同时检测豇豆花叶病毒属与蚕豆病毒属病毒的通用RT-PCR检测方法

【目的】建立一个可同时检测豇豆花叶病毒属（Comovirus）和蚕豆病毒属（Fabavirus）病毒的通用RT-PCR检测方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析,在其保守区域设计简并引物,用于这2个病毒属病毒的通用RT-PCR检测,并进行灵敏性、特异性试验。为便于PCR产物直接测序,在简并引物中引入通用测序引物（RV-M和M13-47）,并通过序列分析对病毒种类鉴定。利用该方法对来自福建柘荣的太子参病毒进行检测验证。【结果】设计一对简并引物,建立了一个用于扩增豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒部分依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）基因的通用RT-PCR方法。该方法成功用于检测安第斯马铃薯斑驳病毒（ApMoV）、蚕豆染色病毒（BBSV）、蚕豆真花叶病毒（BBTMV）、菜豆荚斑驳病毒（BPMV）、豇豆花叶病毒（CPMV）、豇豆重花叶病毒（CPSMV）、南瓜花叶病毒（SqMV）、红三叶草斑驳病毒（RCMV）和萝卜花叶病毒（RaMV）9种豇豆花叶病毒属病毒;蚕豆萎蔫病毒1号（BBWV1）、蚕豆萎蔫病毒2号（BBWV2）2种蚕豆病毒属病毒共计17个分离物,而不能与同亚科的线虫传多面体病毒属病毒及健康寄主植物反应,显示出良好的广谱性和特异性。在简并引物的5′端分别加入一段非互补的通用测序引物序列（RV-M和M13-47）,不仅可以利用该通用测序引物进行PCR产物直接测序,而且检测灵敏度可以提高10-100倍。序列及系统发育分析表明,所扩增的序列可以把豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒区分到种的水平。利用该方法测定了BBSV的部分RdRp基因序列,显示出与RCMV具有最近的亲缘关系。利用该方法在太子参中检出BBWV2。【结论】建立的通用RT-PCR方法可用于豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒的广谱性检测,结合序列可进行病毒种类的快速鉴定,并且可能用于新病毒种类的检测鉴定。     

IBV肾型毒株与呼吸型疫苗株鉴别方法的建立与应用

[目的]建立基于鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的反转录-复合PCR方法,为IBV流行毒株和呼吸型疫苗株的分型鉴定提供技术支持.[方法]根据IBV N基因序列设计合成1对特异性通用引物,建立IBV的分子生物学检测方法,用以对IBV进行检测.通过对GenBank上公布的IBV S1基因全序列的分析比对,找出呼吸型疫...     

植物病毒检测技术研究进展

综述了植物病毒鉴定与检测技术的研究进展,介绍了生物学、电子显微镜观察、免疫学、分子生物学技术（PCR、NASH、FISH、ds-RNA、芯片检测等）方面的植物病毒检测方法的特点、发展应用方向等。     

番茄斑萎病毒属病毒检测技术研究进展*

 番茄斑萎病毒属病毒属于布尼亚病毒科,是一类世界性分布、寄主范围很广的植物病毒,可引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害,造成严重的经济损失。而高效的病毒鉴定或检测技术是防治病毒病害的关键基础之一。因此,本文就近年来番茄斑萎病毒属病毒鉴定与检测技术的研究进展作一综述,介绍生物学技术、电镜技术、血清学技术以及分子生物学技术在番茄斑萎病毒属病毒检测方法上的特点、发展应用方向等。     

房山区4种动物源性成分PCR检测试验

本研究利用牛、羊、猪、鸡线粒体mtDNA中保守序列16s rRNA,设计一对动物的通用引物,检测了含有动物源性成分的样品,同时设计了针对牛、羊、猪、鸡mtDNA中的保守序列,选择4对特异性引物,扩增得到目的片段大小分别为271 bp、274 bp、212 bp和266 bp。利用通用引物,优化了PCR反应体系及其反应条件,建立了从未知样品中快速获取动物源性成分检测的PCR方法;利用牛、羊、猪、鸡特异性引物,建立了PCR方法快速鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法。     

