固氮粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）表面蛋白变构作用的研究

采用电子自旋共振技术（ＥＳＲ），以马来酰亚胺自旋标记粪产碱菌野生型（Ａ１５０１）、胞外多糖突变株（ｅｘｏ＾－和ｅｘｏ＾＋＋）及工程菌（ｎｉｆ某Ａ和ｎｔｒＣ－ｎｉｆＡ重组子），监测由粪产碱菌表面多肽及些膜蛋白构象变化引起的ＥＳＲ波谱的变化。结果表明，粪产碱菌野生型菌株细胞表面特性显著不同于胞外多糖突变株及工程菌，根系粘质及ＮＨ４＾＋都能引起粪产碱菌表面蛋白的构象变化，标记后菌体ＥＳＲ参数τｃ的变化与     

互补野油菜黄单胞菌野油菜致病型T113突变体胞外多糖产生的DNA …

以从野油菜黄单包菌野油菜致病型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｓｔｒｉｓ）胞外多糖突变体Ｔ１１３中克隆的含转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５及共两侧相邻序列的１２．３ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ片段为探针,从野生型菌株８００４中克隆以与突变位点的相对应的６．５ｋｂＥｃｏＲＩ片段,克隆于载体ｐＬＡＦＲ３上的该片段能反式互补突变株Ｔ１１３的胞外多糖产生,说明该片段上有含有至少一个与胞外多糖产生的     

互补野油菜黄单胞菌野油菜致病型T113突变体胞外多糖产生的DNA片段的克隆

以从野油菜黄单胞菌野油菜致病型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）胞外多糖突变体Ｔ１１３中克隆的含转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５及其两侧相邻序列的１２．３ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ片段为探针,从野生型菌株８００４中克隆到与突变位点相对应的６．５ｋｂＥｃｏＲＩ片段,克隆于载体ｐＬＡＦＲ３上的该片段能反式互补突变株Ｔ１１３的胞外多糖产生,说明该片段上含有至少一个与胞外多糖产生有关的基因。     

粪产碱菌与水稻根的联合过程

应用~(15)N同位素标记菌体和Tn5转座子诱变的突变株研究固氮粪产碱菌对宿主水稻的联合进程,结果表明,粘附作用是结合过程的第一步,接种3h后粘附在根表的菌体数量达最大值,约占接种量的3.7％。粘附的菌体易脱离根表,表明粘附作用是细菌与宿主植物间的弱的相互作用。在根表定位是结合过程的第二步。接种15h后,定位菌体数量达最大值,约占接种量的21％。经振荡处理不能使定位菌体脱离根表。定殖是结合过程的第三步,接种20h后定殖菌体紧密结合于根表,剧烈振荡亦不易使其脱离根表。定殖后菌体开始出现果胶酶活性。采用趋化(Che)和胞外多糖(Exo)突变株研究表明,趋化性和胞外多糖的合成是影响细菌在根表结合的重要因素。粪产碱菌在水稻根表没有专一的粘附部位,但粪产碱菌的定位和定殖主要发生在主根根表,尤其是主、侧根交接处。     

中慢生型天山根瘤菌胞外多糖相关基因exo5及其在根毛吸附和生物膜形成中作用的研究

用质粒pKGL 3上的转座子随机插入失活的方法得到两个中慢生型天山根瘤菌胞外多糖缺失菌株,并通过随机引物PCR的方法确定了转座子插入的基因位点,该基因与豌豆根瘤菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因有高度的同源性.根毛吸附实验发现该基因缺失,导致胞外多糖缺失突变菌株在其宿主植物甘草上的根毛吸附量大大降低,同时生物膜的形成实验发现中慢生型天山根瘤菌的exo5-菌株不能像野生型菌株一样形成丰富的生物膜,也从侧面证明了根毛吸附实验的结果,初步推测胞外多糖可能通过影响中慢生型天山根瘤菌的根毛吸附过程来影响其与豆科植物的共生固氮.     

野油菜黄单胞菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的初步分析

野油菜黄单胞菌野油菜变种是发酵工业生产黄原胶的菌种,对该菌8004菌株全基因组序列进行分析,发现基因组中有两个编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因,编号分别为XC1977和XC4082,同源性分析显示这两个基因演绎的氨基酸序列只有36.3%的相似性。为了解这两个基因的功能,采用自杀质粒pK18 mob对XC1977和XC4082分别进行诱变,构建这两个基因的非极性突变体,对突变体表型初步分析,发现XC1977和XC4082分别突变后不影响细胞的生长繁殖,但对胞外多糖产量的影响则不相同,XC1977突变使胞外多糖产量降低56.3%,而XC4082突变基本不影响胞外多糖产量,表明8004菌株的两个zwf基因在细胞中的功能不同,XC1977与细胞的胞外多糖合成产量有关。     

