鸡粒细胞巨噬细胞集落刺激因子-猪干扰素α1融合基因在大肠埃希菌中的可溶性表达及其生物学活性研究

为可溶性表达重组鸡粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(ChGM-CSF)与猪干扰素α1(PoIFNα1)融合蛋白,并研究其生物学活性,本研究分别提取鸡、猪肝脏细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增ChGM-CSF和PoIFNα1基因,经linker连接上述两种基因后将其克隆于pET-32a原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE和western blot检测融合蛋白表达产物。在ST细胞/VSV病毒测定系统以细胞病变抑制法滴定该融合蛋白的抗病毒活性;同时用MTT法检测其对鸡淋巴细胞增殖活性的促进作用。结果显示,PCR扩增并融合后的ChGM-CSF和PoIFNα1融合基因约为1000bp,构建重组表达载体后,诱导表达的rChGM-CSF-PoIFNα1融合蛋白分子量约55ku,主要存在于破碎菌体的上清中,表达量较高。Westernblot检测结果显示,该融合蛋白分别能够与ChGM-CSF多抗和PoIFNα单克隆抗体特异性结合,其抗病毒比活性约为1.1×10^6IU/mg,并且具有促进鸡淋巴细胞增殖的活性。本研究为rChGM-CSF-PoIFNα1重组融合蛋白的研制及其相关活性的测定提供实验依据。     

金黄色葡萄球菌体外刺激奶牛外周血中性粒细胞对炎性因子分泌的影响

以体外培养的奶牛中性粒细胞为研究对象,用瑞氏姬姆萨染色和台盼蓝拒染法对分离培养的奶牛外周血中性粒细胞进行鉴定和活性检测,ELISA检测金黄色葡萄球菌感染体外培养的奶牛外周血中性粒细胞IL-1β、TNF-α、IL-10及IL-8的分泌情况,Western blot检测金黄色葡萄球菌感染体外培养的奶牛外周血中性粒细胞中NF-κB的激活效应。结果显示,体外分离培养的奶牛外周血中性粒细胞纯度达99%,随着培养时间增加奶牛外周血中性粒细胞活性逐渐降低。ELISA检测结果显示,在3 h～24 h刺激时间范围内,随着金黄色葡萄球菌刺激时间的增加,与空白对照组相比体外培养的奶牛外周血中性粒细胞中IL-10、TNF-α、IL-1β和IL-8的分泌量均显著升高(P<0.001)。Western blot检测结果显示,在15 min～120 min刺激时间范围内,随着SA113感染时间的增加,与空白对照组相比体外培养的奶牛外周血中性粒细胞中IκBα磷酸化水平显著升高(P<0.001)。研究结果表明,成功分离培养了奶牛外周血中性粒细胞;金黄色葡萄球菌(SA113株)刺激体外分离培养的奶牛外周血中性...     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达及其促淋巴细胞增殖活性测定

根据GenBank上公布的猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(pGM-CSF)基因序列(U67175.1)扩增该基因,克隆至pET30b载体,构建重组表达载体pET30b-pGM-CSF,并与分子伴侣辅助质粒pG-KJE8共同转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE分析,可见表达的目的蛋白大小约为23ku,主要以包涵体形式存在,且在分子伴侣的辅助下,增大了可溶性蛋白的表达量。经镍离子亲和层析纯化后,通过淋巴细胞增殖试验初步检测了pGM-CSF蛋白促进淋巴细胞增殖的活性。结果表明,猪GM-CSF具有明显的体外刺激淋巴细胞增殖的生物学活性,为进一步研究猪GM-CSF的生物学功能以及临床应用奠定了基础。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌FnbpB-D基因的表达及其抗血清活性

纤维素结合蛋白B(FnbpB)是金黄色葡萄球菌(S.aureus)最主要的黏附因子之一,它能够介导S.aureus结合于细胞表面的纤维连结素(Fn)和纤维蛋白原(Fg)。FnbpB基因中D区为主要活性部位。本实验利用pET-32a表达载体表达了S.aureus FnbpB-D重组蛋白(34.7ku),并通过动物实验对重组FnbpB-D蛋白的抗血清活性进行了初步研究。采用ELISA对抗血清进行抗粘附性检测,结果显示实验组与对照组差异极显著(p0.01),抗血清具有较强的抑制S.aureus黏附纤维连结素的作用。此外,调理吞噬实验结果显示,免疫兔全血对S.aureus有较强的调理作用。这些实验结果将为制备奶牛乳房炎S.aureus黏附素疫苗的研制提供参考。     

