PrP106-126毒性多肽影响小胶质细胞IL-1β、TNF-α的mRNA表达量变化的研究

体外合成的人PrP106-126毒性多肽具有PrP~(Sc)类似的特性,如富含β折叠,具有部分蛋白酶抗性,可以在脑组织内沉积形成淀粉样斑块等等.因此PrP106-126可作为替代PrP~(Sc)研究TSE发病机制的理想模型.PrP106-126对神经元的损伤作用可能主要通过两种途径:一方面它可与神经元表面的相关受体相结合通过信号转导途径直接对神经元造成损伤,另一方面它可激活小胶质细胞产生炎性介质或NO等毒性物质间接引起神经元凋亡.激活的小胶质细胞主要产生IL-1β、TNF-α两种炎性介质,这两种细胞因子的持续产生可致使神经元凋亡.本研究旨在对PrP106-126多肽作用小胶质细胞过程中,IL-1β、TNF-α的mRNA表达量随时间变化的规律,为阐明TSE发病过程中,小胶质细胞促进神经元凋亡的作用机制提供基础数据,并为一定程度上抑制小胶质细胞激活,减轻其对神经元的损伤作用奠定理论基础.     

PrP106—126诱导小胶质细胞BV-2抗氧化性能的变化

小胶质细胞活化是朊病的病理学特征之一。朊蛋白多肽PrP106—126具神经毒性,是研究异常腕蛋白（PrPSc）的理想工具。为探讨PrP106—126对小胶质细胞氧化压力的影响。本研究以小胶质细胞BV-2为细胞模型,PrP106—126作用48h,应用MTT和流式细胞仪检测细胞的活化情况,应用分子探针技术对细胞的氧化压力（reactiveoxygenspecies,ROs）进行检测,并通过荧光定量RT—PCR对与R0s相关的酶的mRNA表达进行了测定。结果表明PrPl06—126显著促进小胶质细胞BV-2的活化,并提高胞内的ROS水平;定量RT—PCR显示,PrP106—126显著降低细胞S0D-1（P〈0．01）表达水平、提高胞内Cat（P〈0．01）的表达水平;对Grx、Trx-1、和Trx-2mRNA的表达水平有升高的趋势,但未达到显著水平（P〉0．05）,对SOd-2、GPx、GR无显著性影响（P〉0．05）。从分子水平初步阐明小胶质细胞ROS升高的机理。     

PrP106-126对大脑皮质神经元和星形胶质细胞朊蛋白基因表达的影响

采用实时荧光定量RT-PCR的方法,对PrP106-126处理的大脑皮质神经元和星形胶质细胞模型进行了朊蛋白基因表达相对定量的研究。大脑皮质神经元经PrP106-126处理后,与SCR处理组和对照组相比,基因表达量明显下降。PrP106-126处理的星形胶质细胞与对照组和SCR处理组相比,朊蛋白基因的表达量显著升高。该试验结果为深入了解TSEs的分子致病机制和正常朊蛋白的功能提供了基础数据。     

REST缓解由PrP106-126毒性多肽诱导的原代神经元突触和神经纤维的损伤

为了检测REST蛋白过表达或干扰对由PrP106-126毒性多肽引起的原代神经元纤维的影响,本试验通过免疫荧光技术和免疫印迹方法分别检测受PrP106-126刺激后的原代神经元中REST表达的变化情况。通过脂质体转染方法将已经构建好的pCMV-HA-REST质粒转染进入原代神经元,或利用靶向REST的小干扰siRNA技术干扰原代神经元中REST蛋白的表达。用PrP106-126毒性多肽刺激转染了REST过表达或干扰质粒的原代神经元,利用免疫印迹检测突触后蛋白PSD-95的变化情况;利用免疫荧光观察突触后蛋白和神经纤维的损伤情况。结果显示,受到多肽刺激后,REST从神经元的胞浆向胞核转移的同时表达量也逐渐增加,24h时达到顶峰,之后缓慢减少。生理情况下,过表达REST促进突触后蛋白PSD-95的表达;病理情况下,REST的过表达减轻由毒性多肽引起的突触损伤、神经纤维断裂。相应地,干扰REST后,加剧毒性多肽对神经纤维的损伤。结果表明,REST蛋白的过表达缓解PrP106-126毒性多肽对原代神经细胞造成的病理性损伤,为进一步阐释REST对朊病毒及相关神经退行性疾病引起的病理性损伤的治疗作用和神经保护机制提供了理论依据。     

