重组鸡α-干扰素对鸡新城疫感染的治疗及疫苗免疫的影响

对试验鸡进行新城疫人工感染的干扰素治疗试验,试验SPF鸡分成5组,1～3组分别于攻毒前24h、攻毒的同时和攻毒后24h注射重组鸡α-干扰素,4、5组作为病毒对照和空白对照。同时,还进行了重组鸡α-干扰素对新城疫弱毒苗和灭活苗免疫效果的影响试验,结果显示,试验2、3组的平均死亡时间明显延长,免疫试验免疫后14d注射重组鸡α-干扰素可以降低新城疫抗体的滴度。     

重组鸡α-干扰素的表达及其生物活性的初步研究

为获得重组鸡α-干扰素并对其进行生物活性研究,本试验对重组大肠杆菌进行诱导表达,收集重组鸡α-干扰素包涵体后进行复性纯化及免疫印迹试验,并通过测定病毒EID₅₀,在接种H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的鸡胚中进行干扰素抗病毒活性试验,运用微变量细胞病变抑制法进行重组鸡α-干扰素抗病毒效价的测定。结果显示复性后重组鸡α-干扰素的免疫印迹试验成功获得了预期条带,在鸡胚中重组鸡α-干扰素具有显著的抗H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等活性作用。在CEF/VSV细胞系上测定重组鸡α-干扰素的抗病毒效价为1.5×2¹⁰ U/mg左右,高浓度重组鸡α-干扰素具有一定的细胞毒性。结果表明重组鸡α-干扰素蛋白具有免疫原性和抗原性,在鸡胚内具有较好的抑制或杀灭H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的效果,呈广谱性,抗病毒效价较高,为下一步抗病毒制品的创制奠定基础。     

重组鸡α-干扰素对鸡传染性法氏囊炎的治疗试验

重组鸡α-干扰素是一种抗病毒蛋白，具有广谱的抗病毒活性，对多种病毒有抑制作用。为了验证其治疗效果，在本试验中，我们使用法氏囊标准强毒BC6／85对易感日龄的SPF鸡进行人工感染与治疗试验，在攻毒后临床症状出现时使用10万单位、1万单位和0．1万单位三个剂量的重组鸡α-干扰素进行了治疗试验，同时使用法氏囊卵黄抗体做为对照药品，进行对比试验。结果表明，与攻毒对照组相比较，重组鸡α-干扰素能够显著降低试验鸡的发病数量，减轻其临床发病症状和法氏囊病变，并且在生产性能上具有较好的增重作用，其中以1万单位的中剂量重组鸡α-干扰素效果最为显著。     

成疫病毒F基因疫苗接种剂量的研究

以新城疫病毒Ｆ基因的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐｃＤＮＡ３重组，构建了新城疫病毒Ｆ基因疫茵。采用不同剂量接种ＳＰＦ鸡后，通过抗体监测和强毒攻击试验，分析了其诱导的体液免疫应答及免疫保护作用。结果表明，接种剂量为１００，２００ｕｇ时，试验鸡在免疫后第２周出现较明显的抗体反应，接种剂量为１０ｕｇ时抗体变经不明显。以标准强毒Ｆ４８Ｅ９攻击后，空白对照组及接种剂量为１０，１００ｕｇ组的鸡只全部发病死亡，未获得     

新城疫病毒F基因疫苗接种剂量的研究

以新城疫病毒F基因的cDNA与真核表达载体pcDNA3重组 ,构建了新城疫病毒F基因疫苗。采用不同剂量接种SPF鸡后 ,通过抗体监测和强毒攻击试验 ,分析了其诱导的体液免疫应答及免疫保护作用。结果表明 ,接种剂量为1 0 0 ,2 0 0ug时 ,试验鸡在免疫后第 2周出现较明显的抗体反应 ,接种剂量为 1 0ug时抗体变化不明显。以标准强毒F4 8E9攻击后 ,空白对照组及接种剂量为 1 0 ,1 0 0ug组的鸡只全部发病死亡 ,未获得免疫保护 ;而 2 0 0ug组鸡只 30 %存活 ,获得部分免疫保护。表明基因免疫效果与接种的剂量有密切的关系     

