原料乳中金黄色葡萄球菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

为了建立原料乳中金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)在保守区域设计特异性引物,建立LAMP检测方法,并用于原料乳中金黄色葡萄球菌的快速检测。结果表明,针对金黄色葡萄球菌的基因组DNA,使用设计合成的4条引物和建立的LAMP方法能够有效检测金黄色葡萄球菌DNA,每25.0μl反应体系的灵敏度为110.0 fg,并且此方法针对金黄色葡萄球菌具有良好的特异性。针对原料乳中金黄色葡萄球菌的污染,建立的LAMP检测方法的检测限为67 CFU/ml。本研究结果为进一步将LAMP方法应用于食品中金黄色葡萄球菌的安全检测奠定了基础。     

山核桃干腐病菌环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测体系的建立

为了建立一种能够快速、准确、高效地检测山核桃干腐病菌的技术,本研究根据茶藨子葡萄座腔菌的β-tubulin基因序列设计外引物、内引物和环引物,并对扩增体系和条件进行了优化、并分析其特异性和灵敏度。结果使用羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,反应体系(Bst DNA聚合酶0.16U/μL,外引物F3和B3均为0.2μmol/L,内引物FIP和BIP均为1.6μmol/L,环引物LB为0.8μmol/L,Mg~(2+)为4 mmol/L,dNTP为1mmol/L,甜菜碱Betaine为0.6mmol/L)在等温(64℃)条件下反应1h能特异性检测山核桃干腐病菌:以山核桃干腐病菌DNA为模板的反应液呈阳性(变为蓝色),而其余的病菌均为阴性(仍为紫色),该技术的最低检测限为1pg/μL。     

反转录-环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测马铃薯病毒

为寻求低成本快速准确灵敏度高的马铃薯病毒检测方法,根据马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的外壳蛋白基因序列设计4条特异引物,建立LAMP检测技术。结果表明:LAMP检测方法灵敏度下限是10个拷贝的病毒量,该方法检测PVX、PVY和PLRV特异性好,灵敏度高,1h可完成检测,且检测成本低。     

虾肝肠胞虫环介导等温扩增法(LAMP)的建立

为建立一种快速检测虾肝肠胞虫(EHP)的环介导等温扩增法(LAMP),根据Gen Bank中登录的EHP-SSU基因序列设计6条特异性引物,成功建立了EHP-LAMP检测方法。该方法检出限为3.71个质粒拷贝/μL,并且与虾其他常见病毒病的病原(WSSV、IHHNV、CMNV)均无交叉反应。采用LAMP方法和常规PCR方法对30份具有典型EHP感染症状的对虾样品进行检测,结果显示:LAMP和PCR方法的阳性检出率均为100%。结果表明,建立的EHP-LAMP方法具有高灵敏度、高特异性、高准确度的优点,为对虾肝肠胞虫的快速早期诊断奠定基础。     

检测禽多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增(LAMP)方法的建立

以禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)C48-1为研究对象,利用LAMP方法对Pm进行快速检测.结果表明:LAMP方法在恒温65℃下,1 h内就可以检测到Pm;LAMP方法最低可检测100 pg.μL-1Pm基因组DNA.该方法不需要精密的温度循环装置,有恒温加热设备就可以满足检测条件,适合基层临床应用.     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测蜜蜂球囊菌

