猪链球菌2型基因芯片检测技术的建立

选取猪链球菌2型的cps2J基因设计引物和探针,通过PCR扩增Cy3标记的DNA片段与固定于芯片上的探针进行杂交,并将杂交完毕的芯片进行信号扫描分析,根据荧光信号的强度来确定是否存在猪链球菌2型。结果表明,采用浓度为5μmol/L的探针与PCR产物杂交30min即可得到清晰的荧光信号,表明基因芯片检测技术是一种灵敏度高、特异好的检测方法。该方法的建立可以快速有效地对猪链球菌2型做出诊断,具有较好的应用前景。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测

根据GenBank发表的猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly)全序列,利用O ligo(7.0)软件设计并合成了可扩增长度为495 bp的引物,从SS2参考菌株ATCC43765和SS2江苏分离株HA9801中扩增出495 bp的条带,利用HindⅢ限制性内切酶对具有相应单一酶切位点的PCR扩增产物进行酶切,获得预期的314 bp和181 bp的2个DNA片段,检测灵敏度达到2.5×102CFU.mL-1;但不能从马链球菌兽疫亚种ATCC35246、大肠埃希氏菌ATCC25922、单增李斯特杆菌ATCC19115/413、金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212中扩增出相应的条带。PCR扩增产物的测序结果与GenBank的猪链球菌sly基因(Z36907)核苷酸序列完全一致。该方法可快速、敏感、特异地检测SS2的溶血素基因。     

猪链球菌2型PCR-ELISA检测方法的建立与优化

根据已发表的猪链球菌2型的cps2j基因序列,设计合成上游标记生物素的1对引物和1条标记地高辛的特异性探针,建立了该菌的PCR-ELISA检测方法。方法利用PCR仪作为杂交场所,并对几个主要条件参数进行优化,结果显示在鲑鱼精DNA浓度1.6mg·mL-1、变性温度为94℃、变性时间为1min、探针浓度为0.5umol·mL-1、杂交温度55℃、杂交时间1min、一抗作用时间45min、二抗作用时间40min时检测方法敏感性最好,特异性最强。通过对17个阴性样本检测,测得平均值为0.057,方差为0.047,计算得临界值为0.198。     

PCR方法检测2型猪链球菌2种毒力因子

根据 2型猪链球菌毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)与细胞外蛋白因子 (EF)基因 (mrp与 epf)序列 ,分别设计、合成一对引物 ,建立聚合酶链反应 (PCR)方法。该方法扩增出 2型菌株的 mrp大小为 885 bp,epf为 62 6bp,而对马链球菌兽疫亚种 (C群 )、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪肺炎霉形体等 PCR均未扩增出任何条带。用 Xba 和 H ae 分别酶切 PCR扩增产物 ,均获得与预计一致的酶切图谱 ,PCR扩增产物测序结果显示 :其基因序列分别与 Gen Bank上公布的mrp全基因第 5 0 0～ 1 3 1 5位碱基及 epf全基因第 2 441～ 3 0 2 8碱基对一致。PCR检测的敏感度可达 1 0 0个细菌。用建立的 PCR对从病猪体内分离的菌株进行检测 ,检测的 1 5株 2型分离株中有 1 3株 mrp与 epf均为阳性 ,为典型的高毒力表现型菌株 (mrp epf ) ,1株为 mrp epf- ,1株为 mrp- epf- 。     

猪链球菌2型溶血素基因PCR快速检测方法研究

根据猪链球菌2型的溶血素(haemolysin)的基因序列设计一对引物,成功地扩增了溶血素基因,并建立了检测溶血素的PCR方法.用EcoRⅠ限制性内切酶进行酶切,获得了与预期大小一致的869 bp和633 bp的两个片段.同时另设计一对内引物,进行巢式PCR,亦能扩增出预期片段.PCR检测的敏感程度可达100个细菌;对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌和猪放线杆菌等的PCR检测结果均呈阴性.表明建立的猪链球菌2型溶血素PCR检测方法,其特异性和敏感性均很高,可作为猪链球菌病快速诊断的方法.     

