琼氏不动杆菌菌株GXP04的苯酚降解特性

从南宁市郊被含酚废水污染的土样中筛选到一株高效苯酚降解细菌GXP04。该菌株能够在以苯酚为唯一碳源和能源的无机培养基上生长,通过形态观察及16Sr RNA编码序列同源性比较分析,我们鉴定该菌株为琼氏不动杆菌。初步确定了GXP04的最适生长和降解苯酚的温度为34℃,最适pH值为7．0。     

砀山酥梨肉桂酸4-羟化酶基因的克隆及表达分析

木质素是梨(Pyrus)石细胞的重要成分之一,木质素合成代谢对石细胞形成发育有着重要影响.肉桂酸4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H,EC l.14.13.11)是细胞色素单加氧酶超家族中CYP73A亚家族的一员,同时为木质素合成代谢中的一个关键酶.本研究从砀山酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Danshan Su)果实中克隆出一条肉桂酸4-羟化酶基因的全长cDNA序列,命名为PbC4H,GenBank登录号为:KF663548.PbC4H全长1 764 bp,具有1 515bp的ORF,编码504个氨基酸.PbC4H与多个物种C4H基因编码的氨基酸序列具有较高的同源性,说明其在进化过程中较为保守.结构域分析表明,PbC4H具有跨膜结构域和典型的细胞色素P450结构域特征.qRT-PCR分析发现在梨果实发育的不同时期,PbC4H基因表达量呈现先增加后下降的趋势,其中在花后55 d达到最高.构建了PbC4H原核表达载体pET-32a-PbC4H,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21菌株中诱导表达出PbC4H融合蛋白.亚细胞定位表明PbC4H蛋白定位于细胞膜上.本研究结果为利用分子生物学技术调控梨木质素的合成和石细胞的发育提供了基础资料.     

盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因(chyb)的克隆及表达分析

玉米黄质(3,3'-二羟基-β-胡萝卜素)是自然界中常见的一种β-胡萝卜素衍生物,是黄斑和视网膜中最关键的部分.玉米黄质是通过一系列酶作用合成,其中β-胡萝卜素羟化酶(chyb)是关键限速酶,为了研究盐生杜氏藻(Dunaliella salina)中不同胁迫下β-胡萝卜素羟化酶基因的表达及玉米黄质含量的变化.本研究采用RACE方法首次从盐生杜氏藻中扩增出β-胡萝卜素羟化酶基因(Dschyb),并分析强光、葡萄糖等因素对DSchyb表达及玉米黄质含量的影响.结果表明,该基因全长1 433 bp(GenBank登录号:JN118489),包含一个969bp的开放阅读框,编码322个氨基酸,氨基酸的分子量为35.51kD,等电点(PI)为9.01.DsCHYB包含有4个保守的组氨酸基序,与团藻及莱茵衣藻的同源性分别是64％和58％.DsCHYB具有4个跨膜结构及叶绿体导肽,进一步证明该酶定位于叶绿体类囊膜上.系统进化树分析标明,DsCHYB与其他绿藻如团藻(Volvox carteri f.Nagariensis)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的CHYB共处一个进化支,亲缘关系很近.Dschyb基因的表达调控研究显示,在经强光刺激24 h后,Dschyb 基因表达显著上调(P＜0.01),在48 h表达最高(P＜0.01).在经乙酸钠、硫酸亚铁和强光共同处理6h时,Dschyb表达急剧上升(P＜0.01),处理12h后下降;在葡萄糖处理1.5h后,其表达达到最高,6h后表达与对照组无显著性差异;添加放线菌素D后,Dschyb的表达相对对照降低,表明放线菌素D可能对葡萄糖诱导Dschyb表达具有抑制作用.高效液相色谱测定其玉米黄质含量,钠铁、强光及葡萄糖处理均能提高盐生杜氏藻的玉米黄质的含量,其玉米黄质含量比对照组分别增长16％(P＜0.05),28％(P＜0.05)和53％(P＜0.01).本研究结果为玉米黄质合成调控及其在藻类中功能研究提供理论指导.     

植物乳杆菌C88胞外多糖生物合成基因的克隆及序列比对

乳酸菌胞外多糖能显著改善发酵乳制品及食品的流变学和质构特性。为进一步了解乳酸菌胞外多糖的生物合成途径及调控机制,本研究对参与植物乳杆菌C88胞外多糖生物合成基因簇的部分序列进行了克隆和鉴定。根据GenBank中己报道植物乳杆菌基因序列的保守区域设计特异性引物,扩增出植物乳杆菌C88生物合成蛋白基因（cps4A）序列,并通过染色体步移方法克隆了植物乳杆菌C88参与胞外多糖合成基因簇的部分序列（4．9kb）。利用生物信息学方法预测基因簇中6个阅读框的结构和功能,结果表明该序列与己报道的乳酸杆菌胞外多糖生物合成基因具有高度的同源性（〉96％）;对各阅读框功能预测分析发现,这6个基因主要编码参与胞外多糖合成中的多糖合成蛋白、糖链长度检测蛋白、UDP-葡萄糖-4-异构酶和糖基转移酶。本研究将为利用基因工程方法调控多糖的合成和产量提供理论依据。     