青枯雷尔氏菌Tn5转座子无致病力突变株构建及其生物学特性

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是植物细菌性青枯病的病原菌,为研制植物疫苗菌剂提供遗传稳定且突变位点明确的青枯雷尔氏菌无致病力菌株,本研究利用EZ-Tn5转座子随机插入青枯雷尔氏菌(Rs91)构建青枯雷尔氏菌无致病力突变体库,通过电击转化,筛选获得13株具有无致病力菌株形态的突变株。研究了其中5株突变株的插入位点和生物学特性,结果表明,其插入位点分别位于phcA和pchS基因,其生长速率和相对胞外多糖含量显著低于Rs91,而最适pH值和温度未改变。其发酵液经分光光度计扫描,结果显示,突变株在同一波长下的光吸收值均大于Rs91,经聚类分析,显示它们与Rs91可聚为不同的3类,即Rs91为第Ⅰ类,phcA基因突变株为第Ⅱ类,phcS基因突变株为第Ⅲ类。经番茄(Lycopersicon esculentum)盆栽苗致病力检测,15d后均未发病,确定为无致病力青枯雷尔氏菌。本研究为研制防治青枯病的植物疫苗菌剂提供了基础资料。     

野油菜黄单胞菌两个rpoN基因的突变和功能分析

细菌的σ54(R poN)是一类可选择性识别启动子序列的σ因子,主要参与环境适应、细胞生理过程等,如氮代谢、鞭毛和菌毛的生物合成。在一些病原菌中,σ54也与致病性密切有关。为了明确σ54在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(X cc)中是否参与致病过程,用同源单交换定点突变方法,将X cc 8004中的两个σ54编码基因rp oN 1(XC 1256)和rp oN 2(XC 2168)做单突变及双突变。突变体表型分析结果表明,单个和同时突变rp oN 1和rp oN 2基因均不影响野油菜黄单胞菌的正常生长,对胞外多糖(EPS)产生、胞外酶的合成也无明显影响。植株致病性检测结果表明,rp oN 1和rp oN 2基因的单突变或双突变体的致病力与野生型菌株没有显著差异,表明野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的致病过程不需要σ54因子参与。     

固氮斯氏假单胞菌铵载体amtB基因的功能和结构分析

固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501是分离自水稻根际的联合固氮细菌,属变形细菌γ亚族。全基因组序列分析表明该菌含有2个紧密连锁的的铵载体蛋白编码基因amtB1和amtB2,位于同一个操纵子中glnK基因下游。铵载体蛋白AmtB1和AmtB2分别包含12和11个跨膜结构域。为研究amtB的功能,构建了amtB极性双突变株(PKOB1)。amtB极性双突变导致菌株生长缓慢;在铵浓度分别为3.3和10mmol/L条件下,其固氮酶活仍保持在0.01mmol/L的最佳固氮条件的87%和74%,而野生型已经基本尚失固氮能力。以硝酸盐为唯一氮源时,突变株细胞培养液的铵浓度可达到3.4mmol/L,而野生型并未检测到铵,表明AmtB可能参与了P.stutzeriA1501的铵离子转运,并与固氮酶活和氮代谢相关。     

固氮粪产碱菌胞外多糖的理化特性分析

ＥＰＳ结构分析表明，ＥＰＳ突变株及工程菌株的糖骨架结构与野生型菌株相比有差异，尤其是ｎｔｒＣ－ｎｉｆＡ基因结合子Ａ１５３２的糖骨架结构明显不同于其它菌株，各个菌株之间，其侧链基因均稍有改变。ＥＴＩＲ证实，各个菌株ＥＰＳ中蛋白构象存在差异，ＥＰＳ中均有丰富的β折叠构象。ＥＰＳ丰富型突变株中无规卷曲构象所占比例较大，而野生型菌株中ＥＰＳ则没有无规卷曲构象。     

野油菜黄单胞菌XC1892基因与致病力关系的分析

野油菜黄单胞菌野油菜变种(简称Xcc)是十字花科作物黑腐病的病原菌。在前期工作中,从Xcc8004菌株获得1株编号为XC1892的基因的转座子Tn5gusA5突变体,其致病力降低。根据基因组注释,XC1892编码1个DsbE蛋白,参与细胞色素的合成。为评估XC1892的功能,采用自杀质粒pK18mob对XC1892进行诱变,获得非极性突变体1892nk。对突变体的表型分析发现,其致病力及胞外多糖产量分别是野生型的59%和55%。用一段包含XC1892基因的DNA片段对突变体1982nk进行功能互补,其致病力和胞外多糖产量基本得到恢复。这表明XC1892基因与Xcc的致病力和胞外多糖合成产量有关。     