猪链球菌2型福建株的分离鉴定

从临床表现为败血症的濒死病猪肝脏、肺脏、淋巴结中分离到一株链球菌,进行形态学、生化特性、小白鼠感染试验及PCR鉴定和CPS2 J序列测定.结果表明:该分离菌的形态、培养和生化特性基本符合链球菌的特点;人工感染试验显示,小白鼠腹腔接种0.2 mL分离菌培养物不发病,但接种1 mL能在48 h内致小白鼠死亡,并能从脏器中分离到接种菌;分离菌的PCR扩增产物与猪链球菌2型阳性参考菌株JA070109大小一致、长度为675 bp的特异性条带,其PCR产物的核苷酸序列与GeneBank上公布的猪链球菌2型不同菌株的同源性高达98%-100%.可见,该分离菌为猪链球菌2型,并首次证实福建存在猪链球菌2型.     

坏死梭杆菌斑马鱼模型建立与LD50的测定

建立斑马鱼人工感染坏死梭杆菌动物模型。牛源坏死梭杆菌FN(AB)株以3×1010cfu/mL、3×109cfu/mL、3×108cfu/mL、3×107cfu/mL不同菌量,腹腔接种斑马鱼,定时观察斑马鱼的发病和死亡情况,建立动物感染模型。FN(AB)对斑马鱼的半数致死量(LD50)为1.06×106cfu/尾;感染发病鱼呈现出侧游、腹水、注射部位出血红肿等症状,肝脏、肾脏、肠道出现明显的病理学变化。斑马鱼可作为坏死梭杆菌致病性研究的动物模型。     

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白的黏附作用

为研究猪链球菌 2型 (SS2 )的毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)的黏附作用 ,进行了如下试验 :1 用黏附计数法比较菌株HA980 1(MRP+ )和SH0 0 6 4 4 4 (MRP-)的黏附动力学 ,两菌株均能黏附于HEp 2细胞 ,MRP+ 株的最大黏附菌数显著高于MRP+ 株 (P <0 0 5 ) 。 2 菌体置 5 6℃ 1h ,或用胰酶或半乳糖预处理 ,细菌黏附力完全丧失 ;分别用高碘酸、溶菌酶、秋水仙素和DNaseⅠ处理HEp 2细胞 ,前者可完全阻断HA980 1对它的黏附 ,后三者使黏附菌数显著下降。3 用纯化的MRP处理HEp 2细胞 ,或用抗MRP兔血清或MRP的单克隆抗体处理菌体 ,MRP+ 株的黏附菌数显著降低(P <0 0 5 ) ,但不能被完全抑制 ;用抗MRP-株全菌兔血清处理菌体 ,也能降低MRP+ 株的黏附菌数。 4 半乳糖或 5 6℃预处理MRP ,使其完全丧失对HA980 1的黏附抑制功能 ,但胰酶、过氧化氢和巯基乙醇的预处理没有明显的影响。结论 :MRP是SS2的一种黏附素 ,半乳糖可阻断其黏附作用     

多重PCR鉴定猪链球菌2型毒力菌株

为了鉴定猪链球菌2型毒力菌株,根据猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的荚膜多糖基因(capsular polysaccharide 2J,cps2J)、溶菌酶释放蛋白基因(muramidase-released protein,mrp)、毒力相关序列orf2基因(virulent-associate sequence orf2)设计合成3对引物,建立三重PCR检测方法,并对PCR扩增产物进行测序、酶切、特异性及敏感性实验。结果显示:26株SS2致病菌株均同时扩增出这3个目的片段,5株其他血清型猪链球菌(SS1,SS7,SS9)及13株非猪链球菌的其他猪源链球菌(兰氏B群、C群和D群)均未扩增出cps2J和mrp片段,检测结果与菌株的已知毒力因子背景完全相符。26株SS2的扩增片段经HincⅡ酶切鉴定,与预期结果一致。以SS2四川株ZY05719为模板的三重PCR产物(cps2J,mrp,orf2)测序结果与GenBank上相关序列比较,同源性分别为99%、100%、94%。该PCR敏感极限是600个细菌/每个反应。本试验所建立的三重PCR,特异性强,敏感性好,可用于实验室的快速诊断。     

