NtSKP1基因的RNAi载体构建及对烟草的转化

根据枯斑三生烟草SKP1基因(NtSKP1)的序列,设计二对分别含有特定酶切位点的特异引物,以重组质粒pMD18-SKP1为模板,分别扩增目的基因的正反向片段(约473 bp)。将反向目的片段插入中间载体pHANNIBAL内含子右侧,正向目的片段插入该载体内含子左侧,再经NotⅠ酶切回收约3 916 bp目的片段,插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含NtSKP1基因片段正反向重复序列的植物表达载体pART27-skp1sa。将pART27-skp1sa质粒导人根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得转基因烟草。     

植物亚细胞定位载体卡盒pCEG的构建及验证

GFP基因被广泛地应用于植物转基因以及基因功能验证研究,然而构建与GFP融合的植物表达载体,常会因酶切位点难以选择,而使得载体构建过程复杂,周期长.以含GFP的质粒pCAMBIA-1302为基础,消除此质粒本身的多克隆位点(MCS),并在此质粒GFP基因序列前插入原核表达载pET-32b的多克隆位点,构建了植物GFP亚...     

FaDREB1基因RNAi的植物表达载体的构建

以pMD18-T-FaDREB1为基础,构建了由35s启动子调控的FaDREB1基因RNAi的植物表达载体pART27-FaDREB1(1)-FaDREB1(2),并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LB4404中。对于研究RNAi的机理和应用以及研究DREB类转录因子基因的功能和应用具有重要的理论价值。     

枣ZjWRKY22基因克隆、亚细胞定位及表达载体构建

WRKY是植物特有的锌指型转录调控因子,参与调控植物抗逆、生长发育和新陈代谢。为探索易裂品种壶瓶枣WRKY转录因子ZjWRKY22的生物学功能,同时为揭示枣WRKY响应非生物胁迫的分子机制提供理论基础,对克隆ZjWRKY22基因编码区序列进行生物信息学预测,并对枣吊、茎、叶、花、果实进行差异表达分析。结果表明,从壶瓶枣中克隆得到ZjWRKY22基因CDS序列长1 068 bp,共编码335个氨基酸,分子质量约为38.9 ku,等电点为5.92,分子式为C₁₆₈₂H₂₅₈₂N₄₇₂O₅₆₈S₁₃;该蛋白中丝氨酸最多,占18%,为亲水不稳定蛋白质,无信号肽和跨膜结构域,含有76个磷酸化位点;二级结构类型以无规则卷曲为主,该基因具有典型的WRKY结构域,三级结构预测主要由4个β-折叠组成,分别为WRKYGQK、RGYYR、RKQVER、FIVTYT;属于WRKY家族Ⅱe组。同源序列比对显示,枣与杨梅、桃、扁桃、梅的同源性分别为75.86%、74.88%、74.41%和74.88%,系...     

DREB1A基因植物表达载体的构建

以 p Bch质粒为基础 ,构建了分别由 35 s启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因双子叶植物表达载体p BD35 s、p BD2 9A,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因 (N PT ) ,适用于双子叶植物的遗传转化。以 p CU质粒为基础 ,构建了分别由 E12启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因单子叶植物表达载体 p CDE12、p CD2 9A,其植物选择标记为乙酰 Co A转移酶基因 (bar) ,适用于单子叶植物的遗传转化。并分别通过三亲本杂交法和冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌 L BA4 4 0 4中 ,为通过农杆菌介导法将 DREB1A基因导入植物奠定基础     

