检测非洲猪瘟病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法的建立

利用非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白不同抗原表位的2株单克隆抗体,1株作为捕获抗体,另1株用辣根过氧化物酶(HRP)标记后作为检测抗体,采用方阵法对ELISA反应条件进行优化,建立了检测ASFV抗原的双抗体夹心ELISA方法。结果显示,该方法中捕获抗体包被质量浓度为1.25 mg/L,酶标单克隆抗体的最适稀释度为1∶4 000。通过试验确定该方法的临界值为0.299,当样品D₄₅₀值≥0.3,且P/N大于2时,判定为阳性。该双单抗夹心ELISA方法可特异性检测ASFV抗原,其他抗原检测结果均为阴性,特异性强;重复性好,批内和批间变异系数(CV)均小于8%。应用本研究建立的方法与荧光PCR方法同时对225份临床样品进行检测,总符合率为96.89%。结果表明,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法可用于ASFV抗原的大量样品检测,为ASF防控提供了技术支持。     

鸡白细胞介素18双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

应用识别不同表位的鸡白细胞介素18成熟蛋白（Mature chicken interleukin-18,mChIL-18）的2株单克隆抗体（mAb）1G9和2E6,建立检测mChlL-18的双抗体夹心ELISA,并利用此方法对禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）人工感染SPF鸡体内mChIL-18的分泌水平进行检测。结果显示,捕获抗体的最佳质量浓度为8mg／L,检测抗体的工作效价为1：800,待检样品的最佳稀释度为1：400,检测敏感度可达31．5ng／L,与其他细胞因子等抗原蛋白无交叉反应;跟对照组相比,REV感染鸡体内mChIL-18的表达量在7、14、21、28、35、42、49d均呈现升高,但只有14日龄时表现差异显著（P〈0．05）。结果表明,本试验成功建立了ChIL-18的双抗体夹心ELISA,为鸡传染病的细胞免疫学研究提供了可靠方法。     

鸡白细胞介素18双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

应用识别不同表位的鸡白细胞介素18成熟蛋白(Mature chicken interleukin-18,mChIL-18)的2株单克隆抗体(mAb)1G9和2E6,建立检测mChIL-18的双抗体夹心ELISA,并利用此方法对禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)人工感染SPF鸡体内mChIL-18的分泌水平进行检测。结果显示,捕获抗体的最佳质量浓度为8mg/L,检测抗体的工作效价为1∶800,待检样品的最佳稀释度为1∶400,检测敏感度可达31.5ng/L,与其他细胞因子等抗原蛋白无交叉反应;跟对照组相比,REV感染鸡体内mChIL-18的表达量在7、14、21、28、35、42、49d均呈现升高,但只有14日龄时表现差异显著(P<0.05)。结果表明,本试验成功建立了ChIL-18的双抗体夹心ELISA,为鸡传染病的细胞免疫学研究提供了可靠方法。     

马流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种快速、有效的检测马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的方法,以EIV中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)制备的多克隆抗体为捕获抗体,原核表达的核蛋白(NP)制备的单克隆抗体为检测抗体,在国内首次建立了检测EIV的双抗体夹心ELISA方法.用该检测方法分别检测EIV、马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型和马乙型脑炎病毒阳性样品.结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性;与常规检测EIV的血凝试验相比,其敏感性是后者的2.5～10倍;同时与H7N7亚型EIV有交叉反应.攻毒试验结果表明该方法可有效检测鼻腔分泌物中的EIV.该方法的建立为EIV的检测及早期防控提供了有效工具.     

猪流行性腹泻病毒病S蛋白单抗制备及夹心ELISA检测PEDV方法的建立与应用

应用PCR扩增出PEDV毒株的纤突糖蛋白S基因序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建出pGEX-4T-1-S表达载体。应用IPTG诱导表达重组S蛋白,并将重组蛋白以弗氏完全/不完全佐剂乳化后免疫小鼠,制备抗PEDV S蛋白的单克隆抗体,并以此建立了检测PEDV抗原的双抗体夹心ELISA方法,确定、优化了所建立的ELISA反应条件。以建立的双抗体夹心ELISA和RT-PCR方法对PEDV样品进行了比较检测,两者的符合率为100%。应用ELISA检测了吉林省疑似PED流行猪场的粪便样品,发现PEDV阳性检出率为68%。该研究为PED诊断及流行病学调查提供了一种特异、敏感、快速和易于在基层应用的技术方法及本病的防治提供了流行病学理论依据。     