α-干扰素在猪流感病毒感染急性期的作用

细胞因子,尤其是α-干扰素（IFN-α）在控制流感病毒感染过程中发挥着重要作用。为了研究IFN-α在流感过程中的作用,给感染流感病毒的模型动物猪接种IFN-α中和单克隆抗体（Abs）K9。首先确定了IFN-α中和Abs的最佳接种剂量与接种途径,据此研究Abs对猪流感病毒感染的效果。给猪气管内接种半数鸡胚感染量为106的H1N1流感病毒,接种18 h后,分别给试验猪气管内和腹膜内注射高剂量的IFN-α中和Abs和对照Abs。试验猪分别于接种后0、24、30、487、2 h安乐死。在接种后24和30 h,接种K9猪的气管-肺泡灌洗液中IFN-α明显减少,并伴随IL-6和IL-12的减少,而对照抗体处理组TNF-α和IL-1的水平未受影响。最重要的是,IFN-α中和单克隆抗体处理组动物出现临床症状推迟了24 h,同时伴随IFN-α的减少,但是并没有对病毒的复制及肺脏的病变产生明显的影响。试验结果表明,IFN-α对IL-6和IL-12有诱导作用,3种细胞因子在抗猪流感中起重要作用。     

重组鸭α-干扰素的表达与鉴定

根据大肠杆菌密码子的偏好性,试验对GenBank中已经发表的鸭α-干扰素基因序列进行密码子优化,人工合成后构建原核表达质粒pET30a-DuIFNα-ELP;将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达制备DuIFNα-ELP;通过SDS-PAGE切胶方法得到纯化的DuIFNα-ELP;纯化产物免疫小鼠后收获血清,用Western blotting验证免疫血清的特异性,并用ELISA法检测其特异性抗体滴度。根据类弹性蛋白多肽(ELP)温度敏感的可逆相变特性,通过重复可逆相变循环(ITC),在高盐离子浓度和临界温度下纯化重组蛋白,并采用微量细胞病变抑制法在MDCK/VSV系统中检测重组蛋白的抗病毒活性。结果表明:合成的重组鸭α-干扰素基因能成功表达,重组蛋白DuIFNα-ELP约80 ku,免疫小鼠可产生特异性抗体,抗体效价为1∶1000000。抗病毒试验检测重组DuIFNα-ELP的抗病毒活性为1.0×106U/mL,比活性为1.25×106U/mg。这一结果为研制广谱、安全、高效的基因工程鸭α-干扰素提供参考,也为检测体内外DuIFNα的表达奠定了基础。     

α-干扰素在猪流感病毒感染急性期的作用

细胞因子，尤其是α-干扰素（IFN-α）在控制流感病毒感染过程中发挥着重要作用。为了研究IFN-α在流感过程中的作用，给感染流感病毒的模型动物猪接种IFN-α中和单克隆抗体（Abs）K9。首先确定了IFN-α中和Abs的最佳接种剂量与接种途径，据此研究Abs对猪流感病毒感染的效果。给猪气管内接种半数鸡胚感染量为10^6的H1N1流感病毒，接种18h后，分别给试验猪气管内和腹膜内注射高剂量的IFN—α中和Abs和对照Abs。     

牛α干扰素在新城疫病毒La Sota疫苗株中的高效稳定表达及抗病毒活性检测

研究在已有的新城疫病毒La Sota株反向遗传系统的基础上,利用新城疫病毒La Sota株作为表达载体,构建表达牛α干扰素(bovine interferon α)完整开放阅读框的全基因组质粒pFL-BoIFN α,转染BHK-21细胞获得表达牛α干扰素重组新城疫病毒.采用RT-PCR方法检测,证实收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒含有相应外源基因.将重组病毒尿囊液经紫外线照射灭活新城疫病毒,利用表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒(VSV-EGFP)在牛肾细胞(MDBK)上测定rL-BoIFN α抗病毒活性,证实表达牛干扰素的重组新城疫病毒尿囊液能有效抑制VSV-EGFP在牛肾细胞上的复制,rL-BoIFNα接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性高达2× 107 IU/mL.结果表明: 牛α干扰素在重组新城疫病毒rL-BoIFNα接种的SPF鸡胚尿囊液中获得良好表达,并具有高效而稳定的抗病毒活性.     

