一步法 RT-PCR 快速检测猪流行性腹泻病毒

对猪流行性腹泻病毒N基因保守序列设计了1对引物,建立了检测猪流行性腹泻病毒一步法反转录-聚合酶链（RT-PCR）方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对猪流行性腹泻病毒（PEDV）扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对猪流行性腹泻病毒检测的灵敏性为100 pg总RNA量。以上结果表明,该一步法RT-PCR特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪流行性腹泻的早期确诊和病毒鉴定。     

应用RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒

应用RT-PCR方法对来自广西5个猪场疑似猪流行性腹泻(PED)的37份病料和2份细胞培养物进行了检测,检出阳性30份,阳性率为76.92%;5个猪场均检测出猪流行性腹泻病毒(PEDV),结果表明,本病在广西的猪场中普遍存在。RT-PCR检测PEDV具有快速,准确的优点。     

病毒性腹泻应用RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒

应用RT-PCR方法对来自广西5个猪场疑似猪流行性腹泻(PED)的37份病料和2份细胞培养物进行了检测,检出阳性30份,阳性率为76.92%;5个猪场均检测出猪流行性腹泻病毒(PEDV),结果表明,本病在广西的猪场中普遍存在.RT-PCR检测PEDV具有快速,准确的优点.     

多重RT-PCR检测猪传染性胃肠炎与流行性腹泻病毒

猪传染性胃肠炎(TGE)与流行性腹泻(PED)是仔猪腹泻的两种重要疾病。二者在流行特点、临床症状和病理变化上都十分相近,不易区分〔1〕。针对TGEV与PEDV基因的保守区域各设计一对引物,在同一反应管中反转录扩增,产物通过1%琼脂糖凝胶电泳,出现528bp和403bp两个条带,两个扩增条带的大小与预期相符。     

从上海郊区新分离到一株猪流行性腹泻病毒

猪流行性腹泻病毒 (PEDV)属冠状病毒 ,集中于每年 10月至次年的 3月在猪群中流行 ,可给养猪业造成很大的经济损失。但是猪流行性腹泻病毒很难适应于体外细胞上生长繁殖 ,给研制疫苗带来了很大的困难。我们于 2 0 0 3年春从上海郊区某一发生严重水泻和呕吐的病猪场新分离到一株病毒 ,经鉴定为猪流行性腹泻病毒 ,并适应于传代细胞上生长 ,现报告如下。1　材料和方法1.1　 病毒 :(1)病毒来源 :上海郊区奉贤某一猪场 ,在 2 0 0 3年 2月初开始在肉猪中发生水样腹泻 ,后来在母猪中发现有短暂的腹泻 ,接着新生猪发生水泻和呕吐。采集发病仔猪的小…     

多重RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒

为了检测、区分猪传染性胃肠炎(TGE)和猪流行性腹泻(PED)，建立了同时检测这2种疾病痛原体的多重PCR方法。参考GenBank登录的TGEV和PEDV纤突蛋白S基因序列，经DNAsis 2．0比较分析。分别筛选出TGEV、PEDVS基因相对保守区。以TGEV TH-98株(GenBank登陆号为AF494337)和PEDV CV777株(GenBank登陆号为NC003436)为参考模板，利用软件Primer3设计合成了2对寡核苷酸引物，以ST细胞培养的TGEV和PEDV毒株核酸为模板。利用所设计的2对引物进行多重RT-PCR扩增，结果同时得到与试验设计相符的499bp(TGEV)和199bp(PEDV)的扩增条带。而对其他3种猪病原的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明。建立的多重RT-PCR方法可检测出10pgTGEV RNA和100pg PEDV RNA。     

猪流行性腹泻病和猪圆环病毒病混合感染的诊治

2014年2月,突遇降雪天气,某规模化猪场2 000头母猪中约100头母猪所产新生仔猪集中在1周龄内出现大批死亡现象,死亡前均出现呕吐、消瘦及水样稀粪症状。通过采用现场调查、实验室病理解剖、病理组织学观察、免疫组化、RT-PCR、测序、ELISA检测等方法,本试验确定该病是猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异野毒株感染引起,同时混合感染猪圆环病毒2型(PCV2)。通过采取母猪群紧急接种疫苗、仔猪口服卵黄抗体及加强保温、消毒等综合措施,该病迅速得到控制。     

环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV.     