重组鸡Cathelicidins类抗菌肽的融合表达及其对金黄色葡萄球菌抗菌活性的研究

Cathelicidins抗菌肽在家禽天然免疫系统中发挥重要作用,本研究将已构建的含Cathelicidins抗菌肽成熟肽的阳性克隆菌株Rosetta(DE3)/pET30-CathL1S、pET30-CathL2S、pET30-CathL3S分别在37℃、1.0 mmol/L IPTG的条件下进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,Cathelicidins成熟肽片段均在大肠杆菌中以融合形式成功表达,表达产物的表观分子质量分别为7、8、7.5 ku。琼脂糖孔穴扩散法检测结果显示,表达产物对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均具有很好的抑制活性,其对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鸡白痢沙门氏菌C79-13 (Salmonella pullorum)、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌及绿脓杆菌等供试菌株均有较强的抑制作用,尤其对抗生素耐药菌株有明显的抑制作用。以雏鸡为实验模型研究重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌的体内抗菌活性,结果表明,注射中、高剂量CathL-1抗菌肽试验组(5、10 mg/kg),在试验结束后取肝脏组织匀浆液涂布于TMP平板,未分离到葡萄球菌。各抗菌肽试验组平均增重均高于感染对照组,其中低剂量抗菌肽试验组(2.5 mg/kg)体内抑菌效果虽与普通抗生素相当,但其增重效果尤为明显。     

牛IgG Fc片段与FnBPB-ClfA串联表达及其对金黄色葡萄菌性奶牛乳腺炎的免疫效果

为了提高金黄色葡萄球菌(S.aureus)黏附素FnBPB-ClfA基因表达蛋白对奶牛的免疫效力,应用RT-PCR扩增奶牛IgG Fc基因片段与构建的金黄色葡萄球菌(S.aureus)FnBPB-ClfA黏附素基因串联构建质粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA,并通过双酶切将其克隆于pET32a(+),以构建质粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA并进行诱导表达。以盐酸左旋咪唑(LH)或氢氧化铝(ALUM)为佐剂,与纯化的重组蛋白(bFcFnBPB-ClfA)混合以首次免疫肌肉注射,加强免疫乳头管灌注或首次免疫、二次免疫及三次免疫均以肌肉注射方式免疫临近干奶期的奶牛。用间接ELISA和Western blot对各组牛血清中的抗体进行监测,评价免疫效果。结果显示,以LH为佐剂免疫的(A组)牛21d时抗体水平最高,可达到1∶1 600;而以ALUM为佐剂免疫的B组和C组抗体水平分别为1∶800和1∶400。IgG水平动态监测结果表明,以LH为佐剂免疫牛的血清中特异性抗体上升趋势明显高于其他免疫组。研究结果表明,以首次免疫肌肉注射,加强免疫乳头管灌注的方式较好,并且bFc-FnBPB-ClfA与LH佐剂混合后免疫奶牛能最有效激发奶牛免疫反应。     

苜蓿SKU5基因的表达调控及其在秋眠中的作用

为了探索SKU5基因在紫花苜蓿（Medicago sativa L.）中表达调控规律和在苜蓿秋眠中的作用,本研究拟检测春、夏、秋季和人工条件下不同温度、不同日照长度下秋眠型和非秋眠型苜蓿叶片中SKU5基因mRNA相对表达量,分析同一秋眠型苜蓿品种不同时期SKU5基因mRNA相对表达量差异和不同时期2种秋眠型苜蓿品种间SKU5基因mRNA相对表达量的差异,以及SKU5基因mRNA相对表达量与苜蓿株高、叶面积、日照长度、温度的相关性。结果表明：SKU5基因的表达受日照长度极显著负调控,受温度极显著正调控;2种苜蓿叶片中SKU5基因的表达受日照长度和温度的调控结果不一致;秋眠型苜蓿叶中SKU5基因mRNA相对表达量与株高、叶面积呈显著负相关。因此,随着日照长度的缩短,SKU5基因高表达很可能促进秋眠型苜蓿的秋眠。     

