捻转血矛线虫Hc38重组蛋白的表达纯化及抗原性鉴定

[目的]通过表达和纯化捻转血矛线虫新功能基因He38最大开放阅读框ORF1,确定完整的Hc38蛋白天然表达形式、分子量大小和免疫学活性鉴定,为研究该基因功能和基因工程应用奠定基础.[方法]参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的He38基因序列(AY594263)设计引物,PCR扩增目的基因并克隆到表达载体中,重组表达载体转化大肠杆菌后IPTG诱导表达,SDS-PAGE和薄层扫描检测分析表达产物,通过亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western bloting和ELISA方法检测其抗原性.[结果]Hc38基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白相对分子量约为68 KD,表达量占菌体蛋白总量的30;,亲和层析柱纯化出目的蛋白,并能被捻转血矛线虫病绵羊阳性血清和重组表达产物免疫小鼠血清识别,具有反应原性.[结论]实现了Hc38基因的原核表达和纯化,验证了Hc38基因在虫体内的表达形式和抗原性.     

捻转血矛线虫扫描电镜的补充报告

本文对采自上海绵羊真胃的捻转血矛线虫进行扫描电镜观察。对该虫齿、颈乳突、排泄孔、肛孔、纵纹、横纹和交合刺超微结构作了补充描述,并讨论了交合刺构造。     

山羊捻转血矛线虫的诊治

介绍了山羊捻转血矛线虫的临床表现、剖检病变及实验室诊断,提出其预防与治疗措施,以期为该病的防治提供参考。     

捻转血矛线虫H11部分功能域基因的原核表达与分析

    生物信息学软件分析表明,捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)ZJ株的H11抗原基因含有4个糖基化位点与1个锌结合区,为分析这些功能域在H11天然抗原诱导的免疫保护中的作用,对H11部分基因进行克隆和表达.参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的H11基因序列设计引物,扩增H11开放阅读框670～1710 bp的部分基因序列,命名为HPS(H11 partial sequence).基因片段与表达载体pET-28b分别以NdeⅠ、XhoⅠ酶切后构建重组表达载体pET-28b-HPS,并将其转入大肠杆菌BL21中,提取质粒经PCR和酶切鉴定获得阳性质粒并对其进行测序.结果表明,扩增得到的目的基因片段为 1041 bp,与已发表的ZJ株和国外株参考序列比较,核苷酸同源性分别为100%和98.8%.将重组表达载体用IPTG诱导表达,表达产物利用SDS-PAGE和Western-blotting检测表明,HPS基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白的分子量约为37.34 kDa,诱导6 h的蛋白表达量可达到58.9%.     

捻转血矛线虫H11基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

将捻转血矛线虫H11基因亚克隆到酵母表达载体pPICZαB后，用氯化锂法转化巴斯德毕赤酵母菌株X-33，通过含Zeocine^TM抗生素的YPD平板筛选出72个重组子。重组酵母用甲醇诱导后，经RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明捻转血矛线虫H11在巴斯德毕赤酵母中实现了表达。     

捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与表达及其DNA疫苗的构建

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。     

苏云金芽胞杆菌的伴胞晶体毒素对捻转血矛线虫第2期幼虫的毒力

苏云金芽胞杆菌的伴胞晶体毒素对捻转血矛线虫第２期幼虫的毒力王祥，姚宝安（华中农业大学畜牧兽医学院，武汉４３００７０）关键词苏云金芽胞杆菌，伴胞晶体毒素，捻转血矛线虫，第二期幼虫ＴＨＥＴＯＸＩＣＩＴＹＯＦＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＣＲＹ...     

绵羊混合感染捻转血矛线虫和美丽筒线虫的诊治

2008年11月以来河北北方学院动物科技学院病理实验室先后接到张家口坝上地区养羊户送来的以贫血、渐进性消瘦为主要特征的病羊,剖检发现其真胃内有捻转血矛线虫寄生,最多达2 120条。另在其食道黏膜内发现细长、乳白色的美丽筒线虫,共14条。漂浮法粪便检查时发现2种虫卵。一种虫卵内含16～32个胚细胞,卵壳薄,光滑稍带黄色,虫卵大小为(75～95)μm×(40～50)μm;另一种虫卵内含有幼虫,虫卵大小为(50～70)μm×(25～37)μm。经诊断为羊混合感染捻转血矛线虫和美丽筒线虫病。对羊群普遍用左旋咪唑片和丙硫咪唑口服驱虫,2周后羊群症状消失,病情得到控制。     

羊捻转血矛线虫体外培养方法探讨

羊捻转血矛线虫的体外培养是其相关研究试验的基础,它是一种人为提供的类似寄生虫宿主的体外环境,是一种让虫体完成一系列生长发育的方法。本文分别从培养基、温度、湿度和pH值等方面探讨了影响羊捻转血矛线虫体外生长发育的因素,为捻转血矛线虫的体外培养提供一定的参考思路。     