应用逆转录套式PCR检测猪流行性腹泻病毒

根据已发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因核苷酸序列,设计合成2对引物,其中外引物扩增片段长度为297 bp,内引物扩增片段长度为212 bp,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了检测PEDV的套式RT-PCR检测方法,该方法较普通RT-PCR更加灵敏、可靠,能有效降低假阳性和污染,可用于PEDV的快速诊断和流行病学调查。     

5株猪流行性腹泻病毒流行株的遗传变异分析

为了解当前猪流行性腹泻流行情况,对4个地区疑似PEDV S1、ORF3基因进行RT-PCR扩增,并对5株PEDV流行株进行核苷酸同源性及遗传进化分析。S1基因核苷酸同源性比较与进化分析显示,5株PEDV流行株与意大利Italy/69979-25株、美国OH851株、我国主要变异株W-pintung-52株、AH2012、JXGZ2013等位于同一进化分支,其核苷酸同源性达98%以上。ORF3基因核苷酸同源性比较与进化分析发现,5株PEDV流行株均属于野毒株,与Tottori/JPN/2014变异株亲缘关系较近,其核苷酸同源性高达98.8%～100%。提示当前猪流行性腹泻病毒仍以变异株为主。     

猪流行性腹泻病毒的分子生物学特性以及胰酶对其作用机理

猪流行性腹泻病毒(PEDV)在体外分离培养需依赖胰酶,目前胰酶对猪流行性腹泻病毒的作用机理尚未完全清晰,文中从分子生物学方面阐述胰酶对猪流行性腹泻病毒的作用。     

Oral efficacy of Vero cell attenuated porcine epidemic diarrhea virus DR13 strain

A Vero cell attenuated porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) strain, DR13, was distinguished from wild-type PEDV using restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP). Cell attenuated DR13 was orally or intramuscularly (IM) administered to late-term pregnant sows, and mortality resulting from the highly virulent PEDV challenge was investigated in passively immunized suckling piglets of the two different groups. The mortality rate of the oral group (13%) was lower than that of the IM group (60%). In particular, the concentration of IgA against PEDV was higher in piglets of sows in the oral group, compared to the IM group. The attenuated DR13 virus remained safe, even after three backpassages in piglets. The findings of this study support the theory that the Vero cell attenuated DR13 virus may be applied as an oral vaccine for inducing specific immunity in late-term pregnant sows with a high margin of protection against PEDV infection.     

猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展

猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上培养成功后,病毒全基因组的序列和分子结构特征,结构蛋白和非结构蛋白的生物学特性和功能,病原学、血清学和分子生物学的诊断技术,体液免疫、细胞免疫和局部黏膜免疫的机理,疫苗和病毒的细胞受体等方面得到了广泛的研究。但是,与其他冠状病毒相比,猪流行腹泻病毒的研究还比较滞后,许多研究还没有开展或不够深入,为了能加快对猪流行性腹泻病毒研究进程,对其最近的分子生物学研究进展做了综述,为猪流行性腹泻病毒的深入研究提供参考。     

Impact of porcine group A rotavirus co-infection on porcine epidemic diarrhea virus pathogenicity in piglets

