栗疫病菌泛素核糖体L40融合蛋白基因的克隆与分析

用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)泛素融合蛋白基因从COGEME(Consortium for the functional genomics of microbial eukaryotes)植物病原菌EST(Expressed sequence tag)库中BLAST(Basic local alignment search tool)得到栗疫病菌的泛素融合蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为387 bp,编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析结果表明,泛素融合蛋白前体包括氮末端的泛素结构域(76个氨基酸残基)和碳末端的核糖体蛋白L40结构域(52个氨基酸残基).该蛋白为高碱性蛋白,碳末端含有一个"锌指"模式结构.与19个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性.     

栗疫病菌RAN/GSP1基因的克隆与分析

用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)ScGSP1蛋白基因从COGEME植物病原菌EST库中BLAST得到栗疫病菌的GSP1蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为651 bp,编码216个氨基酸残基组成的GSP1蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析表明,GSP1蛋白前体包括GTPase结合结构域和碳端细胞核定位序列,与21个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌GSP1蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性.     

中华蜜蜂王浆多肽Apisimin基因转录、克隆与表达研究

构建中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂头部cDNA文库并进行了测序,从8568个表达序列标签(expression sequencetag,EST)中获得96个Apisimin基因克隆,结果表明Apisimin基因是一个高丰度转录的基因。进一步对克隆分析表明该基因cDNA全长为379 nt,包含一个237 nt、可以编码78个氨基酸的ORF。推导的Apisimin蛋白N端含有一个由24个氨基酸残基组成的信号肽,后端为54残基、预计分子量为5.9kDa的成熟肽。该ORF与意大利蜜蜂和印度蜜蜂的Apisimin基因核苷酸同源性分别为100%和95%。将成熟肽编码区进行亚克隆,构建了Apisimin与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX/apisimin,并将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行融合表达。SDS-PAGE和薄层扫描表明,表达的融合蛋白分子量为31 kDa,表达量占细菌总蛋白的22.1%,约50%是可溶性的。通过亲和柱进一步纯化了表达的融合蛋白。     

绵羊Noggin基因的克隆、序列分析与原核表达

根据同源序列克隆原理设计一对引物,以绵羊脑组织总RNA的反转录产物为模板,利用RT-PCR扩增绵羊Noggin基因cDNA全长编码区,克隆到pMD-18T载体。测序验证后,提取pT-Noggin质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收目的条带,亚克隆到pET41a原核表达载体,转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。序列分析表明,绵羊Noggin基因的cDNA全长编码区(GenBank登录号为FJ751853)为699bp,编码232个氨基酸,与其他哺乳动物氨基酸序列同源性达到95%以上。SDS-PAGE结果显示,诱导表达的融合蛋白大小为60ku,与预期蛋白大小一致。Western blot检测结果显示,该蛋白为His融合蛋白。说明成功克隆了绵羊Noggin基因的编码区序列,构建了原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白。     

高羊茅FaGST1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

[目的]克隆高羊茅谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因FaGST1,并进行亚细胞定位及表达分析,为深入研究该基因的抗逆分子调控提供理论依据.[方法]采用RT-PCR和RACE从高羊茅黔草1号中克隆FaGST1基因,对其进行生物信息学分析,构建植物融合表达载体pCAMBIA1300-FaGST1-GFP,通过农杆菌介导转入烟草叶片表皮细胞,观察FaGST1基因亚细胞定位情况,并利用实时荧光定量PCR检测高盐、高温、干旱及低氮胁迫处理下高羊茅叶片中该基因的表达情况.[结果]克隆获得FaGST1基因cDNA全长序列为1003 bp,开放阅读框(ORF)为681 bp,编码227个氨基酸残基,其编码蛋白的分子量约25.60 kD,理论等电点(pI)为5.58,亲水指数平均值-0.342,不稳定系数32.96,为稳定的亲水蛋白,定位于细胞核.FaGST1蛋白二级结构中,α-螺旋占50.44%,β-转角占5.75%,无规则卷曲占30.54%,延伸链占13.27%.FaGST1蛋白的保守结构区域为含有G位点的N末端结构域和含有H位点的C末端结构域.FaGST1蛋白与黑麦草GST蛋白(AMY26594.1)的氨基酸序列相似性最高,为93%,其次是海滨雀稗GST蛋白(AMN87043.1),为91%,与玉米(ACG39365.1)和小米(KQK86785.1)GST蛋白氨基酸序列相似性均在80%以上,与系统发育进化树分析结果基本相符,即FaGST1蛋白与黑麦草、海滨雀稗、玉米和小米等禾本科植物GST蛋白亲缘关系较近.高羊茅FaGST1基因在干旱、高温、高盐胁迫和低氮胁迫处理下均出现抑制表达.[结论]FaGST1基因负向调控高羊茅逆境胁迫响应.     