高羊茅FaFKF1基因克隆、亚细胞定位及节律表达分析

【目的】克隆高羊茅蓝光受体家族基因（FaFKF1）,分析其序列特征及亚细胞定位,并检测其在不同光照处理下的节律表达特征,为探索其在成花中的调控机制及高羊茅光周期适应性育种提供理论依据。【方法】采用RACE方法克隆FaFKF1基因cDNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并构建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白亚细胞定位情况。同时,利用实时荧光定量PCR检测FaFKF1基因不同光照处理和不同生长阶段的节律表达特征。【结果】克隆获得FaFKF1基因cDNA全长为2266 bp,开放阅读框（ORF）为1881 bp,编码626个氨基酸残基,蛋白分子量为68.89 kD,理论等电点（pI）为5.76,脂肪系数为80.99,不稳定指数为39.81,属于较稳定的亲水性蛋白,亚细胞定位于细胞核。FaFKF1蛋白的二级结构包含α-螺旋（24.92%）,无规则卷曲（44.89%）、延伸链（23.16%）和β-转角（7.03%）。FaFKF1蛋白与大豆（NP_001235886.2）、大麦（KAE8795993.1）和二穗短柄草（XP_003577479.1）的氨基酸序列相似性较高,为79.50%~87.68%,且与二穗短柄草FKF1蛋白的亲缘关系最近,其次是大麦和小麦。长日照处理下,FaFKF1基因在苗期、分蘖期、孕穗期和抽穗期的叶片中均有表达,相对表达量变化趋势也较相似,均在ZT8时（即下午16:00）达最高峰,呈现出24 h的昼夜节律,但在孕穗期和抽穗期的相对表达量明显较高。在长日照和短日照基础上施加不同光照处理下,FaFKF1基因均能通过自身调节来适应环境的变化,虽然表达峰出现时间不一致,但整体上能维持24 h的昼夜节律。【结论】FaFKF1基因在细胞核发挥作用,且在不同光照下均呈现节律表达,受光周期的诱导调控。     

盐穗木HcGKR基因亚细胞定位表达载体的构建及定位分析

[目的]以GFP基因为报告基因,构建HcGKR基因的亚细胞定位表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM- T- HcGKR质粒为模板,获得HcGKR基因的目的片段.然后将其克隆到亚细胞定位表达载体35S:GFP中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的35S - GFP - HcGKR融合表达载体,使目的基因能够和GFP融合同时表达.采用基因枪法将35S - GFP - HcGKR转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h后,经共聚焦显微镜观察确定发出绿色荧光的位置,对HcGKR基因进行亚细胞定位.[结论]构建的亚细胞定位表达载体可在植物细胞中表达,通过洋葱细胞中绿色荧光的位置确定目的基因定位在细胞膜上,为进一步盐穗木HcGKR基因的功能奠定了理论基础.     

葡萄VvGA2ox1基因克隆、亚细胞定位及时空表达分析

以‘藤稔’葡萄(Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujiminori’)的花序、叶片和果实为试材,利用RT-PCR结合RACE技术,成功克隆了葡萄VvGA2ox1基因的cDNA序列,全长1 331 bp,共编码332个氨基酸。该基因在GenBank数据库的登录号为JQ608472。序列比对结果表明:VvGA2ox1与矮牵牛和棉花同源基因的氨基酸序列相似度分别为71.26%和71.08%。进一步构建了VvGA2ox1的亚细胞定位表达载体,定位结果显示,VvGA2ox1蛋白定位于细胞膜上。半定量RT-PCR与定量RT-PCR结果均表明,VvGA2ox1在葡萄花序、叶片和果实等器官中均有表达,但在花序、幼叶和小果中的表达水平较高。     

蚓激酶F-Ⅲ-1基因植物表达载体的构建

[目的]探讨蚓激酶F-III-1基因在烟草中的高效表达。[方法]以经烟草密码子优化、人工合成的蚓激酶成熟肽F-III-1为目的基因,以p CAMBIA3301和p BA002质粒为基础,构建由35S启动子调控、抗草铵膦基因(bar)为选择标记的植物表达载体。[结果]成功构建了4个植物表达载体,分别是p CAMBIA3301-F-III-1、p CAMBIA3301-F-III-1-6x His、p BA002-F-III-1和p BA002-F-III-1-6x His。[结论]4个植物表达载体的成功构建为探讨蚓激酶在植物中的表达及其植物反应器生产奠定了基础。     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

Cloning and Bioinformatics Analysis of ZmERECTA-LIKE1 and Construction of Plant Expression Vector

Objective] This study was conducted to clone and analyze ERECTA-LIKE1 gene in Zea mays by PCR and bioinfor-matics methods and to construct plant expression vector pCambia3301-zmERECTA-LIKE1. [Method] zmERECTA-LIKE1 (zmERL1) gene was obtained using RT-PCR, and physical-chemical properties were analyzed by bioinformatics methods, including domains, transmembrane regions, N-Glycosylation potential sites phosphorylation sites, and etc. [Result] Bioinformatics results showed that zmERL1 gene was 2 169 bp, which encoded a protein consisting of 722 amino acids, 11 N-glycosylation potential sites and 42 kinase specific phosphorylation sites. According to CDD2.23 and TMHMM Server v. 2.0 software, there were leucine-rich repeats, a PKC domain and a transmembrane region in this protein. The theoretical pI and molecular weight of zmERL1 encoded protein was 6.20 and 79 184.8 using Compute PI/Mw tool. Furthermore, we constructed the plant expression vector pCambia3301-zmERECTA-LIKE1 by subcloning zmERL1 gene into pCambia3301 instead of GUS. [Conclusion] The results provide a theoretical basis for the application of zmERL1 gene in future study.     