Fe~(3+)与PrP106-126共同诱导下N2a细胞的氧化应激状态

利用PrP106-126多肽的神经毒性,结合Fe3+对细胞氧化应激可能的诱导作用,建立N2a细胞的氧化应激模型,以研究氧化应激在Prion疾病过程中的作用,及其诱导神经细胞退行性损伤的机制。试验表明,通过毒性多肽PrP106-126与Fe3+共同作用,模拟神经细胞的氧化应激状态是可行的。效果较佳的攻毒浓度和攻毒时间分别是不高于50μmol/L的毒性PrP106-126多肽,不高于500μmol/L的Fe3+,最佳攻毒时间为12h。     

REST缓解由PrP106-126毒性多肽诱导的原代神经元死亡

为检测神经元限制性沉默因子(REST)蛋白过表达或干扰对由PrP106-126毒性多肽引起的原代神经元死亡的影响,首先通过脂质体转染法将已经构建好的pCMV-HA-REST质粒转染原代神经元,或利用靶向REST的小干扰siRNA技术干扰原代神经元中REST蛋白的表达。用PrP106-126毒性多肽刺激构建好的REST过表达或干扰的原代神经元,利用Annexin V-FITC试剂盒检测细胞活性;利用TUNEL和Hoechest试剂盒,在激光共聚焦显微镜下直接观察细胞凋亡情况;在透射电镜下观察原代神经元亚细胞结构的变化和损伤情况;使用JC-1线粒体膜电位试剂盒检测线粒体膜电位的改变,同时检测凋亡相关蛋白FOXO1、细胞色素C以及Caspase-3的变化情况。结果显示,受到多肽刺激后,REST的过表达可减轻由毒性多肽引起的神经元死亡、神经元空泡化、细胞器损伤,抑制线粒体膜电位的改变,维持促存活蛋白FOXO1的表达,阻止线粒体向胞浆中释放细胞色素C以及Caspase-3的激活。相应地,干扰REST后,可加剧毒性多肽对神经元的损伤并抑制FOXO1的表达。这表明REST蛋白的过表达可缓解由PrP106-126毒性多肽引起的神经元死亡,对神经元起保护作用,为进一步阐释REST对朊病毒及相关神经退行性疾病引起的病理性损伤的治疗作用和神经保护机制提供依据。     

PrP106-126诱导的N2a细胞神经毒性中神经营养因子受体p75NTR的表达变化研究

神经元死亡是朊病毒病的主要病理学特征。朊蛋白多肽PrP106-126能够对神经细胞表现神经毒性,引起细胞凋亡。细胞表面蛋白神经营养因子受体p75^NTR的胞外区域可以与PrP106-126结合并产生促凋亡作用。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用荧光定量RT-PCR和Western Blot技术,以及DNA Ladder和AnnexinV-FITC/PI双重染色流式细胞凋亡检测技术对p75^NTR介导的PrP106-126神经毒性分子机制进行了研究。结果发现在PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡过程中,p75^NTR的mRNA转录水平和蛋白表达水平均显著升高,以p75^NTR多克隆抗体sc-6189阻断PrP 106-126与p75^NTR的相互作用后,减弱了PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡效果。该研究揭示了PrP106-126诱导的N2a细胞毒性中p75^NTR受体的表达变化,为解释朊病毒病的发病机制提供了重要数据。     

