp in full length, which encoded 298 amino acids. Sequence similarity analysis showed that the HO-1 gene cloned from Tibetan antelope shared 98% and 96% in the nucleotides, and shared 92% and 97% in the amino acids with those of Capra hircusand Bos taurus, respectively. The sequence similarity of nucleotides and amino acids also shared 86% and 87% with other vertebrates, which were highly conservative. The molecular phylogenetic tree based on the amino sequence of HO-1 showed that Tibetan antelope and Capra hircus was classified to one cluster, which was basically concerted to the evolutionary relationship of traditional species. CONCLUSION:The encoding region of Tibetan antelope HO-1 gene is successfully cloned, which provides a foundation for exploring the molecular and biological mechanisms of high altitude adaptation and cell protection in Qinghai-Tibet Plateau species under hypoxic condition.     

莲藕GBSS基因cDNA全长的克隆与序列分析

采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到全长为2265bp的莲藕＂美人红＂品种的GBSS基因的cDNA序列（GenBank登录号EU938541）,其中开放阅读框（ORF）长为1848bp,共编码615个氨基酸。用DNAman软件比对,莲藕GBSS基因cDNA与金鱼草（AJ006293）、马铃薯（EU403426）、大豆（EF153101）、水稻（EU735072）Wx基因cDNA序列的同源性分别达61.2%、59.6%、64.2%、50.6%。对该基因编码的氨基酸序列进行Blastp分析发现,该序列与金鱼草的序列同源性最高,达到77%,与马铃薯、甘薯的同源性达到75%,与豆科植物的同源性在70%～75%,与禾本科植物的同源性在65%～70%。     

甜菜BvCK2基因全长cDNA的克隆和序列分析

甜菜M14品系在细胞胚胎学和遗传学特征上具有鲜明的无融合生殖现象。为了寻找在这一特殊的生殖过程中的相关基因及其调控作用．实验通过同源克隆及cDNA末端快速扩增（RACE）的方法,首次从甜菜M14品系中克隆了与生殖相关的基因ByCK2（Beta vulgaris casein kinase2）的全长cDNA序列．长度为1501bp,开放阅读框为1002bp,编码333个氨基酸。根据氨基酸序列计算蛋白分子量为39．28kDa,pI=8．16。同源比对表明,ByCK2与烟草CK2（Ge．nBankNo．A1437635）的相似度为64.22％,与百合CK2（GenBankNo．AF517838）的相似度为65．18％。通过细胞内定位分析．ByCK2所编码的蛋白主要存在于细胞核中。