融合液浓度梯度融合法提高延边黄牛体细胞克隆效率

延边黄牛耳皮肤成纤维细胞作供核细胞,采用0.28mol/L蔗糖、甘露醇融合液。比较融合液浓度梯度融合法与普通融合法对延边黄牛体细胞克隆效率的影响。实验1,探讨0.28mol/L蔗糖融合液对体细胞克隆胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。结果表明:融合液浓度梯度融合法的融合率(92.98%vs88.55%)、卵裂率(91.07%vs80.96%)、囊胚发育率(40.06%vs30.19%)均显著高于普通融合法。实验2,探讨0.28mol/L甘露醇融合液对体细胞克隆胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。结果表明:融合液浓度梯度融合法的融合率(91.22%vs84.89%)、卵裂率(88.02%vs80.42%)、囊胚发育率(39.51%vs29.19%)均显著高于普通融合法。结果表明无论蔗糖还是甘露醇融合液,融合液浓度梯度融合法均能有效提高延边黄牛体细胞克隆效率。     

甘氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,研究了在体外培养液中添加不同浓度的甘氨酸对重组胚发育的影响。分别在体外培养液中添加0、7、14、21mmol/L的甘氨酸,结果表明,在体外培养液中添加甘氨酸能够显著提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,且以7mmol/L浓度的甘氨酸囊胚的发育率最高。     

显微操作液中添加抗氧化剂对延边黄牛体细胞克隆效率的影响

在延边黄牛体细胞克隆显微操作液中添加了维生素E,L-半胱氨酸,牛磺酸3种抗氧化剂,分别测定它们对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响,以确定显微操作液中添加的最佳浓度的最佳抗氧化剂,从而提高体细胞克隆的效率。结果显示,维生素E,L-半胱氨酸,牛磺酸3种抗氧化剂的最佳浓度分别为100μmol/L,0.9 mmol/L,14 mmol/L。适宜延边黄牛体细胞克隆显微操作液中添加的抗氧化剂为14 mmol/L的牛磺酸。结论:显微操作液中添加抗氧化剂能够提高延边黄牛体细胞克隆效率。     

猪去核无透明带卵母细胞电融合参数的探讨

试验通过采用不同场强、电场时程和脉冲次数对去核的猪体外成熟卵母细胞电融合参数进行比较研究,观察细胞融合情况。结果表明,在电场时程30 μs、1次直流脉冲（DC）的情况下,电场强度0.8 kV/cm 时卵母细胞的融合率为94.7%,显著高于其他各组（P<0.05）;当电场强度为0.8 kV/cm、1次直流脉冲的情况下,电场时程60和90 μs时,卵母细胞融合率为86.5%和83.8%,差异不显著（P>0.05）,但显著低于30 μs时的电融合效率（P<0.05）;在电场强度为0.8 kV/cm,电场时程为30 μs的情况下,1次电脉冲激活卵母细胞的融合率（94.7%）和2次电脉冲的融合率（95.6%）无显著差异（P>0.05）,但两者显著高于3次电脉冲的融合率（81.7%）（P<0.05）。通过对各组进行比较,在电场强度为0.8 kV/cm、电场时程为30 μs、1次直流脉冲的电刺激可以对体外成熟的猪卵母细胞取得较好的融合效果。     

延边黄牛体细胞克隆早期胚胎部分超微结构的研究

为了解延边黄牛体细胞克隆早期胚胎的超微结构特征,以延边黄牛体细胞克隆早期胚胎为研究对象,应用透射电子显微镜对延边黄牛体细胞克隆早期胚胎发育各时期的线粒体和细胞核等超微结构进行了观察。结果表明,延边黄牛体细胞克隆早期胚胎随着胎龄的增长,帽状线粒体逐渐减少,成熟线粒体增多;核仁由絮状到致密,最后呈网状化。     