八棱海棠MdPPO2B基因的克隆及降解苯酚研究

为了探索果树对酚类化合物的修复潜力,从八棱海棠中克隆获得多酚氧化酶基因Md PPO2B,并构建该基因植物超量表达载体,通过转化模式植物拟南芥研究该基因对酚类化合物的修复功能。结果表明,在平板、盆栽、液体3种试验中,不加入苯酚,转基因植株在生长状态和外部形态上和野生型相似;当苯酚浓度分别为0.1 m M和1 m M时,通过植物的根长、叶片鲜重等比较发现,转基因株系比野生型植株对苯酚的耐受性更强,其生长形态较为正常,而野生型植株的生长则受到了明显抑制。由此可见,Md PPO2B转基因植物的PPO活性在植物降解酚类化合物过程中起重要作用;使用果树来源的多酚氧化酶基因用于有机污染物修复,对环境治理具有较好的应用前景。     

茶树黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)的克隆及功能分析

黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是类黄酮代谢途径中的关键酶。本研究采用逆转录PCR技术,获取了茶树(Camellia sinensis)F3H的开放阅读框(open reading frame,ORF)包含1 107个碱基,编码含有368个氨基酸的蛋白质,推测分子量为41.46 kD,等电点为5.61;实时荧光定量PCR表明,CsF3H在叶片中表达量较高,且受光照影响;将此基因重组到表达载体PRSF上,导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中进行原核表达,优化原核表达的条件,结果表明,最佳诱导温度28℃、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度1.0 mmol/L、诱导时间5 h;利用高效液相色谱法(HPLC)对重组蛋白进行了体外酶活的检测,结果表明,重组目的蛋白具有F3H酶活性,可将反应底物柚皮素(N)和圣草酚(E)分别转化为二氢山奈素(DHK)和二氢槲皮素(DHQ);当E作为底物时,酶活性明显高于柚皮素。本研究结果为茶树F3H酶动力学研究和其器官组织特异性研究提供了基础资料。     

两株蜡样芽孢杆菌α-淀粉酶差异性分析及基因的克隆表达

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是产生具有重要工业生产价值的耐高温α-淀粉酶（α-amylase）的优良菌株。通过对两株蜡样芽孢杆菌（B905和B904）分泌的α-淀粉酶酶学性质研究,淀粉酶的活性稳定温度都在90℃-100℃,耐热性和酶活都不依赖Ca2＋,其它理化性质较为一致,但淀粉酶的分子量大小有明显的不同。PCR方法克隆得到了这两种耐高温淀粉酶的基因全长（amy905和amy904）,并在大肠杆菌诱导表达,结果显示：amy904基因长度为1362bp,其蛋白分子量约为55 KD;amy905基因长度为1761bp,其蛋白分子量约为68 KD。     

棕色棉类黄酮3'-羟化酶基因(F3'H)的克隆及色素合成途径中相关基因表达特性研究

为探讨花色苷途径在彩棉色素形成中的作用及彩棉色素形成规律,本研究根据葡萄(Vitis vinifera)的类黄酮3'-羟化酶(flavonoid3'-hydroxylase,F3'H)基因全长cDNA序列blast所得棉花(Gossypium hirsutum)的EST序列(GenBank登录号:DT545210,CO071403和BG447485)设计引物,以开花后16d的新彩棉5号(XC-5)纤维为材料,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)和RT-PCR方法分离得到了2个类黄酮3'-羟化酶基因的全长cDNA序列,长度为1761和1892bp,均含有一个97~1629bp、长度为1533bp的开放阅读框,编码510个氨基酸,将这两个序列命名为GhF3'H-1和GhF3'H-2,分别提交GenBank,登录号为HM598123和HM598124,此2个序列编码区完全相同,仅在3'非翻译区(UTR)存在片段长短的差异。半定量RT-PCR检测花色苷合成途径中查尔酮合成酶(chalcone synathase,CHS)基因、F3'H、类黄酮3',5'-羟化酶(flavon...     