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) and porcine group A rotavirus (PGAR) are the main causative agents of acute diarrhea in piglets. In South Korea, PGAR is prevalent in piglets naturally infected with PEDV. Piglets naturally co-infected with PEDV and PGAR appeared to have severe and prolonged diarrhea that was distinct from that commonly observed. The aim of this study was to determine the impact of PGAR co-infection on PEDV pathogenicity in piglets. Thirty-six colostrum-deprived, one-day old, Large White-Duroc crossbred pigs were randomly divided into four equal groups: PEDV, PEDV/PGAR, PGAR, and control groups. The piglets were euthanized at 1, 2, or 3 days post-inoculation (DPI) to measure the villous height:crypt depth (VH:CD) ratio and to collect fecal samples for RT-PCR and virus isolation. No significant differences in mean VH:CD ratio and clinical symptoms (diarrhea, vomiting, dehydration, and anorexia) were observed between the PEDV/PGAR-infected and PEDV-infected groups of piglets at 1, 2 and 3 DPI; however, at 2 and 3 DPI, PGAR was detected in all fecal samples by RT-PCR and virus isolation. These findings failed to detect any interaction between PEDV and porcine rotavirus in the small intestines of piglets, suggesting that concurrent infection of PGAR may not synergistically enhance intestinal villous atrophy of piglets with PEDV disease. We propose that the severe diarrhea exhibited in PEDV and PGAR co-infected piglets may be more associated with the immunity level of the host rather than to any synergistic effect of PGAR on PEDV enteritis.     

猪流行性腹泻病毒SDbz株的分离与鉴定

病料应用套式RT-PCR检测呈现PEDV阳性,经处理将其接种到含终质量浓度50 mg/L胰酶的Vero细胞上进行病毒分离传代,盲传到10代左右开始出现局灶性CPE,20代以后特征性CPE稳定出现.将病毒Vero细胞培养物应用毒价测定及病毒中和试验、套式RT-PCR和间接免疫荧光进行检测鉴定,证明所分离到的病毒为PEDV,并将其命名为PEDV SDbz株.     

检测猪流行性腹泻病毒的R-PCR方法的建立

根据猪流行性腹泻病毒 (PEDV)的N基因自行设计和合成了一对可扩增长度为 641bp目的片段的引物 ,成功地建立了检测的猪流行性腹泻病毒的RT PCR方法。对猪轮状病毒 (PRV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)的RT PCR检测结果均呈阴性。对PEDV JS株的RT PCR产物的序列分析表明 ,与CV777株的同源性为 97 3 %。     

胰酶对猪流行腹泻病毒纤突蛋白作用的研究进展

猪流行性腹泻病毒（PEDV）的分离及纤突（S）蛋白是最近几年来研究的热点。本文结合胰酶对PEDV S蛋白裂解作用促进病毒分离的国际最新研究进展,并对S蛋白及其功能、胰酶改变S蛋白构象、胰酶触发S蛋白融合机制等方面进行综述,以期为PEDV的防控提供参考。     

表达猪流行性腹泻病毒S基因片段重组腺病毒的构建与免疫特性

利用RT-PCR、同源重组等技术构建了含有猪流行性腹泻病毒(PEDV)S基因上3个片段的重组腺病毒质粒pAd-S98～638,pAd-S1～638,pAd-S49838～1384,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬宽纯化分别获得了重组腺病毒rAd-s498～638,rAd-S1～638,rAd-S498～1384.重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代效价稳定,TCID50分别为每毫升10-6.29、10-5.75、10-6.5.应用猪流行性腹泻病毒阳性血清进行间接免疫荧光抗体试验,在3个腺病毒感染的HEK-293A细胞的胞质见有清晰荧光.将3个重组腺病毒分别免疫小鼠,结果均诱导产生较强的体液免疫应答.结果表明这3个重组腺病毒对S基因的3个片段均可成功表达,并具有较好的免疫原性,为PEDV重组腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础.     

广西猪流行性腹泻流行病学调查

对广西6个市的6个规模化猪场进行了猪流行性腹泻流行病学调查。对其中4个猪场统计,在11090头猪中,患流行性腹泻的猪4658头,发病率为42%;死亡265头,病死率为5.69%。对6个猪场的170头份血清检测,阳性血清14份,阳性率为8.24%。结果表明广西的一些规模化猪场有猪流行性腹泻存在。