一株Class Ⅰ新城疫病毒中国分离株分子特性的研究

摘要：对从健康家鸭中分离到的一株Class Ⅰ新城疫病毒分离株Duck／China／08—004／2008进行了遗传进化特性研究。利用RT-PCR扩增了该分离株F基因的主要功能区片段。并进行了克隆与序列分析。序列测定结果已经登录到GenBank,登录号为EU589149。该分离株F蛋白裂解位点的组成为112E—Q—Q—E—R—L117,具有典型新城疫弱毒株的分子特征。同源性分析表明其与国内普遍使用的弱毒疫苗株LaSota和V4核苷酸的同源性较低（分别为55．4％和57．7％）。通过构建F基因的遗传进化树,结果表明该分离株在分类地位上属于Class Ⅰ,与我国目前普遍使用的弱毒疫苗株LaSota（Class Ⅱ中的基因Ⅱ型）和V4（ClassⅡ中的基因Ⅰ型）处在不同的进化分支。通过构建57株ClassⅠ新城疫病毒的遗传进化树．表明本分离株与近年来香港活禽市场分离株较为类似．同属于基因3型。     

新城疫病毒分子流行病学研究进展

新城疫在世界范围内已经引起了4次大流行,每次大流行都是由一种新基因型引起的。尽管新城疫病毒只有1个血清型,但其基因型众多。论文主要综述了新城疫病毒基因型的划分方法以及国内外不同时期新城疫的流行状况及其特点,分析了国内外流行毒株及流行趋势,目前在国内外三大家禽中主要流行基因Ⅶd亚型毒株,鸽群中主要流行基因Ⅵb亚型毒株,为我国新城疫的防控提供理论基础。此外,弱毒株在新城疫的传播中所起的作用也值得关注。     

2005年中国新城疫病毒分子流行病学研究

采用2005年从国内不同地区、不同宿主分离到的NDV分离株，选取其中具有代表性的83株，用RT-PCR技术扩增其F基因重要的功能区片段，进一步进行序列测定。序列分析表明所扩增的目的片段长度为535bp，序列测定结果已经登陆到GenBank，登陆号为DQ439866-DQ439948。参照国内外已发表的部分毒株的F基因序列，构建了NDV的遗传进化树，分析毒株间的遗传进化关系。通过遗传进化分析表明83株NDV分离株中有65株属于基因Ⅶ型，9株属于基因Ⅱ型，5株属于基因Ⅰ型，3株属于基因Ⅵ型，1株属于基因Ⅲ型。表明我国目前ND的流行情况比较复杂，其中基因Ⅶ型新城疫病毒所引起的新城疫在国内呈流行趋势，同时也存在其它基因型的散发，从而为我国目前新城疫的防治提供了科学的参考依据。     

Class Ⅰ新城疫病毒核衣壳蛋白在体外细胞感染过程中表达定位的检测

为分析核衣壳蛋白(NP)在新城疫病毒(NOV)感染真核细胞过程中细胞内定位的情况,本研究以NDV Class I强毒株9a5b作为免疫原制备4株NP特异性单克隆抗体(MAb),并将病毒株9a5b按5 MOI感染量接种DF1单层细胞,当接种后1 h～3 h时,NP有极少量表达并逐量增加,主要呈点状分布于细胞浆内;当接种后4 h～20 h时,NP聚集于细胞浆中,聚集数量与感染时间成正比;感染24 h后,细胞核碎裂,NP散在分布于细胞浆中.表明NP作为立早期蛋白,始终在胞浆中进行复制;在病毒感染初期,NP介导核糖核蛋白复合物发挥转录和翻译功能.本研究为深入开展NP与病毒mRNA转录、复制和包装的相互关系机制的研究奠定了基础.     

一株Class Ⅰ新城疫病毒中国分离株分子特性的研究

对从健康家鸭中分离到的一株Class I新城疫病毒分离株Duck/China/08-004/2008进行了遗传进化特性研究。利用RT-PCR扩增了该分离株F基因的主要功能区片段,并进行了克隆与序列分析。序列测定结果已经登录到GenBank,登录号为EU589149。该分离株F蛋白裂解位点的组成为112E-Q-Q-E-R-L117,具有典型新城疫弱毒株的分子特征。同源性分析表明其与国内普遍使用的弱毒疫苗株LaSota和V4核苷酸的同源性较低(分别为55.4%和57.7%)。通过构建F基因的遗传进化树,结果表明该分离株在分类地位上属于ClassI,与我国目前普遍使用的弱毒疫苗株LaSota(Class II中的基因II型)和V4(Class II中的基因I型)处在不同的进化分支。通过构建57株ClassI新城疫病毒的遗传进化树,表明本分离株与近年来香港活禽市场分离株较为类似,同属于基因3型。     