鸡新城疫病毒F基因疫苗接种剂量的研究

本研究以新城疫病毒 Ｆ 基因的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 与真核表达载体ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 重组，构建了新城疫病毒 Ｆ基因疫苗。采用不同剂量接种 Ｓ Ｐ Ｆ鸡后，通过抗体监测和强毒攻击试验，分析了其诱导的体液免疫应答及免疫保护作用。结果表明，接种剂量为１００μｇ、２００ μｇ 时，试验鸡在免疫后第 ２ 周出现较明显的抗体反应，接种剂量为 １０ μｇ 时抗体变化不明显。以标准强毒 Ｆ４８ Ｅ９ 攻击后，空白对照组及接种剂量为１０ μｇ 和１００ μｇ 组的鸡只全部发病死亡，未获得免疫保护；而２００ μｇ 组鸡只全部存活，获得完全免疫保护。表明基因免疫效果与接种的剂量有密切的关系。     

α-干扰素在猪流感病毒感染期间的作用

细胞因子,尤其是α-干扰素对控制流感病毒感染起重要作用。为了研究α-干扰素对控制流感的作用,用猪α-干扰素中和单克隆抗体K9来建立猪流感病毒感染模型。首先,确定α-干扰素中和单克隆抗体最佳剂量和给药途径,基于上述结果来研究单克隆抗体对猪流感病毒感染的作用。猪气管内接种106.0EID50A/Swine/Belgium/1/98(H1N1)病毒,接毒后18h,气管内和腹腔内注射高剂量α-干扰素中和单克隆抗体和对照抗体,分别于接种后0、24、30、48、72h对动物实施安乐死。在24、30h注射单克隆抗体K9的动物支气管肺泡灌洗液中α-干扰素水平被明显抑制,这与IL-6、IL-12水平降低一致。对照单克隆抗体处理组中α-干扰素和IL-1水平未受影响。重要的是α-干扰素中和单克隆抗体处理的动物临床症状出现和高峰要延迟24h,同时伴随α-干扰素的抑制,但对病毒复制和肺部病变无明显的作用。结果表明,在流感病毒症状中,α-干扰素对IL-6、IL-12诱导及3种细胞因子起重要作用。     

犬干扰素α2与犬白蛋白融合基因在昆虫细胞中的表达与活性分析

本研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达具有生物活性的犬白蛋白-犬干扰素α2(albumin-CaIFN-α2)。将蜂素信号肽(HBM)、犬血清白蛋白(Alb)与犬干扰素α2的融合基因经密码子优化后,连接至转移载体pFastBac1中,获得了重组pFastBac1-HBM-Alb-CaIFN-α2,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经过三次蓝白斑筛选纯化,得到的重组穿梭质粒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2转染Sf9细胞,72 h后可观察到明显的细胞病变。用第三代重组杆状病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2感染Sf9昆虫细胞,感染3 d后,收获昆虫细胞和细胞培养物,间接免疫荧光(IFA)结果显示,重组杆状病毒感染的细胞呈现绿色荧光;Western blot检测结果显示,在约90 ku左右可观察到特异性条带,证实重组Alb-CaIFN-α2能够在昆虫细胞中表达。利用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测重组Alb-CaIFN-α2的抗病毒活性,结果显示重组Alb-CaIFN-α2的活性为1.70×10~6 U·mL~(-1),为进一步研究新型犬用干扰素制品奠定了试验基础。     

