间接免疫酶组织化学法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒感染和抗原定位

以蔗糖密度梯度离心法提纯的猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）病毒SC1株作为抗原,免疫家兔制备兔抗PRRS病毒IgG,成功建立了检测PRRS病毒抗原的间接免疫酶组织化学法。该方法只与PRRS病毒感染猪组织呈现阳性反应,与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪乙脑病毒人工感染并致死仔猪的肝脏组织呈现阴性反应。用该方法检测PRRS SC-1株人工感染28日龄仔猪,在感染后7 d即可在肺门淋巴结、胸腺、扁桃体、十二指肠、肺、大脑和肾脏检测到PRRS病毒抗原。PRRS病毒抗原主要分布于胸腺和十二指肠感染细胞的胞浆内、肺门淋巴结小梁周围的淋巴窦和弥散的淋巴组织、扁桃体淋巴结的隐窝及其周边。该法具有特异、直观和敏感的特点,可用于PRRS病毒感染的实验室诊断、抗原定位及甲醛固定样本的回顾性诊断。     

不同毒力猪繁殖与呼吸综合征病毒对仔猪肺和外周免疫器官损伤的研究

为研究不同毒力的PRRSV对仔猪肺脏和外周免疫器官损伤的差异,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4株)和PRRSV经典株(CH-1a株)感染35日龄健康的断奶仔猪,并在感染后0 d、3 d、7 d、10 d和14 d各迫杀3头,检测肺、颌下淋巴结、肠系淋巴结、腹股沟淋巴结、扁桃体和脾脏的病毒载量及病理变化情况,同时检测血清中抗PRRSV的抗体水平。结果表明:感染后3 d肺脏及各免疫器官可检测到病毒,HuN4感染组病毒载量比CH-1a感染组病毒载量高1 000倍;HuN4感染组病毒载量峰值出现在感染后10 d,而CH-1a感染组维持着较低水平的病毒载量。组织病理学检测显示HuN4感染组淋巴结内淋巴细胞显著减少,呈空泡状;CH-1a感染组淋巴结内淋巴细胞轻度减少,呈星隙状。本实验表明HuN4株比CH-1a株对肺和外周免疫器官造成更严重的损伤。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SJ株(天津分离株)感染仔猪的病理学

选用10～15日龄健康仔猪20头，随机分为攻毒组（15头）与对照组（5头），攻毒组滴鼻接种猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）SJ株，3mL／头；对照组滴鼻接种无PRRSV的细胞培养物，3mL／头。攻毒组的主要临床表现为眼睑水肿、打喷嚏、呼吸急促、嗜睡、体温略升高。攻毒组与对照组在试验开始后24h、7d、14d、21d、28d分别剖杀3头和1头仔猪，采集肺、脾、肾、扁桃体及各部位淋巴结作免疫组化及病理组织学观察；迅速采集肺组织，制作超薄切片，透射电镜观察。试验结果表明，PRRSV SJ株主要感染仔猪的肺脏与脾脏。免疫组化观察，攻毒后24h～7d，肺门淋巴结和扁桃体PRRSV抗原阳性反应最强；攻毒后14～28d，牌睦PRRSV抗原阳性反应最强。攻毒后14～28d，显微病变可见肺组织发生弥漫性、局灶性或间质性肺炎，肺泡隔因巨噬细胞、淋巴细胞及Ⅱ型上皮细胞增生而明显增厚。超微病变主要表现为，肺泡间隔中单核细胞增生，核孔消失，核内有异染色质聚集，Ⅱ型肺泡细胞高度变性等。     

PRRSV感染致断奶仔猪肺脏和外周免疫器官的病理损伤

用PRRSV ATCC VR-2332株感染8头28日龄仔猪,同时设立2头健康对照猪.PRRSV单独感染猪分别于感染后7,17,25 d各剖杀2,3,3头,对照组于17,25 d各剖杀1头.剖杀后采集脾脏、肺脏和全身主要淋巴结(颌下淋巴结、肺门淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结)等免疫器官,用甲醛溶液固定,组织石蜡切片以观察显微病理变化.试验组猪的抗体和抗原检测结果均表明,感染后7 d血清PRRSV抗体和免疫器官组织PRRSV抗原部分呈阳性;剖检和石蜡切片结果均显示,试验猪于攻毒后,随着病程的发展,发生了不同程度的间质性肺炎及相应的显微病变,PRRSV单独感染能引起免疫器官以淋巴细胞及巨噬细胞变性坏死为特征的急性炎症变化,造成免疫损伤,进而引起免疫抑制.     

应用灭光定量RT-PCR方法检测PRRSV变异株在仔猪体内动态分布

为进一步了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株(HuN4株)在体内的动态分布规律和特点,探讨病毒对组织器官的嗜性,本研究将HuN4株和细胞传代致弱毒株HuN4-F65人工感染40日龄健康仔猪,分别于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d和28 d各迫杀2头,并应用建立的荧光定量RT-PCR方法对脑、颌下淋巴结、扁桃体、肺脏、肝脏和十二指肠等组织及血清中的PRRSV进行定量检测.结果显示:感染后HuN4组各器官病毒载量比HuN4-F65组高100倍,病毒栽量峰值期出现在感染后7 d,随后呈下降趋势.HuN4株在仔猪体内分布广泛,在21 d的试验期内持续存在,并且各器官的病毒载量呈正态分布规律;而HuN4-F65株血清病毒载量较低,并且集中在单核巨噬细胞相对密集的扁桃体和颌下淋巴结,与HuN4株主要嗜性器官肺脏相比发生了改变.     

