转基因水稻外源基因的遗传和表达初步研究

将天蚕抗菌肽B基因应用基因枪法导入水稻TN1发芽肿胚，获得转基因植株2株，转基因水稻T1－T5 5个世代不同株系，对bar基因、抗菌肽基因的遗传和表达进行初步研究。结果表明：转基因后代株系bar^R:bar^S在部分符合3：1分离比率。T1、T4转基因株系PCR、Southern印迹分析表明，T18株有抗菌肽B基因；T4仍有4个株系有抗菌肽基因，其他的株系基因丢失，T3 1个株系Northern印迹证明抗菌肽基因在RNA水平有表达；抗菌肽B转基因水委对白叶枯病的抗病性有提高，抗性能传递到高世代，在T3得到抗病性提高的株系。     

抗草甘膦转基因玉米外源基因ddPCR拷贝数分析

【目的】本研究是从前期获得的100余份转基因抗除草剂草甘膦玉米品系中,挑选T抗-1等14个转基因玉米品系进行拷贝数检测。【方法】采用一种新型的拷贝数分析方法——微滴数字PCR技术(droplet digital PCR,简称dd PCR),设计特异引物对外源抗草甘膦基因2m G2-epsps进行绝对定量分析。【结果】供试的14份转基因材料中10份是单拷贝品系。同时,通过引物探针特异性试验、叶片基因组DNA的PCR抑制和浓度检测、转基因玉米的外源基因2m G2-epsps的实时PCR检测和基因组DNA的酶切等系列研究,建立稳定的转基因玉米拷贝数分析的dd PCR检测体系。【结论】微滴数字PCR技术为这批转基因玉米的下一步转基因生物安全评价提供了重要参数,同时建立了转基因玉米(genetically modified maize)外源基因拷贝数dd PCR分析方法。     

一个耐镉基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步研究MNB1基因在植物应对镉胁迫响应中的功能,构建拟南芥中MNB1基因过量表达载体,通过筛选鉴定最终获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥c DNA为模板,PCR扩增MNB1基因全长,将该基因连接到过量表达载体上;然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,浸花法转化野生型植株;最后利用转基因筛选与遗传鉴定获得MNB1转基因阳性植株。[结果]MNB1基因CDS全长1 368 bp,酶切连接后转化大肠杆菌鉴定得到阳性菌落,测序结果经比对完全正确。通过抗性筛选及PCR电泳检测获得阳性转基因植株。[结论]MNB1基因过表达载体构建成功并获得相应转基因植株,为进一步研究该基因调控植物镉胁迫响应中的功能及其分子机制奠定基础。     

一个耐硒基因过表达载体的构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步验证WRKY47基因在调控硒胁迫应答中的功能,构建WRKY47过表达载体,获得相应的转基因株系。[方法]以野生型拟南芥的c DNA为模板,利用PCR扩增WRKY47基因全长,将该基因连接到p BI121载体上。将获得的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,通过浸化转化法将WRKY47重组质粒转化到拟南芥野生型植株中,利用转基因筛选与遗传鉴定获得WRKY47转基因阳性植株。[结果]扩增获得WRKY47基因,CDS全长1 470 bp,连接转化并获得测序正确的重组载体p BI121-WRKY47。通过抗性筛选和分子鉴定获得阳性转基因植株。[结论]成功构建过表达载体并获得相应的转基因株系,为进一步研究该基因的分子机制奠定基础。     

过表达水稻OsSAPP2基因促进转基因拟南芥叶片衰老

衰老是植物界广泛存在的一种自然现象,在植物整个发育过程中具有重要的地位和生物学意义。叶片衰老是植物生长发育的最后一个阶段,在该过程中叶绿素、核酸、脂质、蛋白和其他大分子等被降解,细胞程序化死亡并引起叶色发生变化,然而目前关于这个生物学过程如何启动和如何调控的研究还比较有限。当植物受到外界环境的影响时也会加速其自身的衰老,蛋白磷酸酶催化的蛋白质去磷酸化反应会在植物适应外界环境的多种生命活动过程中发挥重要的作用。2C型蛋白磷酸酶是植物中数量较多的一类,其通过脱磷酸化来调节细胞的生长发育以及信号传递,从而调整体内相关基因的变化来对抗逆境的胁迫。通过试验研究发现并克隆了一个新的参与水稻(Oryza sativa)叶片衰老进程调控的2C型蛋白磷酸酶编码基因OsSAPP2,并通过双元表达载体构建获得了组成型异源过表达OsSAPP2基因的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)。通过对35S-OsSAPP2转基因拟南芥的表型观察可知,35S-OsSAPP2转基因拟南芥出现莲座叶片变小、数量减少,抽苔和开花时间明显提前,株高增加,叶片颜色变浅、衰老加速等表型。在叶龄依赖和人工黑暗诱导的衰老过程中,过表达OsSAPP2基因导致转基因拟南芥叶绿素含量下降,叶片萎蔫加剧。实时荧光定量PCR检测结果表明,35S-OsSAPP2转基因拟南芥中衰老标志基因SAG12,衰老关键转录因子NAC2、NAP、WRKY6和叶绿素降解关键酶编码基因ACD1等表达量上升;从植物进入衰老过程开始,光合作用关键基因RbcS和RbcL表达量快速下降。可见,OsSAPP2基因参与植物叶片衰老进程的调控,是衰老进程的正向调控因子。     