捻转血矛线虫耐药虫株与敏感虫株circRNAs差异表达分析

为分析捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株与耐药虫株之间差异表达的circRNAs在调控耐药性中的作用,本研究以捻转血矛线虫敏感虫株和耐药虫株为研究对象,采用Illumina Hiseq 2 000平台进行高通量测序及cDNA文库的构建,利用相关生物信息学软件对测得的circRNAs进行差异性分析,同时对来源基因进行GO和KEGG pathway功能富集。运用TargetScan和Miranda软件预测关键circRNAs靶向的miRNAs,探究circRNAs-miRNAs的作用。随后又随机选取5个显著差异的circRNAs,进行RT-qPCR检测并与转录组测序结果进行一致性评定。结果显示：1）敏感虫株与耐药虫株共筛选出677个差异表达的circRNAs,其中47个显著差异,23个显著上调,24个显著下调。2）所有差异circRNAs的来源基因GO富集分析显示,共富集到生物过程336个、细胞组分59个和分子功能110个,主要与代谢过程、细胞膜结构和催化活性等相关;KEGG富集分析显示,富集到257条通路,主要与代谢（脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢和丙酸代谢）、胰高血糖素信号通路和AMPK信号通...     

桃脂氧合酶基因（PpLOX-3[KG-*3]）在洋葱表皮细胞中的定位表达

PpLOX-3是从桃果肉中克隆得到的一个基因,通过生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白可能定位于细胞质膜中。为进一步研究该基因功能,构建以绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)为报告基因的融合植物表达载体163Gpp-PpLOX-3,通过农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞。结果表明PpLOX-3定位在洋葱表皮细胞的细胞质膜中。     

捻转血矛线虫GST耐药基因的克隆、表达及生物信息学分析

为探究捻转血矛线虫GST基因的原核表达及其生物信息学特征,以捻转血矛线虫cDNA为模板,设计特异性引物扩增GST基因,构建原核表达载体pET30a(+)-GST转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌进行表达条件优化后,再通过SDS-PAGE分析蛋白表达的特征,并利用在线软件对GST蛋白进行生物信息学分析。结果表明:捻转血矛线虫GST基因大小为618 bp;诱导后的pET30a(+)-GST重组菌最佳诱导条件为0.05 mmol/L的IPTG在37℃时诱导6 h,以包涵体的形式存在,大小约为29 ku。生物信息学分析表明:GST分子式为C_(1083)H_(1657)N_(277)O_(294)S_6,属于不含信号肽和跨膜区的亲水性蛋白;二级结构主要由α螺旋形成;潜在的抗原表位主要位于25～48、55～63、92～106、113～124、139～147、170～189和195～205位氨基酸附近。本试验成功构建GST基因原核表达系统,优化表达条件下能稳定纯化GST重组蛋白,为进一步探索捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制及GST蛋白的生物学特性提供研究基础。     

捻转血矛线虫PCR检测方法的建立及其应用

为了能从粪便中对捻转血矛线虫卵进行特异性检测,基于捻转血矛线虫ITS2-28S基因序列设计特异性引物,通过对退火温度反应条件优化,建立捻转血矛线虫特异性PCR检测方法。结果显示,该方法成功从捻转血矛线虫卵中扩增出约270 bp的特异性片段,其最低检出质量浓度为0.298 pg/μL,敏感性较高;进一步对捻转血矛线虫、细颈线虫、粗纹食道口线虫等多种线虫的虫卵DNA样品进行扩增,该方法仅能特异性扩增出捻转血矛线虫卵的目的片段,证明特异性良好。利用所建立的PCR检测方法对120只山羊的粪便样品进行检测,显示受检样品中捻转血矛线虫阳性率为38.3%,高于显微镜检测结果(阳性率为24.2%)。结果表明,该研究建立的PCR方法能够应用于临床检测山羊粪便样品中的捻转血矛线虫卵,可为山羊捻转血矛线虫病的诊断与防治提供有效技术支持。     

捻转血矛线虫丙硫咪唑敏感虫株和耐药虫株miRNA-mRNA关联比较分析

旨在比较分析捻转血矛线虫敏感虫株和耐药虫株miRNA表达谱,探讨miRNA与捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药性相关基因之间的调控机制.运用Illumina Hiseq2000平台进行测序并进行eDNA文库的构建,利用RNAhybrid、Miranda和TargetScan对测序得到的数据进行靶基因预测,并取交集作为miRNA的...     