番茄斑萎病毒属病毒检测技术研究进展

番茄斑萎病毒属病毒属于布尼亚病毒科,是一类世界性分布、寄主范围很广的植物病毒,可引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害,造成严重的经济损失.而高效的病毒鉴定或检测技术是防治病毒病害的关键基础之一.因此,本文就近年来番茄斑萎病毒属病毒鉴定与检测技术的研究进展作一综述,介绍生物学技术、电镜技术、血清学技术以及分子生物学技术在番茄斑萎病毒属病毒检测方法上的特点、发展应用方向等.     

鸭黄病毒巢式PCR检测方法的建立和应用

参照GeneBank已登录的黄病毒基因序列设计通用引物,建立基于黄病毒通用引物的巢式PCR检测体系,为黄病毒特别是新发黄病毒提供了高效的检测方法。该方法通过基因组的比对,选择NS5基因保守区设计了4条通用简并引物Flav P1～Flav P4,在此基础上建立了巢式PCR反应体系,并应用到鸭黄病毒的检测中。该体系仅能扩增鸭黄病毒目的基因而不能扩增其他病毒,且敏感性达到90copies.μL-1,比普通PCR高出1 000倍。同源性和进化分析表明,鸭黄病毒属蚊媒黄病毒类恩塔亚病毒群,与坦布苏病毒及近期发现的BYD病毒关系最近。以上结果表明,设计的黄病毒引物具有良好的通用性和特异性,其巢式PCR敏感性高,该体系成功地进行了鸭黄病毒的检测,验证了该方法的敏感性和特异性。     

1种苎麻根腐病线虫的鉴定

【目的】对分离的一种苎麻根腐病线虫进行形态和分子生物学鉴定,为病原线虫分子生物学检测技术的研发及苎麻根腐病的防治奠定基础。【方法】从感染苎麻根腐病植株根中分离出一种植物病原线虫,利用显微技术观察线虫的形态特征,对其进行初步鉴定;之后采用分子生物学技术,提取单条线虫的DNA,利用通用保守性引物扩增了线虫核糖体DNA内部转录间隔区(rDNA-ITS)序列,并用软件DNAstar和DNAMAN进行序列分析,对该植物病原线虫进行进一步鉴定。【结果】根据形态特征,将获得的苎麻根腐病线虫初步鉴定为咖啡短体线虫。序列分析结果表明,该线虫rDNA-ITS序列与咖啡短体线虫湖北种群、越南种群、台湾种群、日本种群及尼日利亚种群的同源性依次为99.8%,99.0%,98.0%,97.8%和94.6%。该线虫rDNA-ITS序列在GenBank注册号为HQ403649。【结论】形态及分子生物学鉴定结果表明,分离的苎麻根腐病线虫为咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)。     

1种苎麻根腐病线虫的鉴定

【目的】对分离的一种苎麻根腐病线虫进行形态和分子生物学鉴定,为病原线虫分子生物学检测技术的研发及苎麻根腐病的防治奠定基础。【方法】 从感染苎麻根腐病植株根中分离出一种植物病原线虫,利用显微技术观察线虫的形态特征,对其进行初步鉴定;之后采用分子生物学技术,提取单条线虫的DNA,利用通用保守性引物扩增了线虫核糖体DNA内部转录间隔区（rDNA-ITS）序列,并用软件DNAstar和DNAMAN进行序列分析,对该植物病原线虫进行进一步鉴定。【结果】 根据形态特征,将获得的苎麻根腐病线虫初步鉴定为咖啡短体线虫。序列分析结果表明,该线虫rDNA-ITS序列与咖啡短体线虫湖北种群、越南种群、台湾种群、日本种群及尼日利亚种群的同源性依次为99.8%,99.0%,98.0%,97.8% 和94.6%。该线虫rDNA-ITS序列在GenBank注册号为HQ403649。【结论】 形态及分子生物学鉴定结果表明,分离的苎麻根腐病线虫为咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)。     

饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR检测方法及其应用

 【目的】建立鉴定饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR方法,进一步完善现有的动物源性饲料检测方法。【方法】根据牛、羊、猪、鸡、鱼以及马的mtDNA的16S rRNA基因序列选用了一对通用引物,初步检测出含有动物源性成分的样品;然后针对牛、羊、猪、鸡4种动物线粒体mtDNA中的保守序列,分别选用了4对特异性引物对检测出的样品进行PCR扩增,扩增的目的片段大小分别为271、274、149和266 bp。【结果】通过利用通用引物、优化PCR反应体系及其条件,建立了从未知样品中简便而快速的检测出是否含有动物源性成分的PCR方法;利用所选的针对不同动物的特异性引物,建立了鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法,此方法最低检测限可达0.1%。【结论】建立的检测饲料中动物源性成分的方法操作简便,价格低廉,结果准确,可靠,可作为饲料中动物源性成分的鉴定方法之一。     

云南鬼针草上发现鬼针草斑驳病毒

 【目的】鉴定侵染鬼针草引起花叶或斑驳的病原。【方法】利用电镜技术观测病原粒子;间接ELISA方法鉴定病原与马铃薯Y病毒属病毒的血清学关系;分子生物学技术克隆了病原3′-端序列;BLAST,Clustal_X,BioEdit和MEGA 4.0等生物信息学软件用于所得序列的序列分析。【结果】在电镜下可观察到长约650-700 nm×13 nm左右的线状病毒粒子和风轮状内含体;利用Potyvirus PathoScren试剂盒检测呈阳性;用马铃薯Y病毒科病毒简并引物可扩增获得一条约1 800 bp的片段;序列分析表明该序列与鬼针草斑驳病毒相应序列高度相似,外壳蛋白的氨基酸同源性及3′-UTR核苷酸同源性均达96%以上。【结论】侵染云南鬼针草引起花叶或斑驳症状的病原为鬼针草斑驳病毒,这是该病毒侵染中国鬼针草属植物的首次报道。     

家兔皮肤真菌通用引物PCR检测和培养鉴定的比较研究

本研究比较了家兔皮肤真菌通用引物PCR检测方法与培养鉴定方法的敏感性,探讨了通用引物PCR检测方法的特异性及其在皮肤真菌诊断中的意义.根据皮肤真菌特异性rDNA序列设计通用引物,对已知分离株及不同微生物进行特异性检测,应用该引物对40份兔患部病料进行PCR检测并克隆测序;同时,采用培养鉴定对40份病料进行表型分析.PCR检测结果显示,家兔四种常见病原性皮肤真菌可扩增出400 ～500 bp之间的条带,其它微生物和兔体细胞均为阴性,说明该方法具有特异性;33份临床病料检测为阳性,扩增条带均为460bp,经测序为须癣毛癣菌.培养法的阳性为26份,检测结果与前者一致.与传统的培养鉴定方法相比,本研究建立的通用引物PCR检测方法,操作简便、特异性高,可用于大规模的家兔皮肤真菌病检测和流行病学调查,并具有重要的公共卫生意义.     

植物RNA病毒检测技术研究进展

RNA植物病毒常用的检测方法有生物学检测法、电子显微镜技术、血清学方法和分子生物学方法等,对这些方法的应用及其特点的研究进展进行了相应的总结,以期能够更好地运用这些方法,进行植物RNA病毒的检测与研究。     

高通量测序技术在植物病毒分类中的应用

植物病毒寄生可引起植物病毒病,甚至对植物造成毁灭性伤害.高通量测序技术(high-throughput sequencing, HTS)提供了一种快速、低成本、深度测序的解决方案,在病毒鉴定、新病毒检测和病毒基因组多样性等研究中具有优势,促进了植物病毒分类的研究.本文概述了HTS技术检测病毒的进展、在植物病毒学领域应用案例和该方法检测病毒的优缺点,旨在说明HTS技术对病毒鉴定、新病毒发现和病毒分类的重要贡献,提出新病毒检测和鉴定是亟待解决的问题,为植物病毒病的预防提供参考.     