PrP106-126诱导的小鼠成神经瘤N2a细胞NF-κB激活及神经毒性研究

PrP106-126诱导的神经毒性机制仍不清楚。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用WesternBlot方法首次发现PrP106-126导致核转录因子NF-κB的亚单位p65蛋白转移到细胞核内,激活了NF-κB细胞信号分子。转核抑制剂NF-κB SN50预处理细胞减弱了PrP106-126诱导的NF-κB激活程度;并且DNA Ladder凋亡检测及Annexin V-FITC和PI双染流式细胞凋亡检测发现,NF-κB SN50能够抑制p65蛋白转核,在一定程度上也抑制了PrP106-126对N2a细胞的神经毒性效果。结果表明NF-κB信号分子参与了PrP106-126的神经毒性,且NF-κB信号分子的激活对N2a细胞具有促凋亡作用。PrP106-126激活N2a细胞NF-κB信号分子以及NF-κB促凋亡功能的体外研究对于阐明朊病毒病致病机理具有重要意义。     

rhEPO对缺糖缺氧大鼠星形胶质细胞GLT-1和GLAST表达的影响

为了研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)对缺糖缺氧(OGD)培养大鼠星形胶质细胞GLT-1和GLAST表达的影响,将缺糖缺氧培养星形胶质细胞分成不同浓度rhEPO处理组:0、20、100U/mL,不同浓度rhEPO与星形胶质细胞在缺氧缺糖条件下培养6h,用RT-PCR测定GLT-1和GLAST的mRNA表达变化,免疫印迹技术测定GLT-1和GLAST蛋白的表达变化。20、100U/mL rhEPO星形胶质细胞GLT-1的mRNA和蛋白质水平较OGD对照组明显升高(P0.05),GLAST的mRNA和蛋白质水平变化不明显(P0.05)。GLT-1水平可能与rhEPO对缺糖缺氧培养大鼠星形胶质细胞的保护作用有关。     

多肽PrP106-126对小脑颗粒神经元凋亡相关基因表达的影响

试验旨在研究多肽PrP106-126对小脑颗粒神经元凋亡相关基因表达的影响。本研究利用多肽PrP106-126作用于小脑颗粒神经细胞,对该多肽影响小脑颗粒神经细胞凋亡基因的表达进行了检测。结果表明:bax、caspase-3和myc基因在PrP106-126多肽作用后表达显著增加,而bcl-2基因表达明显下降,进一步验证了bax、caspase-3和myc基因具有诱导凋亡作用,而bcl-2基因则具有抑制凋亡作用。     

朊蛋白多肽PrP 106-126对N2a细胞活性及PrP mRNA表达的影响

朊病(prion disease)是由正常细胞朊蛋白PrPC错误折叠成异常朊蛋白(朊病毒)引起的.朊病毒的神经致病性在病理学上表现为神经元空泡化、神经元丧失和胶质增生等.     

朊蛋白在宁夏滩羊不同组织中表达的免疫组化研究

作者运用免疫组织化学技术,首次对我国一类保护物种宁夏滩羊各组织中朊蛋白(PrP)的分布进行定性、定位研究。结果显示,PrP在滩羊的大脑、脑干、小脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏及淋巴结均有表达,尤其在脾脏、肾脏、脑干、淋巴结中的表达量丰富,而肺脏检测结果为阴性。此研究确定了朊蛋白在滩羊各组织中的表达与分布状况,并优化了朊蛋白检测的技术条件,为羊痒病的诊断与检测提供技术支持。     

高温对肉鸡血浆纤维连接蛋白及血清生化指标的影响

将39日龄肉鸡置于42℃高温环境中3h,分别在热应激后,4、28、52h采血检测血浆纤维边疆蛋白（FN）和某些血清生化指标（血糖、尿酸、总蛋白、胆固醇、谷草转氨酶、T3、T4）的变化,以研究高温对肉鸡生理、代谢等方面的影响及寻找判断应激的指标。结果表明,血浆FN浓度在高温刺激后28h明显高于对照组;血清谷草转氨酶活性在28、52h后明显比对照组高;总蛋白、白蛋白在4h后明显比对照组低;其他血清生化指标在高温刺激下均无显著变化。提示高温可引起肉鸡急性期蛋白--纤维连接蛋白的变化。