禽流感-新城疫二联重组活疫苗(rLH5-6株)对产蛋鸡群免疫效果观察

本试验通过禽流感(AI)-新城疫(ND)二联重组活疫苗(r LH5-6株)以不同的免疫途径和免疫剂量单独使用以及分别和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株)、鸡新城疫灭活疫苗联合使用,免疫产蛋鸡群,定期采样监测禽流感(H5-6株)及新城疫抗体效价,根据各试验组免疫抗体效价、持续时间及免疫抗体合格率,评价禽流感-新城疫二联重组活疫苗的免疫效果,确定加强免疫的时间间隔及适宜的免疫程序。试验结果表明,单独使用禽-新二联重组活疫苗免疫产蛋鸡群和单独使用禽流感二价灭活疫苗相比,禽流感HI平均抗体效价低(仅在3log2左右),但仍能产生有效的保护,新城疫平均抗体效价可达6~8log2,70%以上的免疫抗体合格率能维持2个月左右。禽-新二联重组活疫苗与禽流感二价灭活疫苗联合使用,和单独使用禽流感二价灭活疫苗相比,禽流感HI平均抗体效价有所提高,且维持时间较长,70%以上的免疫抗体合格率至少维持6个月,新城疫HI平均抗体效价稍低于单独使用禽-新二联重组活疫苗的平均抗体效价。禽-新二联重组活疫苗与新城疫灭活疫苗联合使用,和单独使用新城疫灭活疫苗相比,导致新城疫HI平均抗体有所降低,且70%以上的免疫抗体合格率仅能维持6个月左右,禽流感HI平均抗体效价与单独使用禽-新二联重组活疫苗相比,没有明显差异。禽-新二联重组活疫苗肌注免疫的效果优于饮水免疫,而不同免疫剂量,在免疫效果上没有明显差异。建议,对于产蛋鸡群,单独使用禽流感-新城疫二联重组活疫苗时,可每间隔2个月按说明书剂量进行一次饮水或肌注加强免疫,单独使用禽流感二价灭活疫苗时,可每间隔4个月按说明书剂量进行一次肌注加强免疫;对于产蛋鸡群禽流感免疫,禽-新二联重组活疫苗可联合使用禽流感二价灭活疫苗,每间隔6个月用禽流感二价灭活疫苗按说明书剂量进行一次加强免疫,期间每间隔2个月再单独使用禽-新二联重组活疫苗按说明书剂量进行一次饮水或肌注加强免疫;对于产蛋鸡群新城疫免疫,新城疫灭活疫苗不宜和禽-新二联重组活疫苗联合使用。     

鸡α-干扰素注射液对肉鸡生长性能、屠宰性能和免疫功能的影响

试验旨在研究不同剂量的鸡α-干扰素对肉鸡生长性能、屠宰性能和免疫功能的影响,以确定鸡α-干扰素的适宜注射剂量。120只1日龄AA肉鸡随机分为4组,每组3个重复。第1组为对照组,肌肉注射生理盐水0.6 mL/只;第2~4组为试验组,分别肌肉注射1 000 U、10 000 U和100 000 U鸡α-干扰素0.6 mL/只。结果显示:第3组肉鸡的平均体重显著高于第1组(P0.05),全净膛率显著高于其他各组(P0.05);第3、4组十二指肠肠壁厚度显著薄于第1组(P0.05);试验组回肠肠壁厚度显著薄于对照组(P0.05)。研究表明,鸡α-干扰素注射液具有改善肉鸡生长性能和屠宰性能的作用,适宜注射剂量为10 000 U/只。     

脂质体包被鸡IL-18可增强新城疫活疫苗的免疫效果

首次将重组鸡白细胞介素18(mChIL-18)用脂质体包被,将不同浓度的mChIL-18脂质体联合新城疫疫苗对鸡群进行免疫,观察其对新城疫疫苗的免疫增强作用。1日龄SPF鸡分为6组,分别为空白对照组、单纯疫苗组、新城疫疫苗+0.2mL mChIL-18组、新城疫疫苗+0.1mL mChIL-18组、新城疫疫苗+0.3mL mChIL-18组和新城疫疫苗+空载体对照组。所有免疫组鸡于7日龄免疫,免疫后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用血凝抑制试验和流式细胞仪来检测免疫鸡的HI抗体水平及CD4+和CD8+T淋巴细胞的变化情况。并于最后一次采血后,对各组试验鸡应用F48E9标准强毒进行攻击(100ELD50.只-1)。结果表明mChIL-18脂质体的最佳剂量为0.2mL.只-1,其不仅能够显著增强机体的细胞免疫和体液免疫,而且还可以明显提高新城疫疫苗的保护率。     