【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。【方法】根据蜜蜂球囊菌特异性序列ITS区,用在线引物设计软件PrimerExplorer V4.0设计并合成4条特异性引物A.apis-F3 (5′-ACATTGCGCCCTCTGGTA-3′)、A.apis-B3 (5′-TGGTTAGACCGGACAGTCG-3′)、A.apis-FIP (5′-TAAGACGGGACGATCGCCC AACCTGTCCGAGCGTCATTG-3′)和 A.apis-BIP (5′-GAAAGGCAGTGACGGCGTCGGGCCACTAGAGCGAAAGAC-3′),进行LAMP扩增试验,分别设置Mg²⁺终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L^-1, dNPTs终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^-1, 内引物FIB/BIF终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol?L^-1,甜菜碱终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L^-1,反应温度为58、60、63、65℃,反应时间分别为30、40、50、60 min,并利用实时浊度仪测定浊度值和扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来检测LAMP反应的结果,确定优化的LAMP检测体系。以东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）、蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）、蜜蜂残翅病毒（Deformed wing virus,DWV）、蜜蜂囊状幼虫病毒（Sacbrood virus,SBV）、黑蜂王台病毒（Black queen cell virus,BQCV）和以色列急性麻痹病毒（Israel acute paralysis virus,IAPV）基因组为模板进行特异性验证。并用PvuⅠ酶切验证产物,最终确定LAMP反应体系的准确性;进而通过将蜜蜂球囊菌基因组DNA进行10倍梯度稀释,分别获得DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、02231×10^-5、0.2231×10^-6、0.2231×10^-7、0.2231×10^-8 μg·μL^-1作为模板,比较LAMP和普通PCR检测灵敏度,并检测验证该技术在临床应用上的可行性。【结果】建立了一种特异检测蜜蜂球囊菌的方法,反应条件优化后的检测体系为4 mmol·L^-1 Mg²⁺、1.2 mmol·L^-1 dNTPs、1.6 mmol·L^-1 FIP/BIP、0.4 mol·L^-1甜菜碱,并在63℃反应60 min可完成检测。选用蜜蜂球囊菌、东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、蜜蜂残翅病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒、黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒的基因组作为LAMP反应模板进行特异性检测,结果显示仅有蜜蜂球囊菌有扩增曲线和梯状条带,建立的LAMP检测体系有很好的特异性。将蜜蜂球囊菌基因组DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、0.2231×10^-5 μg·μL^-1作为模板进行PCR反应后,检测结果为阳性,随DNA浓度降低,电泳检测不能观察到PCR的扩增产物。进行LAMP反应时,浊度曲线和电泳条带显示可检测DNA浓度为0.2231×10^-6 μg·μL^-1。LAMP每反应检出量比PCR高10倍,并且方法简单、节省时间。【结论】成功建立了准确、快速、低成本的LAMP检测蜜蜂球囊菌技术,为相关研究和应用提供了技术支持。     

环介导等温扩增技术LAMP在植物病毒检测中的研究进展

环介导等温扩增技术（LAMP）具备特异性好、灵敏度高、方便快捷的特点,目前已经广泛用于医学诊断、食品安全检测、植物病虫害检测等基因芯片领域。为植物病毒病的早期预防提供技术支撑,介绍了LAMP技术的原理、特性、在植物病毒检测中的应用以及该技术在植物病害检测中的发展前景。     

环介导等温扩增技术检测建兰花叶病毒

为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸抽提到LAMP检测快速检测方法。所建立的检测方法比RT-PCR更灵敏;且具有特异性,操作简单,不需要复杂的仪器,肉眼可直接观察检测结果。适合基层和现场检测。     

环介导等温扩增技术的应用及研究进展

环介导等温扩增（LAMP）技术自 2000 年被发明以来以其快速、灵敏、低耗等特点,引起众多研 究者的关注。该技术在人、动物、植物、环境等相关微生物的检测、监控等领域得到了广泛研究与应用,其检 测灵敏度普遍高于传统 PCR 。但是传统 LAMP 技术对于产物检测存在耗时、易造成污染等问题,以及在野外或 医疗点检测时存在判读不便的弊端。就 LAMP 技术与其他多种产物检测技术结合后的方法如目视 LAMP、实时 LAMP、微流控 LAMP、横向流 LAMP 及电化学 LAMP 进行了总结、举例及讨论。目视 LAMP 具有费用低、适合 多环境下使用的特点;实时 LAMP、微流控及电化学 LAMP法能够有效提高样品检测的准确度,且可减少检测时间; 横向流 LAMP 具有可操作性强、便于判读等特点。根据目前 LAMP 技术的研究进展及各技术优劣势的分析,预 测 LAMP 技术未来发展的方向和重点可能为研发手持便携式检测仪。     