屠宰生猪体内猪链球菌2型带菌情况调查

应用猪链球菌2型定型PCR方法,对从福建省3个屠宰场采集的临床健康的生猪鼻咽拭子样本共121份进行了检测,同时对阳性样本进行了细菌分离鉴定及毒力基因检测。结果显示：121份样本中有17份为阳性,检出率为14．0％（17／121）,其中福州地区检出率为10．9％（7／64）,宁德地区检出率为11．8％（4／34）,莆田地区检出率为26．1％（6／23）。3株分离菌cps2J基因PCR特异性扩增产物大小均为675bp,其核苷酸序列与Genebank中猪链球菌2型参考菌株的同源性高达98％～100％,毒力基因型为gdh^＋／cps2J^＋／mrp^＋／ef^-／sly^-／fbps^＋／orf2^＋。调查结果表明,福建省福州、宁德、莆田等地区生猪群中均存在猪链球菌2型携带者,所分离到的3个猪链球菌2型菌株其毒力基因型为新的基因型。     

荧光定量PCR检测猪链球菌2型主要毒力因子方法的建立

[目的]建立荧光定量PCR检测猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein,MRP)和胞外因子(Extracellular protein factor,EF)3种主要毒力因子的方法。[方法]根据cps2j、mrp和ef基因的基因序列,分别设计并合成3对引物及相应的Taqman探针,其中cps2j和mrp的5'端标记FAM荧光发射基团,ef的5'端标记HEX荧光发射基团,3种基因的3'端都标记BHQ1淬灭荧光基团。通过优化反应体系和程序,建立了一种基于Taqman探针法的荧光定量PCR方法检测上述3种主要毒力因子,其中cps2j单独检测,mrp与ef的实行双重荧光PCR方法检测。[结果]cps2j、mrp和ef的最低检测限分别为12、51和51 CFU,灵敏度很高;与其他病原菌无交叉反应,重复性及特异性均较好;此外,整个检测过程在60 min内即可完成。[结论]该试验所建立的双重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可用于同时快速检测猪链球菌2型3种主要毒力因子。     

猪链球菌2型毒力因子gapdh基因的克隆·表达及与Hela细胞互作蛋白的筛选

[目的]克隆并在大肠杆菌中表达猪链球菌2型毒力因子gapdh基因,寻找与GAPDH互作的受体蛋白.[方法]扩增猪链球菌2型甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapdh基因并构建表达质粒pET28a-gapdh.[结果]在大肠杆菌BL21 （DE3）中成功表达了约41 kDa的融合蛋白GAPDH.Western blot试验说明GAPDH具有良好的免疫学活性.利用新西兰大白兔制备抗GAPDH蛋白的多克隆抗体.运用配体重叠技术,在HeLa细胞中初步找到了一个与GAPDH蛋白作用的潜在受体蛋白.[结论]为进一步研究猪链球菌2型的分子致病机理奠定基础.     

上海部分地区猪链球菌2型的流行病学调查及其耐药性

猪链球菌2型是一种重要的人兽共患病病原,由其引起的猪链球菌病给养猪业带来巨大的危害。本研究通过PCR方法扩增谷氨酸脱氢酶(GDH)基因和荚膜多糖(CPS)基因检测猪链球菌2型,对上海部分地区猪链球菌2型的流行病学进行调查,并对分离到的菌株进行生化鉴定及耐药性研究。结果显示,上海部分地区猪链球菌的检出率为41.2%(103/250),猪链球菌2型的检出率为12.4%(31/250),猪链球菌2型占猪链球菌的30.1%。猪链球菌2型菌株对四环素、链霉素和氯霉素的耐药性最为严重,多数菌株呈多重耐药性,其中以4重耐药性为主。这为上海地区猪链球菌病的监管提供了依据,并对临床治疗使用抗生素具有参考价值。     