产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

为了对产气荚膜梭菌α毒素进行快速、有效的检测,本研究以单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)为基础,建立了双抗体夹心ELISA(double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)方法。纯化原核表达的α毒素蛋白为免疫原,制备腹水型mAb并分离纯化作为检测抗体,免疫新西兰大白兔制备抗α毒素多克隆抗体纯化后作为捕获抗体,通过试验优化反应条件,建立标准曲线;并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价及初步应用。DAS-ELISA方法对α毒素的有效检测范围为5.86³75μg/L,最低检测线为4.57μg/L,比多抗-多抗双夹心ELISA具有更高的特异性和敏感性。初步应用结果显示,相同培养条件下,A375μg/L,最低检测线为4.57μg/L,比多抗-多抗双夹心ELISA具有更高的特异性和敏感性。初步应用结果显示,相同培养条件下,A^E型产气荚膜梭菌标准菌株的培养上清中,α毒素含量差异较大,A型菌(NCTC528)中α毒素含量显著高于其他菌型。本研究成功制备了高特异性的mAb,并建立了特异、灵敏、稳定的DAS-ELISA方法,为高效检测α毒素提供了有效工具。     

鸭新城疫病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的初步建立

为了对目前流行的鸭新城疫进行快速诊断,应用蔗糖密度梯度离心纯化后的鸭新城疫病毒免疫6周龄雌性Balb/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次亚克隆后获得一株能稳定分泌鸭新城疫病毒特异性单克隆抗体的细胞株2C1.以PEG纯化后的2C1腹水为捕获抗体,辛酸-硫酸铵纯化的兔抗鸭新城疫病毒多克隆抗体为第二抗体,HRP标记的羊抗兔抗体作为酶标抗体,建立了检测鸭新城疫病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法.结果表明,当2C1包被量为4μg/孔,鸭新城疫病毒1:10稀释,兔抗鸭新城疫病毒多抗作用量为0.1 μg/孔,HRP标记的羊抗兔二抗1:10 000倍稀释,每次作用时间为1h时,P/N比值最高,且阳性OD值最接近1.0.试验表明,该方法特异性好,不与IBV、ARV、GPV、DPV、DHV尿囊液及H5、H9标准阳性抗原发生反应;可以检测出0.2 μg纯化病毒,比传统的HA试验的敏感性至少高64倍;批间和批内变异系数均小于10％.本研究建立的双抗体夹心ELISA方法为鸭新城疫病毒的快速诊断奠定了基础.     

抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双抗夹心ELISA检测方法,本研究将BVDV 890病毒株(BVDV-2)浓缩并纯化后免疫BALB/c小鼠,经常规技术进行细胞融合并筛选得到一株稳定分泌IgG的杂交瘤细胞株,命名为3F9。以BVDV单克隆抗体(MAb)IgM为捕获抗体,生物素标记的3F9为检测抗体,初步建立BVDV特异的双抗体夹心ELISA检测方法(BAS-ELISA)。采用建立的BAS-ELISA方法检测35份临床病牛血清样品,检出阳性样本13份;与RT-PCR的符合率达到94.29%;表明本研究所建立的BAS-ELISA方法可用于BVDV感染的临床诊断,为BVDV的免疫学研究奠定了基础。     

检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法建立及初步应用

以鹅源坦布苏病毒JS804毒株制备的多克隆抗体为捕获抗体,抗鹅坦布苏病毒NS1蛋白的单克隆抗体4A9作为检测抗体,建立了检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法。该方法的最佳反应条件为:兔抗鹅坦布苏病毒多克隆抗体的最适稀释度为1∶1 600,单克隆抗体的最适稀释度为1∶160,样品反应时间为1 h,酶标羊抗鼠二抗工作浓度为1∶5 000,以OD450nm≥0.245作为阳性判定标准。该方法的板间、板内重复性变异系数小于10%,病毒最低检测量为386.25TCID50/0.1 mL,与新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸭肝炎病毒(DHV)和鹅细小病毒(GPV)无交叉反应。应用该方法与RT-PCR方法同时检测22份临床样品,符合率达到86.36%。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于坦布苏病毒的快速检测。     

牛乳铁蛋白单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

本试验以牛乳铁蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得了3株稳定分泌乳铁蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3C6、3F8和4D3,最后用相对亲和力最强的3C6所产生的抗体作为包被抗体,用辣根过氧化物酶标记过的多克隆抗体作为酶标抗体,最终建立了用于检测牛乳汁中乳铁蛋白含量的双抗夹心ELISA检测方法,该法对牛乳铁蛋白最低检测限为4 ng/m L,最适检测范围为4²56 ng/m L。     