一个抗旱/抗寒基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步研究LWT1基因在调控低温和干旱应答中的功能,构建拟南芥LWT1基因过表达载体,获得相应的转基因株系.[方法]以野生型拟南芥的cDNA为模板,利用PCR扩增LWT1基因全长,将该基因连接到pART27载体上.将获得的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,通过浸花转化法将LWT1重组载体转化到拟南芥野生型植株中,利用转基因筛选与遗传鉴定获得LWT1转基因阳性植株.[结果]LWT1基因CDS全长990 bp,PCR电泳结果一致,测序比对结果正确.通过抗性筛选和分子鉴定获得转基因植株.[结论]LWT1过表达载体构建成功并获得相应的转基因株系,为进一步研究该基因的分子机制奠定基础.     

一个水稻胚乳特异表达基因的筛选及初步分析

从一个水稻启动子捕获突变群体中筛选到一个T0及T1代GUS组织化学检测均表现胚乳特异表达的启动子捕获系w9101,其T0、T1代自交后代标记基因分离规律及Southernblot分析表明它是一个单T-DNA插入的启动子捕获系;通过TAIL-PCR获得其T-DNA插入的侧翼序列,并在NCBI上对其侧翼序列进行比对,发现该捕获系T-DNA插入位点位于一个推测的肽转运子基因(暂命名为Peptidetransporter9101,PTR9101)启动子内;w9101不同发育时期不同组织RT-PCR检测表明,PTR9101为胚乳特异性表达基因;生物信息学分析表明PTR9101蛋白整条肽链表现疏水性,其跨膜区域和CHL1 (The Nitrate Transporter AtNRT1.1)一样有12个α-螺旋跨膜区,因此推测PTR9101是一个肽转运子基因.     

采用优化的数字PCR方法分析转基因小麦外源基因拷贝数

【目的】探索基于数字PCR的小麦基因拷贝数分析技术,提高目标基因拷贝数的分析通量,促进小麦基因组研究及基因工程研究。【方法】采用中国农业科学院作物科学研究所小麦抗逆分子育种课题组创制的高抗小麦黄花叶病转nib8小麦为试验材料,使用小麦D基因组中的单拷贝纯合内源基因PINb-D1b(籽粒硬度基因)为内参基因,根据转化的抗病基因nib8序列设计4对特异性引物及相应探针,通过试验确定探针和引物的最优浓度,优化体系的退火温度,寻找最合适的模板浓度。然后用数字PCR检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数;同时用Real-time PCR和Southern blot 2种不同方法分析的拷贝数结果,验证上述采用数字PCR方法分析拷贝数的准确性;以PINb-D1b内参基因检测Wx012(蜡质基因)和SSII(淀粉合成基因)2个内参基因的拷贝数,以Wx012和SSII为内参基因检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数,验证以PINb-D1b内参基因的检测结果准确性;在nib8的不同区段设计特异性引物来检测转nib8株系拷贝数分析结果是否有差异。最终,建立基于数字PCR技术的高通量检测小麦目标基因拷贝数的分析方...     