2004年黑龙江省新城疫病毒分子流行病学分析

2004年从黑龙江省部分鸡场疑似新城疫(ND)病死鸡和鸽体内分离到9株NDV。对这9株NDV生物学特性进行测定,并对其F基因包括裂解位点在内的540bp片段进行了克隆、测序和同源性分析。结果表明,9株NDV鸡胚平均死亡时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)分别在47.8h～78.4h和1.51～2.00之间;8个分离株在F蛋白裂解位点氨基酸顺序为112RRQKRF117,1个分离株F蛋白裂解位点氨基酸顺序为112RRQRRF117,表明了它们全为ND中、强毒株。同源性分析显示,9株NDV分离株之间核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为79.7%～99.7%和79.8%～100%;系统发生树分析表明,6株分离株与台湾株(TW98、TW99和TW2000等)遗传距离较近,可能有共同的起源,为基因Ⅶe型NDV,2株为鸽源NDV基因Ⅵ型,1株与我国特有的F48E9遗传距离最近,为基因Ⅸ型NDV。     

新城疫病毒Class Ⅰ与Class Ⅱ毒株交叉血凝抑制试验速分类

Class Ⅰ新城疫病毒(NDV)分离自健康家禽泄殖腔棉拭子,其基因序列与class Ⅱ NDV存在很大差异,为了建立简单快速的NDV分类方法,用SPF鸡制备Class Ⅰ和Class Ⅱ毒株多价抗血清分别与选取的Class Ⅰ和Class Ⅱ代表毒株进行交叉血凝抑制反应.结果表明所有Class Ⅰ毒株比同Class Ⅱ毒株的交叉血凝抑制值高8-64(3-61og2)倍;而Class Ⅱ毒株与Class Ⅱ抗血清的HI效价比同Class Ⅰ毒株的交叉血凝抑制值高2-8(1-31og2)倍,结果与基因分型高度一致,说明可以用交又血凝抑制试验进行初步分类.本研究结果显示,NDV Class Ⅰ弱毒株血凝性与广泛应用的NDV弱毒疫苗株不同,基因序列分析可以部分解释这种差异,另外可能HN蛋白的空间结构也会影响其与血凝素结合的特性.     

新城疫病毒分子生物学研究进展

新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一种急性、高度接触性禽类传染病,被世界动物卫生组织(OIE)定为法定必报传染病,我国也将其列为一类动物疫病,本文从新城疫病毒的形态及分子结构、致病力的分子基础、分子流行病学特征和基因工程疫苗等分子生物学相关研究进展进行了综述。     

新城疫病毒ClassⅠ与ClassⅡ毒株交叉血凝抑制试验快速分类

ClassⅠ新城疫病毒(NDV)分离自健康家禽泄殖腔棉拭子,其基因序列与ClassⅡNDV存在很大差异,为了建立简单快速的NDV分类方法,用SPF鸡制备ClassⅠ和ClassⅡ毒株多价抗血清分别与选取的ClassⅠ和ClassⅡ代表毒株进行交叉血凝抑制反应。结果表明所有ClassⅠ毒株比同ClassⅡ毒株的交叉血凝抑制值高8～64(3～6log2)倍;而ClassⅡ毒株与ClassⅡ抗血清的HI效价比同ClassⅠ毒株的交叉血凝抑制值高2～8(1～3log2)倍,结果与基因分型高度一致,说明可以用交叉血凝抑制试验进行初步分类。本研究结果显示,NDVClassⅠ弱毒株血凝性与广泛应用的NDV弱毒疫苗株不同,基因序列分析可以部分解释这种差异,另外可能HN蛋白的空间结构也会影响其与血凝素结合的特性。     

我国家禽新城疫病毒流行基因型分析

新城疫病毒(NDV)为RNA病毒,突变频率高,已进化出21种基因型.NDV强毒株引起的新城疫(ND)对我国养禽业造成巨大威胁.疫苗株与流行株基因型的不匹配导致疫苗效果不佳,影响了ND的防控.NDV可感染多种家禽,在不同宿主中流行的NDV基因型不同.目前,缺乏对我国家禽中NDV流行基因型的系统分析,影响了针对不同家禽ND...     

