猪囊尾蚴抗原基因Ts11的克隆及其在大肠杆菌的表达

PCR扩增重组噬菌体λTs11克隆的cDNA片段,与pUC18连接,得到的重组子用以测序,并进行同源性比较分析,将该片段克隆到原核表达载体pGEX-1λT中,免疫印迹筛选得到能正确表达该片段的重组子,制备该和理组子在大肠杆菌中的表达产物,进行浓度梯度SDS-PAGE和West-ern blotting分析,结果表明Ts11 cDNA片段为522 ,编码含139个氨基酸残基的多肽,在Gen-Bank和EMBL数据库均未发现同源序列,重组质粒在大肠杆菌中表达的融合蛋白分子量为41KD,能与免抗猪囊尾蚴囊液血清产生很强的免疫反应,这些结果证实分离到一个新的编码具有较强免疫原性猪囊尾缦抗原的 DNA克隆..λλ     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因的克隆、表达及纯化

利用RT-PCR技术克隆了猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts882蛋白基因,测序结果表明：序列长度为270bp,包含258bp的编码区,编码85个氨基酸,与GenBank中西班牙分离株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为99％;将该基因成熟肽部分亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导后,进行SDS-PAGE初步分析,在34ku位置有1条蛋白条带,与预期结果一致。通过GST亲和纯化获得了较高纯度的重组融合蛋白,Westernblot结果表明,纯化后的重组融合蛋白可与兔抗全囊囊尾蚴血清发生特异性反应。排泄分泌抗原Ts882的成功表达、纯化为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。     

猪囊尾蚴B抗原的克隆及鉴定

本实验从猪囊尾蚴虫体中提取 Ｒ Ｎ Ａ, 根据已发表的 Ｂ 抗原（ Ａｇ Ｂ） 核苷酸序列设计一对引物, 用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增出 Ａｇ Ｂ 全基因, 以ｐ Ｕ Ｃ１１９ 为载体克隆, 转化到大肠杆菌 Ｊ Ｍ８３ 中, 经分析鉴定所扩增片段为 Ａｇ Ｂ 基因。     

猪囊尾蚴抗原基因TS11的真核表达研究

将猪囊尾蚴抗原基因TS11亚克隆至VRl020真核表达载体中，用菌落原位杂交法筛选重组质粒，将其转染COS7细胞，以Northern Blotting检测插入片段的转录；用ELISA检查其翻译表达产物。结果表明：VTS11在真核细胞中能够转录TS11基因的mRNA；其蛋白表达产物能为兔抗猪囊虫高免血清所识别，在转染真核细胞24h后，即可检测到正确表达的猪囊尾勘抗原蛋白。这些为深入研制猪囊虫的DNA疫苗奠定了可靠的基础。     

猪白细胞介素-4基因的克隆与表达

利用RT-PCR技术,从被刺激诱导的PBMC中克隆IL-4基因,序列分析表明:克隆的猪IL-4基因序列与GenBank上登录的IL-4基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99%和97.8%.然后用表达型引物从T载体上扩增IL-4基因,双酶切PCR产物后与表达载体pGEX连接,构建重组表达质粒pGEX-IL-4,用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达出38 ku融合蛋白,占菌体总蛋白的30%以上,并且以包涵体的形式存在,这为猪重组IL-4规模化生产和疫苗佐剂的研制奠定了基础.     

猪生长激素基因的克隆及在哺乳动物细胞中的表达

应用RT—PCR技术克隆了猪生长激素(pGH)cDNA，该基因编码蛋白的信号肽序列与已有报道的pGH基因存在2个氨基酸残基的差异，而成熟肽却无差异。将pGHcDNA定向插入真核表达载体VRl020，构建了重组真核表达质粒VpGH；利用脂质体法转染哺乳动物细胞COS7，对转染后的COS7细胞进行RT—PCR、ELlSA和免疫荧光分析，分另1在转录和翻译水平证实了目的基因在COS7细胞中得到正确转染表达。     