猪Fas基因的克隆及序列分析

从PK-15细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出猪F as基因,将其克隆到PM D 18-T载体上,进行序列分析。结果表明,克隆的猪F as基因序列与G enB ank上登录的猪F as基因同源性为100%,与人、牛、羊的F as基因核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为73.4%、79.2%、76.4%和56.2%、67.0%、64.6%。F as蛋白胞内区的死亡域,其氨基酸序列在猪、人、牛和羊的F as基因中呈现较高的同源性。     

马哈利樱桃PGIP基因克隆及全序列测定

以马哈利樱桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｍａｈａｌｅｂＬ．）基因组ＤＮＡ为模板,用ＰＧＩＰ（多聚半乳糖醛酸酶抵制蛋白）基因保守序列为引物进行ＰＣＲ扩增,得到长度约为１．２ｋｂ的目的片段,将其克隆到ｐＵＣｍ－Ｔ载体上,进行序列测定,结果表明,目的片段全长１１９２ｂｐ,由２个外显子和１个内含子构成,外显子总长９９６ｂｐ,编码３３０个氨基酸,与杏的ＰＧＩＰ基因ｍＲＮＡ序列、编码的氨基酸序殓同源性分别达到９４．１％、     

荔枝铜锌超氧物歧化酶基因的克隆与序列分析

以"三月红"荔枝基因组DNA为模板,用Cu*ZnSOD基因特异寡聚核苷酸为引物,进行PCR扩增,得到特异基因片段,将其克隆到pGEMT载体上,转化感受态大肠杆菌TG1中,对转化子中重组pGEMT上的Cu*ZnSOD基因片段的PCR扩增检测和序列分析,表明克隆成功;该基因片段有478个核苷酸,由4个外显子和3个内含子组成;外显子由234个核苷酸组成,编码78个氨基酸;该基因片段编码的氨基酸序列与水稻、玉米、番茄、大白菜和松树的Cu*ZnSOD基因编码的氨基酸序列的同源性分别为79.5%、73.1%、73.1%、71.8%和75.7%.     

Ralstonia eutropha菌株镉抗性调节基因CzcR的克隆与序列测定

G细菌镉抗性决定子是一个编码4个蛋白的CzcCBAD操纵子,参照GenBank已登录Czc基因序列进行引物设计,利用PCR技术,从可在含350mg/LCdCl2的培养基上生长的抗镉菌株Ralstoniaeutropha质粒中,扩增出长度约为1200bp的革兰氏阴性细菌镉抗性系统中的抗性调节基因CzcR,然后将其亚克隆到pGEM-T-easy载体上,并转化至受体菌中,构建重组质粒,采用碱性裂解法提取质粒DNA后,经EcoRI酶切分析和核苷酸序列分析,其与GenBank中登录的CzcR基因序列相似性高达98%,显示其具有正确的CzcR基因核苷酸序列。镉抗性基因的获得将大大推动对微生物抗重金属机理的研究,并为进一步构建耐镉基因工程菌,高效净化重金属污染环境打下坚实的基础。     

碱性土壤基因组DNA的分离纯化和基因文库的构建

直接从广西南宁市凤凰纸业排污沟碱性土壤样品中抽提和分离纯化混合基因组DNA，所获得DNA的产量为每克土壤样品10～30pg。采用限制性内切酶EcoR1酶处理后，构建了以pGEM-3Zf( )为载体的DNA部分文库。文库的容量为23650个转化子。外源片段DNA平均大小为3．2kb。建库效率为每克环境样品获得6000个左右的含1～15kb外源随机插入片段的克隆。通过DNA序列测定和同源性比较，对从文库随机词取的16个转化子序列进行分析，发现13个外源插入片段包含序列尚未确定的DNA片段。     

水稻－土壤系统中铬和苯酚的复合污染下的食物安全指数

The pot-culture method combined with chemical and staistical analyses was used to get basic data for determination of the food-seurity indexes related to combined pollution of Cr and phenol in soil-rice systems. Regression analyses accordig to the experimental result indicated that the critical concentrations of Cr and phenol in brown rice were 0.37 and 0.33 mg kg^-1 ,respectively,under the condition of Cr-phenol combined pollution.     

广西巴马小型猪肥胖基因（leptin）成熟肽序列的cDNA克隆、序列分析

以广西巴马小型猪的脂肪组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增出巴马小型猪的leptin基因成熟肽序列,经纯化回收后连接到pMD18-T载体上,经鉴定后测序。研究结果表明,本试验克隆到leptin基因成熟肽cDNA序列,其长度为441bp,与GenBank中报道的猪leptin成熟肽cDNA序列同源性高达99．06％,与奶牛、家鼠、马等物种的成熟肽cDNA序列间同源性可达到84．5％以上,证明leptin基因具有较高的保守性。同时发现,与普通猪相比,巴马小型猪leptin基因成熟肽cDNA序列有四处存在碱基突变,均为元义突变。     