我国新城疫病毒分离株分子生物学特性和基因型的研究

利用一步法RT-PCR技术成功扩增了37个新城疫病毒分离株的(其中2株属于鸽源病毒)F基因片段(约500bp)，通过对分离株的测序和基因分型表明，24株属于基因Ⅶ型，1株属于基因Ⅵ型，2株属于基因Ⅲ型，1株属于基因Ⅰ型，6株属于基因Ⅱ型，另外有3株从氨基酸方面分析是基因Ⅶ和Ⅵ型的杂交体，但从进化树方面，分离毒SD054和SD069属于基因Ⅵ型，SD052属于基因Ⅶ型。可以看出，我国新城疫的流行是极其复杂的，既有老基因型的威胁，又有新基因型的不断流行，同时发现有3株病毒发生了两基因型间的杂交现象。     

一株Class Ⅰ新城疫病毒分离株NP和P蛋白基因分子特征和遗传进化分析

本研究对2009年实验室保存的一株Class Ⅰ新城疫病毒分离株NDV09-056的NP和P基因进行了扩增和序列分析,对其分子特征和遗传进化关系进行了分析。结果表明该分离株NP蛋白基因全长为1746nt,共编码489aa,其N端1～401氨基酸相对比较保守,C端402～479氨基酸变化比较大;同源性分析表明本分离株的NP蛋白基因与Ⅰ类新城疫病毒代表毒株之间核苷酸的同源性为93.5%～98.5%,而与Ⅱ类新城疫病毒代表毒株的同源性较低,介于77.0%～79.2%。P蛋白主要氨基酸突变区集中在57～107aa和135～212aa两个区域,而N端和C端相对保守;同源性分析表明本分离株的P蛋白基因与Ⅰ类新城疫病毒代表毒株之间核苷酸的同源性为90.4%～95.3%,而与Ⅱ类新城疫病毒代表毒株的同源性较低,介于68.3%～72.5%。遗传进化分析表明本分离株与Ⅰ类基因3型新城疫病毒代表株NDV08-004的亲缘关系最近。     

两株ClassⅠ新城疫病毒的分离鉴定及遗传进化分析

采集送检实验室的鸡和鸭的咽拭子及泄殖腔拭子,处理后进行新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的RT-PCR检测以及病毒分离鉴定,对获得的分离株进行F基因高变区测序分析并构建遗传进化树.结果显示,采集的样本经RT-PCR扩增得到NDV特异性目的条带,接种鸡胚获得的病毒分离株具有血凝活性,两株...     

新城疫病毒ClassⅠ强毒株磷蛋白在细胞中的表达与定位

根据Class Ⅰ新城疫病毒分离株9a5b编码序列设计特异性引物扩增P蛋白基因,原核表达后利用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,经二次亚克隆后筛选到4株针对P蛋白的单克隆抗体,利用所得单抗进行P蛋白在细胞内定位分析,NDV 9a5b株按5 M.O.I感染量接种DF1单层细胞,当PI=4 h时,P蛋白呈点状弥散分布于细胞浆内;PI=6~8 h时,P蛋白聚集于细胞核周围;PI=12 h时,P蛋白呈单极化聚集于细胞核一侧;而PI=16 h后开始形成合胞体,P蛋白在单个细胞中仍呈现单极分布;当PI=48 h时,细胞核已发生碎裂,荧光强度有所减弱。本研究为深入开展P蛋白在病毒增殖以及细胞周期中的作用机制研究奠定了基础。     

新城疫病毒载体研究进展

随着反向遗传学操作技术的发展,重组新城疫病毒载体成为当今病毒载体系统研究的热点之一.论文在综述了新城疫病毒的安全性评价、分子生物学特性的基础上,着重介绍了以新城疫病毒作为病毒载体表达外源基因应用于基础研究、疫苗研究和作为基因治疗载体等研究概况.     

中国西北地区新城疫病毒分离株基因型与抗原性的关系

从我国西北地区分离到10株新城疫病毒（NDV），在蚀斑纯化、致病力和基因型鉴定的基础上，以LaSota,F48E9株免疫血清与分离毒株进行中和试验和交叉血凝抑制试验（HI）。结果表明，弱毒株LaSota的免疫血清对分离毒株具有一定的保护力，但随毒株的不同有很大差异，对分离毒的中和指数远远低于强毒株F48E9免疫血清的中和指数。结合基因鉴定结果，认为这种差别很可能是造成LaSota系疫苗免疫失败的原因之一。     

Ⅰ类新城疫病毒分离株NDV08-046的基因组特性

对1株Ⅰ类新城疫病毒分离株NDV08-046进行了全基因组序列测定和遗传进化分析.结果表明,该分离株基因组长度为15 198 nt,符合"六碱基原则".与Ⅱ类新城疫病毒的基因组序列相比,该分离株在基因组P基因的2 381～2 382 nt的位置(根据La Sota株的基因组序列,包含15 186 nt)有12 nt的插入(TGGGAGACGGGG).NDV08-046株F蛋白裂解位点的序列为112-ERQERL-117,具有典型的新城疫弱毒株特征.全基因组的遗传进化分析显示,所有的新城疫毒株能够被分为2个明显不同的分支,即Ⅰ类和Ⅱ类,NDV08-046分离株在分类地位上属于Ⅰ类新城疫病毒基因2型.