猪硫辛酸合成酶基因的克隆及组织表达

本试验通过电子延伸及RT-PCR技术克隆猪硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase,Lias)基因,并进一步研究了该基因在猪体内组织的表达分布。基于电子延伸序列设计1对引物,成功克隆了猪Lias基因(GenBank登录号:JN797612.1),并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了Lias基因的组织表达规律。克隆的猪Lias基因长度为1119 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码372个氨基酸;克隆的猪Lias基因与小鼠、褐鼠、人、牛的核苷酸序列同源性分别为71.5%、69.0%、77.3%、70.4%;推导的cDNA编码区(CDS)的氨基酸序列与小鼠、褐鼠、人、牛的同源性分别为91.5%、79.4%、89.4%、88.2%;构建的系统进化树结果显示,猪与小鼠、褐鼠的亲缘关系最近;组织表达分布结果表明,Lias基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、直肠、回肠、脂肪、皮肤和肌肉中都有表达;Gel-Pro软件分析结果表明,Lias基因在肾脏和脂肪组织中表达丰度最高,其次是直肠和回肠。     

猪肺炎支原体168株P97基因的克隆与表达

根据GenBank中猪肺炎支原体P97基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体168弱毒株特异性黏附因子P97抗原决定簇基因部分序列,经测序确认后,克隆入原核表达载体pET-32a,转化宿主菌BL21,将筛选出的阳性克隆用IPTG诱导,通过SDS-PAGE进行鉴定,Western blot证明所表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体抗原性,这为猪肺炎支原体免疫检测与诊断提供了重要条件。     

猪肺炎支原体特异性蛋白P36基因的克隆与表达

根据Genbank中猪肺炎支原体P36基因序列设计一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出猪肺炎支原体ZCF23株特异性蛋白P36基因序列,经测序确认后,克隆人原核表达载体pGEX 6p-1的EcoR I和Xho I位点之间,转化宿主菌BL21,将筛选出的阳性克隆用IPTC诱导,通过SDS-PAGE电泳进行鉴定,结果表明,P36蛋白基因获得了表达,这为猪肺炎支原体免疫检测与诊断提供了重要条件.     

猪Sar1b基因的分子克隆、序列分析及原核表达

根据GenBank已发表的猪Sar1b基因序列（GenBank登录号：AY819557）设计1对引物,以猪肝脏组织总RNA的反转录产物为扩增模板,用RT-PCR方法扩增出猪Sar1b基因cDNA全长编码区,经过EcoRI-SalI双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-Sar1b重组原核表达载体。将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol/LITPG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为26 ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。猪Sar1b基因的克隆和表达研究,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

猪囊尾蚴抗原基因Ag1V1的克隆及其序列分析

根据NCBI上已知序列设计引物,利用RT-PCR技术从猪囊尾蚴中成功克隆了低分子量抗原基因Ag1V1,同源性和种系发育分析结果显示,河南分离株Ag1V1基因的核苷酸序列和预测氨基酸序列与日本分离株同源性为100％和98.9％,说明Ag1V1蛋白基因具有一定的保守性;通过生物信息学软件对其蛋白二级结构、疏水性及抗原表位等方面的预测,认为其有望成为诊断或免疫用抗原.     

小鼠对猪囊虫抗原基因TS76的免疫应答

将猪囊虫抗原基因 TS76的真核表达型质粒 VTS76单独或与 p UC18联合肌肉免疫注射于 BAL B/ c小鼠 ,以MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞 Con A刺激的增殖反应及 IL - 2的诱生活性 ,EL ISA方法检测免疫小鼠 Ig G总量和特异性抗体水平 ,常规法检测外周血免疫细胞数量的动态变化。结果发现 ,VTS76免疫小鼠各项细胞和体液免疫应答反应指数均比空白对照组小鼠显著提高 ;联合免疫组小鼠的细胞免疫应答和体液免疫应答反应指数均比 VTS76小鼠提高。由此可见 ,以 VTS76免疫小鼠可诱导其特异性细胞和体液免疫反应 ,而 p UC18又明显提高了 VTS76免疫小鼠的免疫应答水平 ,具有显著的免疫增强作用     