牙鲆弹状病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

建立了牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,首先根据牙鲆弹状病毒的糖蛋白的基因保守序列,利用Primer Explorer V3软件设计了6条引物,并对LAMP反应温度和反应时间等条件进行了优化。该方法的检测限为30fgRNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、海洋双RNA病毒、病毒性出血败血症病毒以及病毒性神经坏死病毒等没有交叉反应。该方法检测时间短,在1h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明40尾石鲽鱼样品中有3尾感染HRV,与病毒分离结果一致,说明LAMP方法比较适合牙鲆弹状病毒的早期及现场诊断。     

淋巴囊肿病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

根据淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守序列,利用Primer Explorer 3软件设计了5条引物,对LAMP反应温度和反应时间等参数进行了优化.与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒等其它虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都没有交叉反应.将LAMP检测方法与常规PCR进行灵敏度的比较分析,结果显示LAMP的检测灵敏度约为15fg,比常规PCR灵敏度高一个数量级.该方法检测时间短,在1 h内即可完成检测.用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明12尾外观有淋巴囊肿病症状的牙鲆样品中都含有淋巴囊肿病毒,而10尾外观正常牙鲆鱼苗则没有检测到淋巴囊肿病毒(与预期结果一致),说明LAMP方法比较适合淋巴囊肿病毒的早期及现场诊断.     

环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌

研究了用环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测金黄色葡萄球菌的方法。首先根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc中的保守序列设计特异性引物,建立并优化反应条件,然后通过对金黄色葡萄球菌及其他菌种的对比试验,验证引物的特异性并确定方法的检测限。结果表明:在用加环引物的条件下,LAMP反应体系于60℃反应35 min即可扩增成功,而用未加环的引物则需45 min才能看到白色絮状沉淀。对2株金黄色葡萄球菌、3株大肠杆菌、1株醋酸杆菌、1株沙门氏菌进行同步检测,结果发现2株金黄色葡萄球菌均显示阳性,而其他菌株均显示阴性。研究确定了LAMP检测纯培养的金黄色葡萄球菌的最低检测限为100 fg,比PCR的最低检测限低2个数量级。由研究结果可以看出,LAMP法检测金黄色葡萄球菌操作简便,有较高的特异性、灵敏度,为快速检测食品中的致病菌提供了较好的技术平台。     

罗非鱼无乳链球菌间接ELISA检测方法的建立

本文利用终浓度为0.5%(v/v)的甲醛在4℃条件下灭活24 h制备灭活的罗非鱼无乳链球菌,用其作为抗原对兔进行免疫制备兔抗无乳链球菌血清,以无乳链球菌抗兔血清作为一抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔Ig G作为酶标二抗,建立并优化了无乳链球菌的间接ELISA快速检测方法。此检测方法的抗原最适包被浓度为1×10~7 CFU/mL,一抗最适工作浓度为1∶100(v/v),二抗最适工作浓度为1∶2 000(v/v),最低检测限为1×10~4 CFU/mL。利用此法对发病的罗非鱼进行检测,阳性检出率为80%,与本试验选取的指示菌株均无交叉反应。     

环介导等温扩增技术的研究进展

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是利用2对特殊设计的引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效地扩增DNA的新技术,扩增产物为一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物,电泳图谱呈阶梯式带状分布,反应伴有白色的副产物焦磷酸镁沉淀产生,可通过肉眼定性判断反应结果.LAMP技术已在核酸的科学研究、疾病诊断和动物胚胎性别的鉴定等领域得到了广泛的应用.从LAMP技术的原理、引物组成及反应过程、技术特点、方法延伸和应用等方面对其进行了概述,以期为同类研究提供参考.     

转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

 【目的】建立转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法。【方法】以转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S）为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,针对CaMV35S基因的6个区域设计4种特异引物,利用1种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对转基因作物鉴定工作。同时对7种转基因作物进行LAMP检测。【结果】该LAMP方法通过特异性检测含有CaMV35S启动子的转基因作物,其检测结果的特异性与常规PCR方法结果一致,灵敏度是常规PCR的10倍。【结论】转基因作物LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因作物的快速检测,有较好的应用价值。     

基于环介导等温扩增技术的草莓枯萎病检测

为快速鉴定Fusariumoxysporum f.sp.fragariae(Fof)引起的草莓枯萎病,主要采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了 Fof的快速检测体系,使用组织分离法和PCR法对LAMP 技术辅佐验证.结果表明:25 μL ...