重组鸡IFN-α-IL-18融合基因的酵母分泌表达及其抗IBDV活性研究

为探讨鸡IFN-α和IL-18及其融合蛋白抗IBDV活性,本研究将鸡IFN-α、IL-18及其融合基因分别置于酵母表达载体pPICZ-αA的AOX1启动子下游,构建重组质粒pPICZ-IFN-α、pPICZ-IL-18和pPICZ-IFN-α-IL-18。将重组质粒分别用PmeⅠ酶切线性化,电穿孔方法导入酵母Pichia Pastoris X-33感受态细胞,以1%甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白,淋巴细胞转化试验初步检测表达产物生物学活性,鸡胚接种试验对表达产物的抗IBDV效果进行评价。结果表明,在酵母培养上清液中存在相对分子质量分别为22 000、23 000和43 000的目的蛋白,表达的IL-18和IFN-α-IL-18对鸡淋巴细胞具有明显的诱导转化作用(P0.05)。IFN-α-IL-18融合蛋白能够显著抑制IBDV在鸡胚中的增殖(P0.01),IFN-α和IL-18酵母表达产物对IBDV也有明显的抑制作用(P0.05)。这为进一步开展IFN-α-IL-18融合蛋白的功能研究及其在鸡病毒性疫病防控中作用的探索奠定了基础。     

鸡IL-2和IL-4融合基因真核表达质粒的构建及其表达产物的生物学活性

为提高鸡球虫病活疫苗的免疫效果并降低其副作用,本试验用合成的鸡白介素2(chIL-2)和鸡白介素4(chIL-4)基因片段构建3个融合基因真核表达质粒,并利用脂质体法将其转染至原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测其表达水平,MTT法测定其表达的分泌产物活性。结果显示：成功构建的pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP、 pCI-chIL-4-EGFP重组真核表达质粒能在原代鸡胚盲肠上皮细胞中高效表达;3种重组真核表达质粒转染后24～96 h的鸡脾淋巴细胞活性极显著高于空载组(P<0.01),且在72 h时达峰值;而单一因子组鸡脾淋巴细胞增殖活性极显著低于pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP组(P<0.01)。由此可见,本试验成功构建了能表达分泌chIL-2和chIL-4的融合基因重组质粒;且chIL-4-chIL-2融合蛋白生物学活性显著高于单一因子。     

猪源新城疫病毒F和HN基因的表达及其对BHK-21细胞膜的融合作用

为了分析猪源新城疫病毒F和HN基因对BHK-21细胞膜的融合作用,采用RT-PCR方法从猪源新城疫病毒JL01株中扩增获得了F蛋白基因,并根据GenBank上登录的猪源新城疫病毒HN基因序列,合成了HN基因,分别将F和HN基因克隆到pKS载体上。又从大肠杆菌BL21（DE3）中扩增得到T7RNA聚合酶基因,将报告基因EGFP与T7RNA聚合酶基因一起定向克隆到痘苗病毒转移载体pSTK上。再将pKS-F、pKS-HN与pSTK-T7-EGFP共转染BHK-21细胞,转染后16h,用Giemsa染液进行染色,可见明显的细胞融合现象。该研究证明猪源新城疫病毒JL01株的F和HN蛋白共同作用于BHK-21细胞使细胞膜融合。     

TRAIL和HN基因融合表达重组腺病毒的构建及其对DT40细胞的抑瘤作用

分析携TRAIL和HN基因的重组腺病毒在DT40细胞中的表达规律及杀伤肿瘤细胞的生物学效应。通过RT-PCR分别从鸡外周血淋巴细胞和新城疫病毒(NDV)LaSota株中扩增出TRAIL和HN基因,通过定点突变和重叠延伸拼接法实现TRAIL和HN基因的2A连接,将获得的目的基因克隆到pShuttle-CMV穿梭载体中,与pAdeasy-1载体在BJ5183细菌内同源重组,构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-TRAIL和pAd-TRAIL-2A-HN,将质粒线性化后转染AD293细胞,包装后的重组腺病毒,经RT-PCR检测、荧光显微镜观察和病毒滴度测定后,将获得的重组腺病毒体外转染禽淋巴白血病DT40细胞,通过RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒的感染性和外源基因的表达情况,采用流式细胞仪检测重组腺病毒对DT40细胞生长的影响以及Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-2A-HN对DT40细胞的凋亡作用。PacⅠ酶切证实同源重组成功;RT-PCR、荧光显微镜检测证实重组腺病毒质粒成功导入AD293细胞中且具有良好的感染性,滴度为1.9×1010PFU/mL;Western blot检测结果显示,TRAIL-linker-HN基因能够在DT40细胞中稳定表达并对DT40细胞产生细胞毒作用,且诱导细胞的凋亡率为29.52%,表明TRAIL-linker-HN具有双基因抑瘤的协同效应。