Effect of the Antisense BcMF12 Driven by the BcA9 Promoter on Gene Silencing in Brassica campestris L. ssp. chinensis

The study analyzed the silencing of BcMF12 gene regulated by BcA9 promoter in the transgenic pakchoi and confirmed the effect of antisense BcMF12 gene on the pollen development. A conserved BcMF12 gene fragment was amplified from the cDNA of flower buds in pakchoi （Brassica campestris L. ssp. chinensis, syn. B. rapa L. ssp. chinensis） and was fused to the anther specific BcA9 promoter. The plant antisense expression vector was constructed and then introduced into pakchoi via Agrobacterium-mediated transformation. The transgenic plants were screened by antibiotics and molecular analysis. PCR and Southern blot revealed that the antisense BcMF12-GUS fusion gene regulated by BcA9 promoter was integrated into transgenic plants. Northern blot suggested that the expression of BcMF12 gene was down-regulated significantly. The pollen germination rate of transgenic plants with antisense BcMF12 gene decreased as compared with that of the control plants. The expression of the gene BcMF12 related to the pollen development was inhibited by the antisense BcMF12 driven by BcA9 promoter, which consequently affected the pollen development in pakchoi.     

结球甘蓝类钙调蛋白基因 CML48和 CML50在不同胁迫下的表达分析

为探究结球甘蓝类钙调蛋白（CMLs）响应不同胁迫时的功能,丰富CMLs参与钙信号网络调控,为CMLs参与植物逆境途径及其功能的研究提供依据。以结球甘蓝ZG为材料,克隆得到 CML48和 CML50基因,序列分析表明 CML48开放阅读框（ORF）为672 bp,含4个内含子,编码223 aa,分子量为25.28 ku; CML50开放阅读框ORF为1 095 bp,编码364 aa,分子量为38.06 ku,含3个内含子;均为亲水蛋白,均含有2个EF-hand结构域;系统发育树表明 CML48和 CML50均与甘蓝处于同一进化枝,与白菜、油菜的亲缘关系最近。qPCR表明 CML48和 CML50在干旱(PEG6000)、盐胁迫(NaCl)、低温(4 ℃)、高温(37 ℃)、H₂O₂、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等不同胁迫处理下,在叶和根中的表达均有上调,且 CML50的表达量均显著高于 CML48, CML48在茎尖中高度响应高温胁迫,而在根中不响应高温和H₂O₂胁迫。初步说明 CML48和 CML50在根和叶中均可响应上述8种非生物胁迫。     

山药 DoARID4基因克隆与表达特异性分析

以''铁棍山药''为材料，根据同源克隆的方法获得''铁棍山药'' DoARID4序列，并对其氨基酸序列进行生物信息学分析，并构建系统进化树，通过qRT-PCR试验对该基因进行初步的组织特异性表达分析初步探究 DoARID4在''铁棍山药''生长发育以及扁茎发生中的调控作用，为ARID基因家族的进一步研究提供理论依据。结果表明，克隆得到一条长731 bp的条带，将测序结果进行Blast比对，发现其与芋头、莲藕ARID4序列相似性最高，因此将该基因命名为 DoARID4。 DoARID4可编码211个氨基酸，其蛋白质分子质量为  23.73 ku；其蛋白分子式为C₁₀₃₅H₁₆₀₆N₃₀₄O₃₀₅S₁₇，是一种脂溶性很强、非跨膜、亲水性蛋白；可能分布于细胞核及线粒体中，并且可能通过丝氨酸或苏氨酸磷酸化进行细胞信号的传导功能。 DoARID4在地上茎与地下茎的相对表达量较高，而在叶片中相对表达量较低，推测 DoARID4在山药茎和根的畸形发育中发挥重要作用。     

宁夏小麦Glu-A3与Glu-B3位点等位变异组成分析

低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)与小麦品质密切相关。为给宁夏小麦的品质改良提供参考,应用STS分子标记,对宁夏98份小麦品种Glu-A3和Glu-B3位点的等位基因变异类型组成进行检测和分析。结果表明,宁夏98份小麦品种Glu-A3位点存在Glu-A3a(4.0%)、Glu-A3b(2.0%)、Glu-A3c(55.1%)、GluA3d(10.1%)和Glu-A3e(28.5%)5种等位变异;Glu-B3位点存在Glu-B3a(2.0%)、Glu-B3b(8.1%)、Glu-B3c(5.0%)、Glu-B3d(7.1%)、Glu-B3f(21.4%)、Glu-B3g(2.0%)、Glu-B3h(15.3%)和Glu-B3i(13.3%)8种等位变异。宁夏参试品种共存在23种等位变异组合形式,其中引黄灌区存在18种组合类型,Glu-A3c/Glu-B3j(17.7%)和Glu-A3e/Glu-B3f(16.2%)组合类型较为普遍;宁南山区存在13种组合类型,以Glu-A3c/Glu-B3i(20.0%)组合类型为主。在参试的宁夏小麦品种中,对同一地区不同来源品种而言,改良品种的LMW-GS遗传多样性明显较引进品种和地方品种更丰富。