FSH和LH对延边黄牛卵母细胞体外成熟及重组胚发育的影响

实验主要研究促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)对延边黄牛卵母细胞体外成熟及重组胚发育的影响,从而提高延边黄牛体细胞克隆的效率。采集屠宰后延边黄牛卵巢,用抽吸法回收卵母细胞,然后在不同种类、浓度激素条件下进行卵母细胞的体外成熟培养,最后将成熟的卵母细胞进行核移植及重组胚的体外培养。实验分别比较了在0、5、10、15、20μg/mL条件下,单独使用FSH与LH和在15μg/mL的FSH与10μg/mL的LH共同作用下对延边黄牛卵母细胞体外成熟率、卵裂率和囊胚发育率的影响。结果表明:将卵母细胞单独置于加有浓度为15μg/mL的FSH和10μg/mL的LH的成熟液中培养,其成熟率及后期发育率优于其他浓度组(P<0.05);而2种最优浓度同时添加共同作用时要好于单独使用(P<0.05)。由试验可得出,成熟培养液中单独添加15μg/mL的FSH和单独添加10μg/mL的LH浓度对延边黄牛卵母细胞体外成熟及重组胚后期发育效果最好;使用最佳浓度进行协同作用时,其共同作用要好于单独使用的效果。     

聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白对牛卵母细胞成熟及体细胞克隆胚胎发育的影响

为了比较不同浓度的聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛血清白蛋白(BSA)对牛卵母细胞体外成熟率、重组胚卵裂率和发育率的影响,试验采用抽吸法回收卵母细胞,用不同的无血清成熟液进行卵母细胞的体外成熟培养,然后对成熟卵母细胞进行核移植、融合、激活以及胚胎的体外培养.结果表明,适合延边黄牛卵母细胞成熟及体细胞克隆胚胎发育的PVA、PVP和BSA的最佳浓度分别是1.0 mg/mL,0.3%和0.4%.     

聚乙烯醇、聚乙烯吡略烷酮和牛血清白蛋白对牛卵母细胞成熟及体细胞克隆胚胎发育的影响

为了比较不同浓度的聚乙烯醇（PVA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、牛血清白,蛋白（BSA）对牛卵母细胞体外成熟率、重组胚卵裂率和发育率的影响,试验采用抽吸法回收卵母细胞,用不同的无血清成熟液进行卵母细胞的体外成熟培养,然后对成熟卵母细胞进行核移植、融合、激活以及胚胎的体外培养。结果表明,适合延边黄牛卵母细胞成熟及体细胞克隆胚胎发育的PVA、PVP和BSA的最佳浓度分别是1．0mg／mL、0．3％和0．4％。     

电融合/激活对于巴马小型猪体细胞克隆胚胎生产的影响

本试验旨在建立适用于猪体细胞克隆的融合/激活体系(试验1),优化融合/激活条件以提高重构卵融合率和激活率,为生产足够数量的克隆胚胎用于胚胎移植最终诞生体细胞克隆猪奠定条件。首先比较脉冲时间确定适合体细胞克隆的最佳融合/激活参数,然后利用此参数验证巴马小型猪耳部成纤维细胞克隆胚胎的发育潜能。结果显示:场强100 V/mm,3次电脉冲,脉冲时间为30μs时适于猪体细胞克隆。在试验2中,利用巴马小型猪耳部成纤维细胞为供体细胞构建体细胞克隆胚胎,得到了较高的卵裂率(83.1%)和囊胚发育率(12.4%)。     

不同成熟因素对延边黄牛卯母细胞体外成熟的影响

延边黄牛是中国著名五大地方良种牛之一，是我国宝贵的黄牛资源，具有较高的经济开发价值，被农业部列为重点保护和开发品种。延边黄牛体躯粗壮结实、结构匀称，具有耐寒、耐粗饲、抗病力强、肉质细嫩等特点，属寒温带山区的役肉兼用品种。但该品种牛生长慢，并且仅存的数量不多。试验研究激素和卵泡液对延边黄牛卵母细胞体外成熟的影响，同时探讨不同浓度的半胱氨酸对卵母细胞体外成熟的影响，为延边黄牛的体外受精、体细胞克隆提供更多的材料，以加速延边黄牛育种进程，扩繁种群。     