草莓乙烯受体Ers1基因反义植物表达载体构建

[目的]构建草莓Ers1基因反义植物表达载体,为探明该基因的功能以及采用生物技术方法改良草莓品种奠定基础。[方法]根据已克隆的草莓乙烯受体Ers1基因序列及表达载体pBI121上的酶切位点设计1对带限制性内切酶位点的特异性引物,以Ers1基因的测序质粒为模板,PCR扩增到草莓Ers1基因片段,克隆片段及载体经双酶切消化后,回收产物定向连接,将克隆片段反向补插入到植物表达载体pBI121的35S和gusA之间,构建成该基因的反义植物表达载体。[结果]经酶切鉴定,成功构建了草莓Ers1基因反义植物表达载体。[结论]该研究为进一步探讨Ers1基因功能及利用生物技术方法调控果实成熟衰老进程,从而改善草莓果实的贮运性能奠定基础。     

甘蔗ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建

[目的]为甘蔗的基因工程育种提供理论基础和技术储备。[方法]从甘蔗嫩叶中提取总RNA,根据GenBank中甘蔗ACC氧化酶cDNA序列设计2对引物,利用RT-PCR技术扩增甘蔗ACO cDNA序列。构建甘蔗ACO cDNA正义植物表达载体和反义植物表达载体,并利用含ACC氧化酶基因的植物重组表达载体转化根癌农杆菌感受态细胞。[结果]从甘蔗嫩叶中提取总RNA的OD260/OD280为1.90,说明提取RNA完整性好、纯度高,完全可满足cDNA逆转录的要求。所获得的甘蔗ACC氧化酶cDNA序列全长为969bp,与GenBank中甘蔗ACOcDNA的核苷酸序列同源性为98.6%,氨基酸序列同源性为97.5%。成功构建了正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco,并将其导入根癌农杆菌EHA105中。[结论]该研究为研究该基因的功能和培育甘蔗转基因新种质资源奠定了基础。     

花生栽培品种转录因子基因DREB1的克隆及表达载体构建

本研究从33个花生栽培品种中克隆获得干旱胁迫响应转录因子基因PNDREB1,经序列分析发现,33个栽培品种PNDREB1的核苷酸序列同源性为100%,并构建了植物表达载体p GBDREB1,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

油菜抗逆基因CBF1植物表达载体的构建及对拟南芥的转化

通过RT-PCR技术从油菜中克隆到抗逆相关基因CBF1,将其成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304,并通过农杆菌采用Floral dip法将重组表达载体转入拟南芥。经潮霉素抗性筛选和PCR检测,初步证明,油菜CBF1基因已经转入到拟南芥中。     

拟南芥抑芽基因SPS的克隆及植物表达载体的构建

通过PCR方法从拟南芥基因组DNA中克隆了SPS基因,序列分析表明,与Genebank公布的序列完全一致。然后,将该基因亚克隆到植物表达载体pBI121上,并将载体pBI121上的CaMV35S启动子替换为烟草伤诱导启动子POD,构建成植物表达载体pBISPSPOD。     

尾穗苋凝集素（ACA）基因植物表达载体的构建

尾穗苋凝集素（Amaranthus caudatusagglutin in,ACA）是一种存在于尾穗苋种子中的贮藏蛋白,属苋菜凝集素家族,对同翅目害虫如蚜虫、褐飞虱、叶蝉等有明显的致死作用。植物表达载体pCAMB IA2300-35S-OCS带有35S启动子及终止序列、卡那霉素（Kan）抗性基因NPTⅡ。载体pGEMT-ACA含有ACA基因,通过PCR扩增出ACA基因。把植物表达载体pCAMB IA2300-35S-OCS和扩增后的ACA基因用KpnⅠ和SalⅠ双酶切后经连接酶连接,得到植物表达载体pCAMB IA2300-ACA。将该载体分别导入农杆菌GV3101和LBA4404进行保存。     

MxIrt1基因瞬时表达载体的构建及其定位的初步研究

以绿色荧光蛋白为标记,构建瞬时表达载体pMxIRT1-GFP。以基因枪轰击洋葱表皮细胞,通过激光共聚焦显微镜(Confocal)观察,MxIrt1基因主要定位在细胞膜上。