克雷伯氏菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

以基因组DNA为模板,利用PCR技术从克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中扩增得到含有1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的DNA片段,将其定向连接到克隆质粒pGEM-3xf上,得到重组质粒pGEM-dhaT。将此重组质粒转化到受体菌Escherichia coli DH5α中,通过蓝白斑鉴定挑选出阳性菌株。DNA序列分析表明其基因全长为1185bp。将该片段插入表达载体pSE380,构建成重组子pSE-dhaT,并在E．coli JM109中获得表达,经SDS-PAGE检测,表达产物分子质量与天然纯1,3-丙二醇氧化还原酶(DHAT)相同,约为43ku。     

五指山小型猪生长激素及其受体基因的克隆与序列分析

动物生长发育调控是一个高度复杂而精细的生理过程,受多种因素如神经、体液、遗传、营养及环境等的影响。其中,动物神经内分泌生长轴各因子(激素、受体、结合蛋白等)及其基因对动物的生长发育起着关键的作用。正常情况下,下丘脑接受体内外的信息,生长激素释放激素(grow thhorm one releasing horm one,GHRH)和生长抑素(som atostatin,SS),调节垂体生长激素(grow thhorm one,GH)的分泌,GH通过与生长激素结合蛋白(grow th horm one b ind ing protein,GHBP)结合而运输,与靶器官上的生长激素受体(grow th horm one receptor,GHR)结合,促使类胰岛素生长因子(insu lin-like grow th factors,IGFs)的产生并进入血液循环,IGFs再通过其结合蛋白(insu lin-likegrow th factor b ind ing protein,IGFBP)转运到全身组织细胞,促使组织细胞的生长与分化。五指山猪(Wuzhishan Pig,WZSP)是一种原产于中国海南省山区的小型猪。五指山猪成年体重仅为35 kg,是正常猪体重的15%~30%,是一种频临灭绝的珍稀物种。五指山猪具有以下特征:体型小,性成熟早,肉质好,耐近交和遗传稳定。为了开发和应用这一珍稀猪种的遗传资源,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所从1989年就已经开始对五指山猪进行近交系培育,现在已经获得五指山猪近交系18代(近交系数为0.974),但五指山猪的矮小机理至今不明。为了探讨五指山猪矮小的分子机理,对五指山猪生长激素及其受体基因进行了克隆和序列分析。从纯种近交16代五指山猪的垂体和肝组织提取总RNA,根据GenBank中猪生长激素及其受体基因的序列(登录号分别为X53325,NM214254)设计特异性引物,对五指山猪生长激素及其受体基因进行扩增,然后对PCR产物进行回收、克隆测序。测序结果表明,五指山猪生长激素基因开放阅读框长651 bp,编码216个氨基酸,其中包含26个氨基酸的信号肽;生长激素受体基因编码区编码639个氨基酸,其中包含18个氨基酸的信号肽。运用生物学软件DNAssist 2.2将五指山猪和普通猪的生长激素基因编码区进行比对发现,五指山猪生长激素基因的编码区有4个突变:26号位置发生C→T突变,该突变导致缬氨酸代替丙氨酸;65号位置发生G→A突变,该突变导致谷氨酰胺替换精氨酸;114号位置发生T→C突变,252号位置发生A→G突变,但是这两个突变都未引起所编码氨基酸的变化。五指山猪和普通猪生长激素受体基因比对发现,1143号位置的G→T突变引起天冬氨酸替换谷氨酸;1225号位置的G→T突变导致丝氨酸替换丙氨酸;1666号位置C→G突变导致缬氨酸替换亮氨酸;1739号位置C→G突变导致丙氨酸被甘氨酸所代替;1801号位置G→A突变导致缬氨酸被异亮氨酸代替;1248号位置G→A突变,1287号位置G→A突变和1827号位置G→C突变均为同义突变,未引起相应编码氨基酸的变化。五指山猪生长激素基因有两处氨基酸替换,这两处替换发生在信号肽区,对成熟蛋白的结构和功能没有影响,但是有可能会影响蛋白的运输。五指山猪生长激素受体基因突变都发生在生长激素受体的胞内结构域,这些突变可能改变生长激素受体的空间构像,从而对生长激素受体的胞内信号转导产生一定的影响,影响生长激素-生长激素受体-胰岛素样生长因子轴的信号级联,削弱生长激素的促生长作用。     

氯粘康酸环异构酶基因克隆及序列研究

研究从土壤中分离出1株降解2,4-二氯酚能力较强的假单胞菌菌株“GT241-1”,并从中克隆出参与降解2,4-二氯酚的氯粘康酸环异构酶基因(dcpC),该基因编码的氯粘康酸环异构酶可将2,4-二氯-顺,顺-粘康酸转化为反式-2-氯-双烯内酯。采用的基因克隆策略是用Southern杂交对其邻近基因进行定位后构建基因组文库,再用斑点杂交从基因文库中筛选目的转化子。经序列测定得知dcpC基因编码区1110bp,且核苷酸和推测的编码氨基酸序列分析表明dcpC属氯粘康酸环异构酶基因家族,并与该基因家族的其他基因有一定差异。