谷氨酰胺对延边黄牛卵母细胞成熟及重组胚发育的影响

为了提高卵母细胞的成熟率及重组胚胎的发育率,在体外成熟液中添加了不同浓度的谷氨酰胺,研究谷氨酰胺对延边黄牛卵母细胞成熟的影响,并观察它对重组胚胎后续发育的影响,从中筛选出最佳的体外培养条件。结果表明,1.0 mmol/L的谷氨酰胺能够显著提高卵母细胞的成熟率,同时也能提高囊胚发育率。说明谷氨酰胺能够提高延边黄牛卵母细胞的体外成熟率,并能促进囊胚发育。     

猪2-细胞胚胎细胞的电融合

为了探索猪胚胎细胞核移植技术中细胞融合参数，进行了猪２－细胞胚胎细胞的电融合。电融合时，直流电场强度为２ｋＶ／ｃｍ，脉冲时程选４０μｓ时，可获得７０．４％的融合率和６８．４％的发育率。非电解质融合液（甘露醇）对于融合率和融合胚的发育均优于电解质融合液（ＤＰＢＳ）。在直流电脉冲前的交流脉冲是必要的，可以显著提高融合率（Ｐ＜０．０５）。     

6-DMAP对延边黄牛末期卵母细胞核移植的影响

为探讨6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）在延边黄牛末期去核的体细胞克隆中的作用,本试验主要研究了单独使用离子霉素处理与离子霉素联合添加6-DMAP处理对体外成熟的老化延边黄牛卵母细胞的激活率的不同影响;以及不同时期添加6-DMAP对重构胚后期发育能力的影响。试验结果显示,体外成熟的老化卵母细胞,使用离子霉素单独处理后91%被激活,而在离子霉素联合添加6-DMAP处理后却没有细胞被激活,也就是没有第二极体的排出。另外,融合后使用6-DMAP处理,所得重构胚的囊胚发育率最低,而激活后的卵母细胞立即用6-DMAP处理,所得重构胚的发育能力与无6-DMAP处理的相近。综上所述,离子霉素联合添加6-DMAP可抑制老化的延边黄牛卵母细胞的激活,阻止第二极体的排出,但对重构胚的后期发育没有影响。而融合使用添加6-DMAP的培养液,抑制了重构胚的后期发育。     

体细胞核移植生产转基因牛胚胎的研究

为了优化利用体细胞核移植生产转基因牛早期胚胎的体系,以携带绿色荧光蛋白-新霉抗性双标记基因的pMSCV质粒转染的胎牛耳成纤维细胞为供体,以体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚,研究供体细胞的传代次数对转基因胚的影响和重构胚在不同电场条件下（电场强度、直流电脉冲次数）融合效率及其在不同体外培养系统中的发育效果。结果表明：传代5次的细胞做核供体较有利于转基因胚的发育;在电场条件为电场强度1.6 kV/cm、直流脉冲1次的融合率最高;负压单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率较好,与未转基因体细胞核移植胚的发育相比无显著差异（P〉0.05）。     

延边黄牛体细胞核移植的研究进展

牛体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)是一套极其复杂的技术体系,它包括卵母细胞的成熟、供核细胞的准备、卵母细胞的显微操作、细胞融合、卵母细胞激活和胚胎培养。因此,许多因素影响着核移植胚胎发育。虽然陆续有克隆牛出生的报道,但是克隆效率依然低下。本综述对延边黄牛体细胞核移植体系的6个方面进行简单综述,以期为探究延边黄牛体细胞克隆的最优化条件、建立最优化的培养体系、提高克隆效率提供参考。     