分子生物学技术在植物病毒检测上的应用

<正> 植物病毒的检测方法随着分子生物学的发展,也取得了很大进展,从传统的生物学检测法到血清学检测法,甚至到近期起步并正在进行广泛应用的分子生物学技术,充分体现了从植株水平到细胞水平及至分子水平的进化。而目前正流行的分子生物学检测方法、以它的快速、简便、灵敏度高和特异性强的优势,日益受到广大病毒学工作者的青睐。现介绍两种常用的分子生物学技术在植物病毒快速检测上的应用。     

PVYN与PVYO病毒RT-PCR快速检测体系研究

 马铃薯Y病毒（PVY）是侵染马铃薯的重要病毒之一，严重影响马铃薯的生产。本文通过对PVY病毒N株系（PVYN）与O株系（PVYO）的基因序列进行比较，在其外壳蛋白同源区设计一对通用引物，建立了PVY病毒的RT-PCR检测体系。另外在N株系与O株系同源区设计一条3′引物，选择N株系与O株系差异区设计两条5′端引物，建立了可鉴定PVYN与PVYO的复合RT-PCR体系。这个体系的建立，对于马铃薯脱毒苗的检测与PVY病毒的调查及病理研究都具有一定的应用价值。     

百合病毒检测技术研究进展

笔者对百合病毒的检测技术作了综合评述,主要有植株直接观测法、指示植物接种鉴定法、电镜技术、血清学检测和分子生物学检测技术等,综合应用各项技术使检测更加灵敏、可靠。目前,常用的检测以血清学技术的ELISA为主、分子生物学技术的RT PCR为主。基因芯片检测技术是近几年发展起来高效的检测手段并在植物病毒检测上有广泛的应用前景。     

布尼亚病毒科全基因组序列比对分析*

 布尼亚科病毒（Bunyaviridae）是一类医学和农业上的重要病毒。本文从NCBI数据库下载具有完整基因组序列的布尼亚科病毒的5个属20种病毒的序列,用生物学软件DNAman,DNAstar进行比对分析,发现布尼亚科病毒属中的植物病毒在核酸序列及蛋白结构上与动物病毒有很大差异：（1）只有植物病毒的M基因组能编码NSm运动蛋白;（2）植物病毒和动物病毒在核酸序列和蛋白质序列长度均有差异,表明该科病毒是进化速度较快的病毒;（3）植物病毒核酸序列的GC含量低于动物病毒;（4）通过SMART网络软件进行蛋白质拓扑结构分析发现植物病毒和动物病毒在糖蛋白G_nG_c的结构上存在显著差异;（5）植物病毒糖蛋白结构较为复杂,有较多的紊乱区域,除INSV外,其他病毒都具有N端信号肽。这将对以后分子生物学检测中引物的设计及病毒的鉴定等方面的研究起到积极的作用。     

A型流感病毒及其亚型H5、H7、H9分型RT-PCR检测方法初探

本研究验证了来自资料的A型流感M基因通用引物AIM、通用反转录引物AIU的可用性；参考并分析GENBANK中A型流感的H5、H7、H9亚型病毒序列自行设计H5、H7、H9亚型的分型引物，尝试用RT-PCR方法对A型流感病毒及其H5、H7、H9亚型病毒分型检测，进一步确定3种病毒亚型的诊断流程。     

PVY^N与PVY^0病毒RT-PCR快速检测体系研究

马铃薯Y病毒(PVY)是侵染马铃薯的重要病毒之一，严重影响马铃薯的生产。本文通过对PVY病毒N株系(PVY^N)与O株系(PVY^0)的基因序列进行比较，在其外壳蛋白同源区设计一对通用引物，建立了PVY病毒的RT-PCR检测体系。另外在N株系与O株系同源区设计一条3’引物，选择N株系与O株系差异区设计两条5’端引物，建立了可鉴定PVY^N与PVY^0的复合RT-PCR体系。这个体系的建立，对于马铃薯脱毒苗的检测与PVY病毒的调查及病理研究都具有一定的应用价值。