蜡梅花香基因SAMT的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

[目的]研究蜡梅花香基因SAMT cDNA的克隆及表达。[方法]以蜡梅花瓣总RNA为模板进行RT-PCR,扩增得到与预期大小相同的PCR产物带,回收RT-PCR产物,将其与PMD18-T载体进行T-A克隆连接并导入大肠杆菌DH5α,经菌落PCR和双酶切鉴定,筛选带有目的基因的重组质粒并进行测序。[结果]测序证实成功克隆得到蜡梅花香基因SAMT cDNA的ORF片段,其长度为1 196 bp,编码380个氨基酸残基,与已报导的蜡梅SAMT(ABU88887)的同源性为99.2%。将SAMT基因亚克隆到原核表达载体PGEX4T-1中获得重组菌种命名为PGSAMT,用0.01 mol/L的IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,SAMT的融合表达蛋白分子量约为66 kDa,与预期的26 kDa的GST带和42.3 kDa的蜡梅SAMT基因编码蛋白构成的融合蛋白大小接近。[结论]该研究成功克隆并表达蜡梅花香基因SAMT。     

H1亚型猪流感病毒广东株HA基因的原核表达

为了研制猪流感检测试剂和流感亚型特异性单抗筛选所需的重组抗原,本研究克隆和原核表达了H1N1亚型猪流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因.首先采用RT-PCR方法扩增了H1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的HA基因.测序结果表明,扩增的SIV HA基因cDNA长度为 1 701 个核苷酸,共编码566个氨基酸.BLAST分析表明,H1N1亚型SIV广东株HA基因核苷酸序列与GenBank中已发表的中国香港特别行政区、中国大陆、美国分离的经典H1亚型毒株相近,核苷酸序列同源性在89%以上.然后将HA基因的cDNA片段亚克隆至pET32a( )表达载体中,构建重组质粒pET32a-H1,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析表明,HA基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25.2%.经免疫印迹证实重组蛋白可以被SIV特异性抗体所识别.     

四翅滨藜BADH基因的克隆、序列分析及其原核表达

在构建四翅滨藜(Atriplex canescens)全长cDNA文库中通过随机克隆测序并进行EST分析基础上,得到1个四翅滨藜甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)的cDNA序列,命名为AcBADH。AcBADH cDNA包含1个长度为1 500 bp的完整开放阅读框,编码500个氨基酸,属于ALDH-SF超家族,其核酸序列与中亚滨藜的BADH基因的同源性为98%,对应编码氨基酸序列同源性为99%。将得到的序列提交GenBank(登录号:JF776157)。与其他植物BADH的氨基酸序列比对,AcBADH具有相同功能区域,包括N-端信号肽,底物结合及酶催化位点,因而推测可以参与甜菜碱的合成反应。对AcBADH与其他植物BADH的氨基酸序列的进化分析表明,AcBADH与鞑靼滨藜、中亚滨藜的亲缘关系较近。将AcBADH基因与原核表达载体pET28a连接,进行融合表达,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子质量约58 kD的蛋白。     

中华蜜蜂mrjp3基因cDNA的克隆及序列分析

 以东方蜜蜂（Apis cerana）mrjp3基因部分片段为探针筛选中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）8日龄工蜂头部cDNA文库，得到120个阳性克隆。对这些阳性克隆进行进一步的筛选和序列测定，获得含有中蜂MRJP3 (AccMRJP3)cDNA的阳性克隆，对阳性克隆的插入片段进行测序，得到AccMRJP3的cDNA序列全长。中蜂MRJP3的cDNA全长为1 987 bp（包括10 bp长的poly A尾巴），包含一个长1 779 bp，编码593个氨基酸的ORF，在5'端和3'端各有一个长46 bp和160 bp的非编码区。类似于西方蜜蜂（Apis mellifera）和大蜜蜂（Apis dorsata），由AccMRJP3 cDNA编码的氨基酸序列也存在一个长片段重复区。但比较结果显示中蜂、西方蜜蜂、大蜜蜂MRJP3重复区之间存在一定差异。     