寡核苷酸探针原位检测石蜡切片中PRRSV核酸

根据GenBank收录的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCCVR-2332株ORF6和ORF7基因序列，用O1igo软件设计并合成大小为37bp的寡核苷酸探针，经生物素标记后，成功建立了原住检测石蜡组织切片中PRRSV核酸的方法。该探针能检测到56PgPRRSV核酸的RT—PCR产物DNA，能特异检测出PRRSV核酸及其PCR产物，而对猪瘟病毒（HCV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪乙脑病毒（JEV）的核酸呈阴性反应。应用该方法检测PRRSVSC-1株人工感染的28日龄仔猪，在感染后7d即可在肺脏、肾脏、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、十二指肠和大脑检测到PRRSV核酸。该法可用于仔猪PRRSV感染的诊断和组织中核酸的定位及分布研究，也可用于甲醛固定组织的回顾性诊断。     

免疫组化法检测猪圆环病毒2型在人工感染猪体内的分布

将猪圆环病毒2型（PCV2）BF株经滴鼻接种28日龄健康普通仔猪,于接种后不同时间剖杀,采集相关的器官组织制备组织切片,使用免疫组化方法检测病毒在猪体内的分布。结果显示,淋巴结、脾脏、扁桃体等淋巴组织均出现阳性信号,心、肝、肺、肾、胃、十二指肠、大脑及小脑同样存在阳性细胞,其他组织呈阴性反应。阳性信号主要位于感染细胞的胞质中,偶尔出现在细胞核内。结果表明,PCV2确已造成猪体组织感染。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸在仔猪呼吸及繁殖系统动态分布的研究

应用针对 PRRSV ATCC VR- 2 332株基因组 ORF6片段的 4 6 3bp的 c DNA探针 ,对 4 5日龄 SPF仔猪分别人工感染 ATCC VR- 2 332株及北京分离株 B96 - 4后不同时间呼吸系统及繁殖系统组织中病毒核酸的分布进行了研究。结果显示 ,在感染后 30 h,即可在鼻黏膜、气管、肺脏、睾丸、附睾、精囊、前列腺、子宫、扁桃体等组织中检出阳性杂交信号 ,且一直持续到感染后 2 8天。其中扁桃体中病毒的数目远多于呼吸系统及繁殖系统组织中的数目 ,说明扁桃体可作为活体检查的目的器官之一     

应用荧光定量RT-PCR方法检测PRRSV变异株在仔猪体内动态分布

为进一步了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株(HuN4株)在体内的动态分布规律和特点,探讨病毒对组织器官的嗜性,本研究将HuN4株和细胞传代致弱毒株HuN4-F65人工感染40日龄健康仔猪,分别于感染后1d、3d、5d、7d、10d、14d、21d和28d各迫杀2头,并应用建立的荧光定量RT-PCR方法对脑、颌下淋巴结、扁桃体、肺脏、肝脏和十二指肠等组织及血清中的PRRSV进行定量检测。结果显示:感染后HuN4组各器官病毒载量比HuN4-F65组高100倍,病毒载量峰值期出现在感染后7d,随后呈下降趋势。HuN4株在仔猪体内分布广泛,在21d的试验期内持续存在,并且各器官的病毒载量呈正态分布规律;而HuN4-F65株血清病毒载量较低,并且集中在单核巨噬细胞相对密集的扁桃体和颌下淋巴结,与HuN4株主要嗜性器官肺脏相比发生了改变。     

1株QX基因型鸡传染性支气管炎病毒的致病性

通过对8日龄SPF鸡人工感染鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QX株发病,分别在攻毒后3,7,30 d剖杀并采集气管、肺、肾、脾、胸腺、法氏囊制作病理组织切片。攻毒7 d后,采集上述器官相同部位进行免疫组织化学法分析。根据IBV-QX株NP基因的保守序列设计引物,构建质粒标准品,建立了IBV-QX Real-time PCR标准曲线,并跟踪检测试验鸡的口腔、泄殖腔排毒情况。此外,观察并记录了2组鸡的临床症状、体质量差异等信息。结果显示,发病初期(3 d),气管、肺几乎无明显病理变化,其他器官均出现不同程度的炎性反应;临床症状明显期(7 d),所涉及的器官均有不同程度的病理变化;发病后期(30 d),气管纤毛有所恢复,肺、脾炎性反应有所减轻,但肾脏和法氏囊的病变依然严重。免疫组织化学法检测到上述器官均有可见抗原聚集。30 d时被感染鸡的口腔、泄殖腔仍可检出病毒核酸。试验鸡临床症状明显,体质量差异显著。本试验旨在探究具有组织嗜性的IBV-QX毒株对宿主的免疫器官和该病毒的主要靶器官的病理损伤以及被损伤器官的自我修复情况,抗原分布差异,排毒规律等,为后续研究宿主免疫器官发挥天然免疫的相关机理打下基础,也为研发新的疫苗、相关药物的临床药效评价、制定合理的疫苗接种策略提供参考。