猪链球菌2型在小型猪模型体内的动态分布

实验采用SPF小型猪建立猪链球菌2型的动物模型,将14头SPF小型猪随机分为实验组和对照组,实验组肌肉注射2 mL的1×109 CFU.mL-1菌液,对照组注射2 mL无菌培养基。攻毒后利用细菌培养和PCR技术定期检测体内血液和组织中的细菌动态分布情况。实验发现SS2侵入血液的速度很快;扁桃体是该菌的定植器官,SS2对肝脏、肾脏等实质器官的黏附性无明显差异;只有出现神经症状及死亡仔猪,才能从脑组织中分离到SS2,说明细菌突破血脑屏障,进入大脑可能是引发脑膜炎的前提。试验为研究该病的致病机理提供了依据。     

毛蕊花糖苷抑制2型猪链球菌的溶血素蛋白活性而降低其小鼠致病性

为了探究天然化合物毛蕊花糖苷(verbascoside, VBS)对2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2, SS2)致病性的作用,本研究通过测定最低抑菌浓度、绘制细菌生长曲线及红细胞溶血试验,发现低浓度下的毛蕊花糖苷不影响猪链球菌的正常生长,但对其溶血活性有显著抑制作用;免疫印迹试验表明,毛蕊花糖苷不影响2型猪链球菌分泌溶血素蛋白(suilysin, SLY);通过分子对接预测毛蕊花糖苷可与SLY的2个氨基酸残基(SER-388、GLN-441)形成3条氢键结合从而使毛蕊花糖苷嵌入SLY蛋白的第4结构域,同时体外溶血活性试验进一步证实毛蕊花糖苷可直接抑制SLY介导的溶血活性;最后,小鼠体内试验结果表明,毛蕊花糖苷可明显提高2型猪链球菌感染小鼠的存活率。综上,毛蕊花糖苷在不影响2型猪链球菌生长活性的情况下,可通过抑制溶血素活性来降低2型猪链球菌对小鼠的致病性。     

多重PCR方法检测猪链球菌主要致病血清型及其毒力因子

根据猪链球菌基因序列,设计合成10对引物,通过在3个反应体系Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中的组合优化,建立涵盖7种猪链球菌主要毒力因子mrp、epf、sly、gdh、gapdh、orf2和fbps及猪链球菌主要致病性血清型(2、7、9型)的快速敏感的多重PCR检测方法.对不同菌株检测结果显示,该多重PCR方法特异性强、敏感性高,能快速检测出猪链球菌2、7、9型及其毒力因子表型,可用于快速诊断及猪链球菌的分子流行病学调查.     

猪链球菌2型灭活疫苗对小鼠的免疫效果评价

在前期筛选出2株毒力强、抗原性好、遗传稳定的猪链球菌2型(SS2)疫苗菌株(HF2、HF3株)并分别制成灭活疫苗(采用ISA 201 VG矿物油佐剂)的基础上,进一步与SS2商品化灭活疫苗(HA9801株,铝胶佐剂)同步免疫小鼠,利用间接ELISA、流式细胞术、免疫攻毒试验、细菌定植试验和病理组织学观察等方法测定小鼠血清中IgG抗体效价,细胞因子含量(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1),外周血中CD4⁺/CD3⁺、CD8⁺/CD3⁺ T细胞亚群含量,攻毒保护率,组织荷菌数和病理组织变化等指标。结果显示,二免7 d后,HF2、HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组的血清IgG抗体效价分别为1:25 600、1:12 800、1:25 600;HF2灭活疫苗组的IL-4、IL-10含量显著高于HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组,IFN-γ、TNF-β含量显著高于HF3灭活疫苗组,但MCP-1含量显著低于HF3灭活疫苗组;HF2和HF3灭活疫苗组的CD4⁺/CD3⁺ T细胞比率均显著低于HA9801商品化灭活疫苗组,但CD8⁺/CD3⁺ T细胞比率差异不显著;HF2、HF3灭活疫苗和HA9801商品化灭活疫苗对小鼠的攻毒保护率均为100%;HF2灭活疫苗组小鼠的肺、脾脏组织荷菌数显著低于HF3灭活疫苗组;HF2灭活疫苗组小鼠的肺、肾、脾脏病理变化较HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组轻微。综合结果表明,由SS2(HF2株)制备的ISA 201 VG佐剂灭活疫苗免疫小鼠后不仅可产生较强的免疫应答,还可完全抵抗强毒株的攻击。