野生大豆种子cDNA文库构建及其球蛋白基因克隆

以优质野生大豆(Glycine soja)的近成熟种子为材料成功构建了野生大豆cDNA文库,库容量为9.594×105克隆,文库的重组率约为93.7%。PCR检测重组克隆的插入片段平均大于1 000bp,表明构建的近成熟种子cDNA文库质量较高。从文库中随机挑选252个克隆进行3′端测序,得到217条表达序列标签(EST),测序结果表明,片断大于500bp;野生大豆与栽培大豆(Glycine max)球蛋白的cDNA序列存在99%相似性。     

Cloning and Sequence Analysis of cDNA Encoding MRJP3 of Apis cerana cerana

By screening the worker （Apis cerana cerana） heads cDNA library using a fragment of the mrjp3 gene of Apis cerana as probe, 120 positive clones were obtained. The clone containing A. cerana cerana MRJP3 （AccMRJP3） cDNA was selected. Based on the sequencing of the inserts of the positive clone, a sequence of AccMRJP3 cDNA which is 1 887 bp long including a poly （A） tail was obtained. The AccMRJP3 cDNA encompassed an open-reading frame （ORF） with 1 779 bp encoding 593 amino acids. The un-translated regions （UTR） of the 5′ end and 3′end are 46 bp and 160 bp in length, respectively. Similar to AmMRJP3 and AdMRJP3, the putative AccMRJP3 also has a repetitive region. The comparison of the repetitive region of AccMRJP3, AmMRJP3 and AdMRJP3 shows some differences between them.     

中华蜜蜂GnRH相关受体的基因克隆及表达研究

[目的]克隆中华蜜蜂(Apis cerana cerana)促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)相关受体基因,对其进行表达研究。[方法]利用RT-PCR技术克隆了中华蜜蜂的GnRH相关受体基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析和表达产物的原位杂交组织化学研究。[结果]序列分析显示,GnRH相关受体的cDNA序列全长1 177 bp,开放阅读框长1 050 bp,编码349个氨基酸残基。推导的氨基酸序列具有7个跨膜区;预测的分子量和等电点分别为40.6 kD和9.54。聚类分析显示该蛋白质与其他已知昆虫的GnRHRⅡ具有较近的亲缘关系。原位杂交显示GnRH相关受体基因在中华蜜蜂的脑、精巢、脂肪体以及肠道等组织均有表达。[结论]该研究结果表明GnRH相关受体为昆虫提供了生殖和新陈代谢之间的分子纽带,其在协调昆虫的生殖活动和环境状况的关系中执行了一定的功能。     

中华蜜蜂GnRH相关受体的基因克隆及表达研究(英文)

[目的]克隆中华蜜蜂(Apis cerana cerana)促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)相关受体基因,对其进行表达研究。[方法]利用RT-PCR技术克隆了中华蜜蜂的GnRH相关受体基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析和表达产物的原位杂交组织化学研究。[结果]序列分析显示,GnRH相关受体的cDNA序列全长1177bp,开放阅读框长1050bp,编码349个氨基酸残基。推导的氨基酸序列具有7个跨膜区;预测的分子量和等电点分别为40.6kD和9.54。聚类分析显示该蛋白质与其他已知昆虫的GnRHRⅡ具有较近的亲缘关系。原位杂交显示GnRH相关受体基因在中华蜜蜂的脑、精巢、脂肪体以及肠道等组织均有表达。[结论]该研究结果表明GnRH相关受体为昆虫提供了生殖和新陈代谢之间的分子纽带,其在协调昆虫的生殖活动和环境状况的关系中执行了一定的功能。     

中华蜜蜂蜂毒明肽基因克隆及生物信息学分析

【目的】掌握中华蜜蜂蜂毒明肽基因的生物信息,为进一步深入研究其生理功能及通过生物工程技术生产蜂毒明肽产品奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆中华蜜蜂蜂毒明肽基因,并对所获得的基因组序列进行详细的生物信息学分析。【结果】从蜜蜂头部和胸部组织中成功扩增获得511bp的蜂毒明肽基因序列,该序列GC碱基含量仅为24%,包含一个141bp的开放阅读框,编码46个氨基酸残基;该序列与肥大细胞脱颗粒肽的同源性高达58%,存在较明显的信号肽序列和跨膜区结构。【结论】蜂毒明肽是一种小分子抗菌肽,存在较明显的信号肽序列和跨膜区结构,具有生物抗菌肽的典型特性,但需进一步加工切除信号肽序列后才能发挥作用。     