野油菜黄单胞菌一个假定蛋白激酶基因与多糖合成及致病力相关

已报道的野油菜黄单胞菌8004菌株基因组中,开放阅读框XC3631注释编码一个假定蛋白激酶。通过定点整合突变方法构建了XC3631基因的非极性突变体NK3631,表型分析发现NK3631合成脂多糖和胞外多糖的能力显著下降,致病力极显著减低,但产生胞外水解酶的能力不变。用带有全长XC3631基因序列的pLAFR3对NK3631进行功能互补,其脂多糖合成、胞外多糖产量和致病力均得到恢复。这一研究表明,XC3631基因与野油菜黄单胞菌脂多糖的核心多糖和胞外多糖的合成有关,并在致病中发挥重要作用。     

废水中紫色光养细菌产胞外多糖性能比较及高产菌株特性研究

利用废水生产胞外多糖是一种既能实现废水处理又能达到废水资源化的双赢方法,也是目前胞外多糖研究的热点。为得到能在废水中高产胞外多糖的紫色光养细菌(Purple Phototrophic Bacteria,PPB)菌株,本研究首先以化学合成培养基和不同比例豆制品废水和玉米淀粉废水混合培养基培养11株PPB,提取并测定其胞外多糖,结果发现不同菌株产胞外多糖能力不同,且有机废水较化学合成培养基更有利于菌株分泌胞外多糖。经两轮筛选得到一株产胞外多糖能力较高的菌株J4,高产培养基为豆制品废水,胞外多糖含量高达140 mg g-1菌体干重。且J4在豆制品废水中的生长试验表明,菌株J4不仅降低了废水的化学需氧量COD(90%),同时分泌大量胞外多糖。通过Sephadex G-50柱层析结果发现该胞外多糖的分子量较大,具有一定的研究价值。综上,本试验获得了高产菌株J4,同时发现利用有机废水能够得到大量的PPB胞外多糖,为获得低价的多糖材料提供了一定依据。     

转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获胞外多糖突变体的验证

利用转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５上的抗性基因,通过“鸟枪法”克隆到用这种转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获得的三个胞外多糖突变体菌株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７中的转座子及其相邻序列的ＤＮＡ片段,并利用含有这些片段的重组质粒,通过标记置换构建了突变体。通过检测标记置换突变体的胞外多糖产量及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,证实了胞外多糖突变株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７不仅确系转座子插入所致,而且转座子插入的位点分布在染色体的不同区域。从而证实了我们所报道的诱变体系是可行的     

60Co-γ辐射荷兰鸢尾突变株性状分析

为了探究荷兰鸢尾⁶⁰Co-γ辐射突变株具备的主要可区别性状的评判指标,根据球根鸢尾的测试指南,对其中4个稳定的突变株5-7CBS、7-10SLZ、7-10QLS、10ZLL以及野生型展翅品种进行植物学农艺性状测评,分析比较其主要观赏性状的异同。结果表明,突变株与野生型的植株形态、开花期以及生育期等特征特性基本保持一致;在调查的40个性状中,不同突变株的垂瓣上部上表面底色、旗瓣颜色、花柱上表面颜色、羽冠上表面颜色、垂瓣下部上表面底色等5个假质量性状的表达状态,与野生型相比均具有明显差异;另外的35个性状表达基本一致,相应的表型高度相似,数值较为相近,无明显差异。表明荷兰鸢尾花色在辐射育种中具有较大的遗传改良潜力,推测花色变异可能是辐射突变株与野生型具备可区别性的一个重要性状评判指标,依据花朵颜色的表达状态,花色变异可划分为加强型、野生型、减弱型、全变型4个类型。本研究结果可为开展荷兰鸢尾新品种创制提供基础数据和参考依据。     

枯草芽胞杆菌ZJF-1A5的β-葡聚糖酶热稳定性改造及酶学性质分析

利用定向进化技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ZJF-1A5的β-葡聚糖酶基因进行改造,并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。获得了2株可以产较高热稳定性酶的突变体,分别被命名为EGs1和EGs2。酶学性质分析结果显示,与野生酶相比,EGs1和EGs2突变酶的半失活温度分别提高了3和5℃,达到了65.5和67.5℃;突变酶的最适反应温度也提高了5℃,达到了60℃;2个突变酶对地衣多糖的水解能力分别提高28%和降低21.6%;对地衣多糖的亲和力未见改变;野生酶和EGs1突变酶最适pH6.5,而EGs2突变酶最适pH7.0;野生型和突变型β-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围,在pH6.0～8.5的范围内放置48h,仍保持80%以上的酶活力。遗传稳定性检验结果表明,突变株的遗传稳定性良好。     