猪囊尾蚴特异性单克隆抗体的制备及其识别抗原成分的鉴定

通过SDS-PAGE方法对猪囊尾蚴囊液抗原成分进行了分离鉴定,并分别分离纯化了其中的16 000和10 000特异性蛋白质成分;将16 000和10 000纯化蛋白质成分分别做成佛氏佐剂苗,分组免疫BALB/c小鼠,超免后,无菌取脾脏制备脾细胞,分别与NS0骨髓瘤细胞进行融合,经阳性筛选和特异性鉴定获得2株分泌猪囊尾蚴特异性单抗的杂交瘤细胞,命名为TSCF-1611H12B8和TSCF-1012G5B5。免疫学鉴定结果表明,单抗TSCF-1611H12B8和TSCF-1012G5B5与猪细颈囊尾蚴、旋毛虫、住肉孢子虫和蛔虫抗原间不存在交叉反应;单抗TSCF-1611H12B8识别囊液中16 000和10 000蛋白质抗原条带,而单抗TSCF-1012G5B5识别囊液中的10 000蛋白质条带。     

阿苯达唑和奥芬达唑对猪囊尾蚴延胡索酸还原酶的抑制作用

研究测定了阿苯达唑和奥芬达唑对猪囊尾蚴组织匀浆延胡索酸还原酶活性的抑制作用。结果表明两种经物均能抑制延胡索酸还原酶活性，提示苯并咪唑氨基甲酸酯药物的作用机理可能是非竞争性抑制延胡索酸还原酶复合体，从而导致虫体因能量耗竭而死亡。     

奥芬达唑和阿苯达唑对猪囊尾蚴作用形态学比较观察

观察了奥芬达唑和阿苯达唑对猪体内及体外培养的不同发育阶段囊尾蚴作用的形态学效果.结果表明奥芬达唑具有显著的疗效,优于阿苯达唑,且对未成熟期猪囊尾蚴的杀灭作用优于成熟期.提示奥芬达唑可能成为抗未成熟期猪囊尾蚴及治疗脑囊虫病的有效药物.     

猪囊尾蚴小热休克蛋白的免疫原性研究

利用反转录聚合酶链式反应（RT—PCR），从猪囊尾蚴虫体中扩增出小热休克蛋白（small Heat shock protein，sHSP）基因，克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，在大肠杆菌BL21中以GST融合蛋白的形式表达。SDS-PAGE分析证明，表达产物为64Ku的融合蛋白，经凝胶扫描分析，表达量约占菌体可溶性蛋白的30％。免疫学分析（Western blot，ELISA）结果表明，sHSP能与猪囊尾蚴血清反应。将表达产物点电泳后切胶回收免疫小鼠，进行Western blot和ELISA检测，其抗血清能与猪囊虫粗抗原及纯化的sHSP重组融合蛋白产物发生免疫学反应。该研究为丰富新的诊断试剂和免疫用重组抗原具有重要意义，同时，预测糖基化、磷酸化作用在sHSP实现生物学功能方面也具有广泛的意义。     

猪囊尾蚴基质金属蛋白酶-9在猪肌肉和脑组织的表达分布

应用免疫组化分析猪囊尾蚴基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达.用猪带绦虫卵1 mL(8万个/mL)灌胃20 d龄健康乳猪6头,于感染后40、80、120 d分别宰杀2头猪并取含囊尾蚴的肌肉及脑组织制作4μm厚石蜡切片,采用Envision二步法,观察不同时期寄生在肌肉及脑组织的猪囊尾蚴基质金属蛋白酶-9的表达.结果显...     

囊虫病猪循环抗原的研究(初报)

用琼脂凝胶双扩散试验发现了囊虫病猪的循环抗原,并用反向间接血凝技术作了检测。103份囊虫病猪血清琼扩试验对循环抗原的检出率为22.33％(23/103);反向间接血凝试验检出率为32.03％(33/103),其余70份呈阴性反应的血清经免疫复合物解离后,又有25份呈阳性反应,总检出率为56.31％(58/103)。