中华蜜蜂MRJP7基因的原核表达及多克隆抗体的制备

用PCR方法从含中华蜜蜂Accmrjp7基因的质粒DNA模板中扩增出MRJP7成熟肽编码区片段,将该片段克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中进行融合表达,SDS—PAGE和薄层扫描显示,该基因得到高效表达,表达产物大小约为66kDa,占细胞总蛋白的22．8％。利用割胶回收的方法,获得目的蛋白,注射兔子制备多克隆抗体,并利用所获抗体进行Western blot印迹分析,检测MRJPs,获得特异性条带。     

中华蜜蜂Apidaecin的重组表达及其抗菌活性

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）抗菌肽Apidaecin在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的重组表达,并验证纯化后的重组抗菌肽Apidaecin在体内和体外是否具有抗菌活性,为开发新型、安全具有抗菌和免疫调节功能的抗菌肽制剂提供理论依据。【方法】以意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）Apidaecin为模板,克隆出中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,成功构建his-pHT43/Apidaecin表达载体,并参照MoBiTec所提供的制备方法成功制得枯草芽孢杆菌感受态细胞,现配现用,以保证其活性并得以在枯草芽孢杆菌表达系统中重组表达。使用His标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）进行表达蛋白的分离纯化,使用Easy II Protein Quantitative Kit（BCA）试剂盒测定浓度。纯化得到的重组抗菌肽Apidaecin作用于大肠杆菌K88,在体外进行抑菌圈试验和最小浓度抑菌法测定;在体内,以小鼠为试验动物模型,试验组小鼠腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin,阴性对照组注射相同体积的生理盐水,阳性对照组注射相同体积的头孢霉素,然后人为感染大肠杆菌K88,感染24 h后对小鼠进行解剖,取得肠道样品和血液样品,并从肠道屏障和免疫功能两个方面探讨重组抗菌肽Apidaecin对感染大肠杆菌K88小鼠的保护作用。使用ELISA试剂盒对染菌小鼠血清免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）与肠道sIgA水平进行测定,采用qRT-PCR法对小鼠肠道紧密连接蛋白基因（claudin-1、ZO-2）以及小鼠肠道细胞因子（促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL6和抑炎因子IL10）的转录水平进行测定。【结果】克隆得到的中华蜜蜂Apidaecin含有183 bp的碱基,编码60个氨基酸,包含Apidaecin的信号肽序列、一个基础的RR二肽以及抗菌肽Apidaecin的氨基酸序列（内含高度保守的8个氨基酸序列）,编码的蛋白质命名为AccApidaecin,其分子量为15.6 kD,等电点为5.33。在IPTG终浓度为3 mmol·L ^-1,诱导温度为30℃,诱导表达12 h后,可从1 L表达上清中纯化得到约20 mg抗菌肽。药敏试验显示,重组抗菌肽Apidaecin在体外与阴性对照相比有明显抑菌圈出现,且测得的最小抑菌浓度为10 mg·L ^-1;在小鼠体内,腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin的染菌试验组与注射生理盐水的染菌试验组相比免疫球蛋白含量差异显著(P<0.05),说明腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin能够有效缓解由大肠杆菌K88引起的小鼠免疫球蛋白含量的增加;同时,小鼠肠道相关蛋白的基因表达量也差异显著(P<0.05),说明重组抗菌肽Apidaecin能够有效保护被大肠杆菌K88侵染的小鼠肠道。【结论】在枯草芽孢杆菌中能够成功重组表达中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,并且纯化后的中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin在体外对大肠杆菌K88有良好的抗菌效果;经腹腔注射进入小鼠体内,能够提高小鼠的免疫机能,有效抵抗大肠杆菌K88对小鼠的侵染。     