十字花科黑腐病菌中一个与黄色素合成相关基因的鉴定

十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）能够产生大量的胞外多糖。胞外多糖商品名又称为黄原胶,具有广泛用途,在食品生产中可作为添加剂使用。为了得到不含黄色素的黄原胶,我们采用转座子EZ-Tn5随机插入诱变的方法对8004菌株进行突变,获得了一株不产黄色素的突变体。通过对突变体的转座子EZ-Tn5插入位点进行分析,发现该突变体是由于编号为XC_4097的基因被插入突变后衍生而来。同源性分析表明XC_4097编码一种脂质酰基转移酶,它与脂质的合成有关。采用同源双交换方法构建XC_4097基因的缺失突变体。通过对野生菌、突变体以及功能回补体的表型分析进一步证实了XC_4097基因功能的丧失只影响黑腐病菌黄色素的合成,而不影响细菌生长以及胞外多糖的合成。这为工业上生产无黄色素的黄原胶提供了应用基础。     

阴沟肠杆菌B29菌株脂多糖合成基因（waaL,waaG）缺失突变株的构建及分析

脂多糖（LPS）在革兰氏阴性细菌中的功能作用在不同菌株中已有研究,但尚未有对肠杆菌属LPS结构与功能的报道。本研究试图构建能引起肥胖的阴沟肠杆菌B29菌株waaL和waaG基因的缺失突变株,以了解突变体菌株产生的LPS结构与活性与野生菌株产生的LPS的差异。根据同源重组技术原理,利用广宿主自杀性质粒构建成敲除载体pKNG101△waaL和pKNG101△waaG,转化E.coli SM10菌株,并与B29菌株进行双亲杂交,再以抗生素和蔗糖筛选条件筛选waaL和waaG基因缺失突变株;利用多重PCR、ERICPCR、PCR-DGGE、DNA测序结果均证实突变株B29△waaL和B29△waaG构建成功;最后,对野生菌株B29与两个突变株生物学特性的差异进行了比较。银染实验结果表明野生型B29菌株的脂多糖为光滑型结构,突变株的LPS结构明显缺失O抗原,B29△waaG突变株同时还缺失了外部核心部分;用鲎试剂法检测LPS的内毒素活性显示,突变株的内毒素活性与野生型相比有较大幅度下降;B29△waaL突变株的生长速率与野生型相当,而B29△waaG突变株的生长速率则相对降低。本研究成功构建两种内毒素活性下降的突变株,为下一步利用突变株研究B29菌株在肥胖发生中的机制奠定基础。     

不利用香菇多糖的香菇单核菌株的选育

以香菇939菌株的担孢子为材料,应用紫外线诱变得到1株不能利用香菇多糖的突变株939-5,其菌落形态和生长速度与未突变H型单核菌株相同,多糖产量比未突变H型单核菌株提高30.7%,比双核菌株提高19.6%。该菌株产香菇多糖的最适碳源是淀粉,氮源为酵母膏,培养基初始pH值为6.0;Mg2+ 对其产香菇多糖有显著的促进作用;高溶氧水平则对产香菇多糖有明显的抑制作用。这些产香菇多糖的特性与已报道的香菇939菌株的S1型单核菌株相同。     

紫外诱变筛选海洋红酵母S8的尿嘧啶缺陷型菌株

本课题组从海南天然海域筛选到一株高产类胡萝卜素的海洋红酵母菌株S8,该菌株对鱼无毒害,并与鱼共生,欲将其应用于盐诱导表达外源蛋白的海洋红酵母工程菌的构建。本研究利用紫外诱变筛选的方法处理S8菌株,通过统计其UV致死率、5-氟乳清酸致死率等筛选S8的尿嘧啶营养缺陷型突变株。研究结果表明,供试菌株通过紫外线诱变、5-氟乳清酸致死和回复突变率的实验筛选,共获得16株稳定的尿嘧啶缺陷型突变株,突变菌株在基本培养基中培养了8d仍不能生长。选择了其中的一株ST5进行了产胡萝卜素能力的测定,结果表明,在同样的培养条件下,野生型S8菌株细胞生物产量可达87.55g/L,类胡萝卜素含量可达520μg/g,突变株ST5的细胞生物产量为85.45g/L,类胡萝卜素含量为512μg/g;ST5的产胡萝卜素能力方面与野生型S8无明显差异。因此,尿嘧啶缺陷型菌株ST5可为下一步海洋红酵母工程菌的构建提供受体菌。