水泡性口炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立方便快捷的水泡性口炎病毒(VSV)检测方法,本研究以抗VSV单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,兔抗VSV多克隆抗体为检测抗体,建立VSV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳工作条件为:抗VSV MAb 1A2的包被浓度为3.09μg/mL,兔抗VSV多克隆抗体和酶标抗体的工作浓度分别为5.16μg/mL和1∶5 000,以OD450nm≥0.231作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪水泡病病毒、猪水疱疹病毒及羊传染性脓疱病毒等均无交叉反应;敏感度可达3.125μg/mL(101TCID50);其重复性变异系数小于10%。采用建立的ELISA方法与RT-PCR方法同时检测187份临床样品,符合率达到97.9%,具有良好的相关性。本实验建立的VSV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高、成本低及方便快捷等优点,可以用于VSV的快速检测。     

快速,特异检测李斯特菌单抗—夹心ELISA方法的建立及应用

本研究以高度特异的,针对单核细胞增生李斯特氏菌,无害李斯特氏菌,格氏李斯特氏菌共同表位的单抗ＬＪ１０Ａ为捕捉抗原抗体和酶标抗体,建立了快速检测该菌的单抗夹心法ＥＬＩＳＡ方法,该方法对单核细胞增生李斯特菌的最小检出量为５×１０＾５个菌／ｍｌ,人工模拟样品至少可检出５个菌／１０ｇ样品,并在４８小时内报告结果,在实际应用中,我们以该法检测了２４０份肉样和８５０份奶样,并平行以改良ＭｃＢｒｉｄｅ琼脂分离国     

禽白血病病毒衣壳蛋白单克隆抗体研制及其双夹心ELISA的建立

为制备禽白血病病毒(ALV)核衣壳蛋白p27的单克隆抗体,本研究以原核表达的融合蛋白GST-ALV p27免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过间接免疫荧光(IFA)和间接ELISA进行筛选,制备了5株能够稳定传代并分泌抗p27单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为5D3、4F12、5B10、1C5和3C6,亚类鉴定3C6为IgG2b,其余为IgG1.通过IFA、Western-blot及竞争抑制ELISA,表明该5株单抗与J亚群禽白血病病毒(ALV-J)呈阳性反应,而与其他常见禽源病毒无交叉反应.利用5D3和4F12单抗建立了双抗体夹心ELISA方法,经663份临床样本验证,该方法与商品化试剂盒的符合率达到95.17％,证明所研制的针对ALV p27蛋白的单抗及建立的双抗体ELISA方法具有较高的应用价值.     

伪狂犬病病毒gB蛋白单抗的制备及其夹心ELISA检测方法的建立

应用PCR技术扩增出伪狂犬病病毒(PRV)gB基因,并将克隆的目的片段连接到表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-B。以表达纯化的gB重组蛋白为抗原,制备单克隆抗体和兔源多克隆抗体,并以制备的抗体建立检测PRV抗原的双抗体夹心ELISA方法,同时对吉林省某地区猪群感染PRV的情况进行流行病学调查。结果显示,试验成功制备PRV gB蛋白单抗并建立其夹心ELISA检测方法。流行病学调查发现,PRV在吉林省某地区猪群的平均感染率为9.3%,且妊娠母猪阳性率高达11.7%,该结果为伪狂犬病的防治提供了理论依据。结果表明,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异、敏感、简便与快速等优点,可用于PRV抗原的快速检测,为今后该病的诊断和流行病学调查研究提供技术手段。     

SIVp27抗原双抗体夹心ELISA检测方法的研究

目的建立检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法并进行初步应用。方法使用ProteinA亲和层析柱纯化腹水中的SIVp27单抗,用过碘酸钠法对单抗进行辣根过氧化物酶标记。经抗体配对实验确定包被抗体和检测抗体,再用棋盘滴定法确定抗体工作浓度后,探索构建检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA法。应用建立的双抗体夹心ELISA法,对SIV模型猴血浆标本和SHIV模型猴病毒分离培养上清标本进行了检测,并将其结果与Coulter公司试剂盒检测结果进行比较。结果以稀释至20ug/mL的2E12为包被抗体、1:400稀释的酶标3G3为检测抗体为ELISA最优体系。模型猴血浆标本和病毒分离培养上清标本的检测结果表明自建体系可以用于SIVp27抗原的检测,特异性良好,灵敏度略低于Coulter公司试剂盒。结论检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法初步建成,为研制有独立知识产权的检测试剂奠定了一定的基础。     