中华蜜蜂气味结合蛋白基因AcerOBP14的克隆及时空表达

【目的】克隆获得中华蜜蜂(Apis cerana cerana)Acer OBP14基因序列,并对其蛋白结构进行预测,分析其在不同组织和发育阶段的时空表达差异,为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织c DNA为模板利用RT-PCR技术扩增和克隆获得Acer OBP14 c DNA全长序列,并提交至Gen Bank数据库;利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;采用MEGA5.2软件中的邻位相连法(neighbor-joining,NJ)构建Acer OBP14及其同源膜翅目昆虫OBPs的系统发育树;通过实时荧光定量PCR技术分析Acer OBP14在1、5、10、15、20、25和30日龄中华蜜蜂不同组织(触角、头、胸、腹、足和翅)中m RNA的表达情况。【结果】克隆获得了中华蜜蜂气味结合蛋白基因Acer OBP14的c DNA序列(Gen Bank登录号为KT24648)。Acer OBP14的开放阅读框(ORF)长度为408 bp,编码135个氨基酸,预测其蛋白分子量为15.08 k D,理论等电点为5.44,有信号肽,无跨膜结构,且第18—127位氨基酸之间存在一个昆虫气味结合蛋白家族PBP-GOBP superfamily保守结构域;存在多个比较明显的疏水区域,可能是脂溶性气味分子的结合位点;含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。亚细胞定位分析表明,Acer OBP14属于分泌型蛋白,主要集中在内质网-高尔基体-质膜分泌途径上。Acer OBP14蛋白具有7个α螺旋,α1—α6属于典型OBPs核心螺旋,α7位于C端且暴露在蛋白表面。氨基酸同源序列比对结果显示,Acer OBP14与西方蜜蜂Amel OBP14的氨基酸序列一致性最高,达到86%;其次是大蜜蜂Ador GOBP56a-like,一致性为55%。系统进化树分析表明,同为蜜蜂属的中华蜜蜂Acer OBP14、西方蜜蜂Amel OBP14、大蜜蜂Ador GOBP56a-like、中华蜜蜂Acer OBP21和小蜜蜂Aflo GOBP56d-like聚为一个分支,切叶蜂属的苜蓿切叶蜂Mrot GOBP56a-like、侧沟茧蜂属的毁侧沟茧蜂Mdem GOBP83a-like、壁蜂属的角额壁蜂Ocor OBP3和熊蜂属的Bter GOBP56d-like和Bimp GOBP56d-like聚为另一大分支。荧光定量PCR结果显示,Acer OBP14在成蜂不同发育期的触角、头、胸、腹、足和翅中均有表达,其表达程度有差异。1日龄工蜂的胸部表达量最高,触角次之,且两者均极显著高于头、腹、足和翅(P0.01);其他日龄工蜂触角表达量均极显著高于其他组织(P0.01),其中20日龄工蜂的触角表达量最高。从各组织在不同发育阶段的表达量来看,触角的表达量在1日龄最低,极显著地低于其他日龄(P0.01);5、10日龄逐渐增加,15日龄突然下降,20日龄达到最高,极显著高于其他日龄(P0.01);之后又呈逐渐下降趋势。头、胸、腹、足和翅膀表达量总体上随日龄增加而呈下降趋势,5日龄之后大幅下降,之后趋于平稳且呈低丰度表达。【结论】Acer OBP14属于Minus-C OBP亚家族,具有PBP-GOBP家族的典型结构;组织表达谱结果暗示,Acer OBP14属普通气味结合蛋白GOBP,在中华蜜蜂中除嗅觉识别之外还参与其他生理功能。     

中华蜜蜂化学感受蛋白基因家族克隆及表达特征分析

【目的】完成中华蜜蜂（Apis cerana cerana）化学感受蛋白（chemosensory proteins,CSPs）基因家族的序列及表达谱鉴定,解析中蜂整个CSPs家族的表达特征与分布规律,为中蜂CSPs的生物学功能研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术扩增,克隆获得中蜂CSPs基因家族全部6条基因序列的开放阅读框（ORF）全长,并利用real-time PCR技术对中蜂所有的CSPs序列在中蜂工蜂不同发育历期及不同器官表达特征进行研究。【结果】新克隆4条基因（Ac-CSP2、Ac-CSP4、Ac-CSP5和Ac-CSP6）的开放阅读框分别为354、387、315和378 bp,分别编码117、128、104和125个氨基酸残基,预测蛋白质分子量分别为13.01、14.61、12.46和14.63 kD,等电点分别为8.86、4.53、9.60和8.71,且均具有4个保守的半胱氨酸残基,均符合昆虫CSPs的一般生化特征。中蜂与意蜂CSPs同源基因家族间具有高达95%—99%的相似性。CSPs在中蜂不同发育时期及器官的表达特征结果显示,Ac-CSP1、2、3、4在卵、幼虫和蛹期几乎不表达,其中Ac-CSP1、2、4在触角中表达量最高,而Ac-CSP3在翅中表达量最高;Ac-CSP5在中蜂各个发育历期的表达量几乎相同;Ac-CSP6蛹期有较高表达,其余时期不表达。【结论】中蜂CSPs基因家族所有6个基因的氨基酸序列与意大利蜜蜂有较高的相似性,但二者各基因的表达谱在整体相似的情况下局部又存在着某些差异,为进一步研究该家族蛋白的生理功能机制奠定了良好基础。