禽流感-新城疫重组二联苗对石岐杂快大型肉鸡免疫效果研究

对江门地区两个种鸡场的H5、H9及ND母源抗体进行了监测,发现雏鸡19日龄时禽流感H5亚型母源抗体水平低于4log2,确定禽流感-新城疫重组二联苗首免日龄为20日龄;经禽流感-新城疫重组二联苗免疫后,肌肉注射和点眼滴鼻免疫的实验鸡组禽流感(H5)和新城疫(ND)抗体水平明显高于其它组群,肌肉注射2头份组H5抗体可在六天内升至4log2以上;肌肉注射2头份和点眼滴鼻组2头份组新城疫(ND)抗体水平达到4log2以上。     

重组鸡α-干扰素对新城疫病毒复制的影响

毕赤酵母表达鸡α-干扰素经纯化后,以50000U、5000U和500U分别与200ELD50新城疫病毒疫苗株LaSota和中等毒力Q株等量混合,接种9～10日龄SPF鸡胚,记录鸡胚死亡情况并测定尿囊液HA效价,结果表明,高浓度重组干扰素可使病毒致死鸡胚时间延长,并使Q株在尿囊液中的HA效价下降2～3个滴度。     

重组猪α-干扰素喷干粉剂的制备及其效果评价

为制备一种高活性、低价格重组猪α-干扰素（PoIFN-α）,采用喷雾干燥技术制备出重组猪α-干扰素（rPoIFN-α）喷干粉剂,并通过对rPoIFN-α喷干粉剂的稳定性,安全性,治疗效果等质量标准进行综合评价。结果显示,本试验制备的重组猪α-干扰素喷干粉剂质量稳定性,有效期暂定为两年;除10倍剂量rPoIFN-α喷干粉剂导致猪肝脏轻微脂肪样病变,其余各较低剂量rPoIFN-α喷干粉剂对猪无毒副作用;人工感染和临床应用试验表明rPoIFN-α喷干粉剂对猪腹泻具有显著的治疗效果。以上试验结果为PoIFN-α喷干粉剂的工程化生产及其在养猪业中的应用打下了基础。     

鸡γ-干扰素联合新城疫活疫苗对肉鸡免疫效果的研究

选用350只1日龄罗氏308商品肉鸡,比较不同剂量的鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)在新城疫活疫苗免疫前、后使用以及与疫苗同时使用对淋巴细胞刺激指数、巨噬细胞吞噬指数以及鸡新城疫HI抗体滴度的影响。结果显示:各试验组淋巴细胞刺激指数(SI)均高于空白对照组,表现差异显著(p<0.05);与疫苗对照组相比,疫苗免疫后给药组SI优于免疫前给药组和同时给药组,其中两次免疫后给药组好于一次免疫后给药组,500IU/羽的使用剂量优于100IU/羽;ChIFN-γ在免疫的不同时期使用均能有效提高巨噬细胞吞噬指数;两次免疫后给药组较疫苗对照组能明显提高28日龄以后新城疫抗体滴度,表现差异显著(P<0.05);一次免疫后给药组和免疫前给药各组的新城疫抗体滴度及变化趋势与疫苗对照组接近;但同时给药组各日龄段的新城疫抗体滴度都明显低于疫苗对照组。本试验结果显示ChIFN-γ联合新城疫活疫苗使用有助于提高疫苗免疫效果,其使用最佳时机为新城疫活疫苗免疫后使用,使用剂量为500IU/羽。     

禽流感-新城疫重组二联活疫苗与重组禽流感灭活疫苗组合免疫效果观察

为进一步了解、掌握禽流感-新城疫重组二联活疫苗及与重组禽流感灭活疫苗组合使用的免疫效果,本研究以麻花鸡作为试验对象,制定了4种不同的免疫程序,分别对4组试验鸡群进行免疫,通过测定各组鸡只产生的免疫抗体效价和免疫抗体合格率,以评价二联活疫苗及与禽流感灭活疫苗的免疫效果。试验结果表明:禽流感-新城疫重组二联活疫苗单独用于肉鸡禽流感H5免疫预防抗体效价低于4 log2;建议禽流感-新城疫重组二联活疫苗可以与重组禽流感病毒灭活疫苗组合使用,两种疫苗免疫时间间隔2周左右,以免抑制机体产生对新城疫的免疫应答。