检测F种肠道病毒双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

依据F种肠道病毒(enterovirus species F,EV-F) SD-S67毒株的基因组序列设计合成引物,RT-PCR扩增出该毒株的VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1的BamHⅠ/EcoRⅠ位点,表达出VP1重组蛋白。以纯化VP1重组蛋白为免疫原,制备兔源多克隆抗体,并以制备的抗体建立了检测F种肠道病毒的双抗体夹心ELISA方法,同时对山东和河南省部分地区牛群感染EV-F进行了初步的流行病学调查。结果显示,捕获抗体的最佳包被量为400 ng/孔,HRP酶标抗体的最佳稀释倍数为1∶400;确定的方法判断标准为样品的D₄₉₀>0.217时判定为阳性。建立的ELISA方法可以特异性检测出EV-F病毒抗原,而EV-E和BVDV病毒抗原检测结果均为阴性,表明方法具有较好的特异性。以建立的ELISA方法检测不同稀释倍数的阳性样品,结果稀释1 000倍后的样品检测结果仍为阳性,表明建立的方法具有较高的敏感性。应用建立的方法检测部分样品,组内变异系数为1.05%～9.24%,组间变异系数为1.39%～6.78%,说明该方法具有良好的重复性。同时...     

抗旋毛虫循环抗原单克隆抗体的制备及初步应用

为评价单克隆抗体用于检测旋毛虫循环抗原（ＣＡ）的应用价值，作者利用淋巴细胞杂交瘤技术制备了４个抗旋毛虫ＣＡ的杂交瘤细胞系，建立了以单克隆抗体双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测ＣＡ的方法，并初步应用于动物血清中ＣＡ的检测。应用该法检测旋毛虫病猪血清的阳性率为７２．１％（３１／４３）。６０头健康猪、３０头感染猪囊虫和３０头感染弓形虫的猪均为阴性。对流行地区河南邓县３４头和湖北囊樊１３４头屠宰猪进行流行病学调查，     

鹅细小病毒单抗双夹心ELISA检测方法的建立

为建立鹅细小病毒(GPV)检测方法,本研究以兔抗GPV IgG为捕获抗体,抗GPV单克隆抗体为检测抗体,通过方阵试验确定了兔抗GPV IgG最适包被浓度为16 mg/L,抗GPV单克隆抗体最佳工作浓度为10.8 mg/L,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4 000,建立了检测GPV单抗双夹心ELISA方法,对GPV检测灵敏度达0.312 mg/L.用该法对延边某养鹅场疑似发生小鹅瘟病的252只病死鹅进行检测,结果阳性率为75.79%,与病毒中和试验方法的检测结果符合率迭91.11%.本研究建立的单抗双夹心ELISA方法为GPV的检测和区城流行病学调查提供了一种简便快速的血清学诊断方法.     

检测伪狂犬病病毒双抗体夹心间接ELISA方法的建立与应用

以猪伪狂犬病病毒（PrV）Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体，纯化的抗PrV IgG为检测抗体，建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为，单克隆抗体576株的包被浓度为12．2μg／mL，IgG的工作浓度为16．0μg／mL，对PrV的检测灵敏度达15．6ng（0．156μg／mL），与乙型脑炎病毒（JEV）、猪瘟病毒（HCV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）和猪流感病毒（SIV）等无交叉反应。批间和批内变异系数较小，分别为6．39％和4．1％。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测，肺和脑PrV抗原检出率最高，其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PrV对159份临床样本进行平行检测，发现二者的符合率可达到77．4％，比PCR敏感。实验结果表明：双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点，可广泛应用于动物组织中PrV的检测。     

非洲猪瘟病毒p72重组蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为了建立一种快速检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法,试验利用GenBank中ASFV的p72基因(登录号为MK128995.1)序列构建原核重组表达质粒pGEX-6P-1-p72和真核重组表达质粒pCAGGS-myc-p72,通过大肠杆菌原核表达系统获得p72重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠,获得阳性杂交瘤细胞,通过Western-blot和间接免疫荧光鉴定筛选单克隆细胞株,并用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定各单克隆抗体的亚型。通过对p72兔源多克隆抗体包被浓度及纯化的3株单克隆抗体稀释度进行优化,初步建立检测ASFV的双抗体夹心ELISA方法,并用该方法测试纯化的3株单克隆抗体分别与p72兔源多克隆抗体两两组合后所能检测的p72重组蛋白的灵敏度。结果表明：p72重组蛋白大小为99 ku;以纯化的原核表达的p72重组蛋白作为抗原免疫3只小鼠,抗体效价均大于1∶10 000;经细胞融合、克隆和筛选共获得5株阳性杂交瘤细胞,将其分泌的单克隆抗体分别命名为2C4C8、2C4B8、5C11F11、5C11D12、7D10C9,5株单克隆抗体与真核...