金属螯合剂对延边黄牛体细胞核移植重组胚发育的影响

由于在核移植试验中,所用的水和化学物质都不可避免的会被一些金属离子轻微污染,造成胚胎内抗氧化物和过氧化物之间难以保持平衡,从而导致胚胎发育率降低,本试验以此为出发点,探讨了在延边黄牛体细胞核移植重组胚早期培养液中添加乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na）和柠檬酸钠（sodium citrate）2种金属螯合剂类抗氧化剂,对其后续发育的影响,以期筛选出最佳的体外培养条件。结果表明：适合延边黄牛体细胞核移植重组胚后期发育的EDTA-Na和柠檬酸钠的最佳浓度分别为50μmol/L和0.6mmol/L。     

不同因素对北山羊—山羊核移植重构胚融合率的影响

作者通过对融合方式、融合场强、体细胞与透明带切口位置及重构后是否修复等条件对北山羊—山羊体细胞核移植重构胚融合率的影响进行了研究。结果表明,不同融合方式能显著影响融合率（67.57%和42.15%,P<0.05）;场强在1.3～1.9 kV/cm范围内对融合率和死亡率都没有影响;体细胞在透明带的切口处对融合率影响不显著,但融合过程中死亡率高于对照组（8.25%和2.3%,P>0.05）;重构后立即融合与修复2 h后再融合对融合率没有影响（67.29%和68.33%,P>0.05）。     

小分子硫醇对延边黄牛体细胞核移植重组胚发育的影响

探讨了在延边黄牛体细胞核移植重组胚早期培养液中添加L-半胱氨酸和β-巯基乙醇(β-ME)两种小分子硫醇类抗氧化剂,对其后续发育的影响,以期筛选出最佳的体外培养条件。结果表明:适合延边黄牛体细胞核移植重组胚后期发育的L-半胱氨酸和β-巯基乙醇的最佳浓度分别为0.6 mmol/L和50μmol/L。     

水牛徒手克隆的初步研究

徒手克隆是近年发展起来的一种手工化的核移植技术。本试验探讨了不同的去核方法、融合方法和供体细胞类型对水牛HMC效率的影响。试验结果表明,CB处理法去核与荧光染色法去核相比,去核效率及之后的重组胚发育能力均无显著差异(P＞0.05);一步法的融合率极显著高于两步法(P＜0.01),而两种方法构建的重组胚发育能力则无显著差异(P＞0.05);利用卵丘细胞所构建的HMC胚胎的融合率极显著高于耳皮肤成纤维细胞(P＜0.01),但重组胚的发育效果差异不显著(P＞0.05)。说明利用卵丘细胞作为HMC的供体细胞,采用CB处理法去核和一步融合的方法进行徒手克隆,其生产核移植胚胎效果较好。     

肝素、咖啡因、丙酮酸钠、BSA对延边黄牛卵母细胞体外受精效果的影响

试验为延边黄牛体外胚胎产业化生产奠定基础,进行了肝素、咖啡因、丙酮酸钠、BSA对延边黄牛体外受精效果的影响研究。结果表明,以改良BO液为基础液,添加20 μg/mL肝素时,精子顶体反应率和受精率分别为82.52%和75.34%,高于添加20 μg/mL咖啡因组(P<0.05)和添加10 μg /mL肝素与10 μg/mL咖啡因协同作用组(P>0.05);结合使用肝素(20 μg/mL),添加0.0020 g/mL丙酮酸钠时,精子顶体反应率和受精率分别为78.13%和71.57%, 高于添加0.0015 g/mL和0.0025 g/mL丙酮酸钠组(P<0.05);结合使用肝素(20 μg/mL),添加0.006 g/mL BSA时,精子顶体反应率和受精率分别为80.78%和71.44%,高于添加0.001 g/mL和0.003 g/mL BSA组(P<0.05)。因此,添加适当浓度的肝素、丙酮酸钠和BSA可显著提高延边黄牛精子体外获能效果及体外受精率。