采用优化的数字PCR方法分析转基因小麦外源基因拷贝数

【目的】探索基于数字PCR的小麦基因拷贝数分析技术,提高目标基因拷贝数的分析通量,促进小麦基因组研究及基因工程研究。【方法】采用中国农业科学院作物科学研究所小麦抗逆分子育种课题组创制的高抗小麦黄花叶病转nib8小麦为试验材料,使用小麦D基因组中的单拷贝纯合内源基因PINb-D1b(籽粒硬度基因)为内参基因,根据转化的抗病基因nib8序列设计4对特异性引物及相应探针,通过试验确定探针和引物的最优浓度,优化体系的退火温度,寻找最合适的模板浓度。然后用数字PCR检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数;同时用Real-time PCR和Southern blot 2种不同方法分析的拷贝数结果,验证上述采用数字PCR方法分析拷贝数的准确性;以PINb-D1b内参基因检测Wx012(蜡质基因)和SSII(淀粉合成基因)2个内参基因的拷贝数,以Wx012和SSII为内参基因检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数,验证以PINb-D1b内参基因的检测结果准确性;在nib8的不同区段设计特异性引物来检测转nib8株系拷贝数分析结果是否有差异。最终,建立基于数字PCR技术的高通量检测小麦目标基因拷贝数的分析方法。【结果】通过试验最终确定了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数的检测体系。试验确定引物和探针的最佳终浓度分别为500和250 nmol·L-1,确定体系反应最佳退火温度为59℃,最佳DNA模板量为40 ng。以PINb-D1b作为内参基因检测转nib8小麦中nib8的拷贝数,拷贝数检测结果显示第12、16、17、23、29、30株系中nib8拷贝数分别为7个、1个、1个、1个、1个、7个;同时通过比较发现此结果与Real-time PCR以及Southern blot结果一致;在转基因株系中,以PINb-D1b为内参基因,对Wx012和SSII 2个基因进行拷贝数进行分析,同时发现采用这3种内参基因分析转nib8小麦中nib8基因拷贝数的结果一致,说明这3个内参基因都适合用于数字PCR方法;在nib8上游、中游和下游不同区段的设计引物分析拷贝数检测结果一致。【结论】优化了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数分析方法和反应体系,确立了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数的检测体系,数字PCR分析结果稳定、可靠,检测通量明显提高,具有一定的应用前景。     

Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数

[目的]采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源nos终止子基因的拷贝数。[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的Ct值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的Ct值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数。[结果]内参照基因标准曲线方程为y=-3.422x＋35.201,R2=0.998;外源基因标准曲线方程为y=-3.348x＋34.890,R2=0.999。nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝。[结论]该研究为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据。     

2个水稻器官特异表达基因的鉴定及分析

研究组织特异表达基因对揭示植物生长发育机制具有重要的意义。通过生物信息学、RT-PCR及荧光定量PCR方法鉴定了2个水稻特异表达基因,即Os01g18840叶特异和Os01g28500茎叶颖特异表达基因。通过检测它们在PEG、NaCl、ABA及暗处理下的表达情况,发现在各种胁迫处理下,Os01g18840基因的表达受到抑制,Os01g28500基因的表达受到诱导。进一步分析它们的基因及蛋白结构特点,发现Os01g18840蛋白含有1个卷曲螺旋结构域,是1个中间纤维蛋白;Os01g28500蛋白含有1个SCP类似结构域,是与病原反应相关的蛋白。另外,对它们上游启动子区的顺式元件进行分析,结果表明它们都含有大量的与叶片、叶肉细胞或绿色组织中表达相关的顺式作用元件。     

Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数

[目的]采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源,Ⅲ终止子基因的拷贝数。[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的cz值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的0值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数。[结果]内参照基因标准曲线方程为Y=-3．422x＋35．201,R^2=O．998;外源基因标准曲线方程为Y=-3．348x＋34．890,R^2=0．999。nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝。[结论]为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据。     

外源基因在转基因植物中的表达

概述了外源基因在转基因植物中的表达特点，性能及影响外源基因表达的因素。     

双价抗虫转基因水稻的育成及初步鉴定

[目的]构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,为选育广谱、高抗转基因抗虫水稻提供技术参考.[方法]构建半夏凝集素基因(pta)和苏云金杆芽孢菌基因(Bf)两个抗虫基因的双价表达载体pCAMBIA 1301-Bt-pta,利用大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌LBA4404转化水稻恢复系辐恢838,同时对转化植株进行GUS染色及PCR鉴定.[结果]以构建的双价植物表达载体pCAMBIA 1301-Bt-pta为模板,PCR扩增到pta基因的部分片段,大小为807 bp,且该载体经Hind Ⅲ酶切后,能得到15854 bp的中间载体pCAMBIA 1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段.对转化植株进行GUS染色,得到3株转基因阳性植株,经PCR鉴定结果显示外源基因已成功导入水稻.[结论]通过构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,成功获得的转基因植株可用于水稻抗虫转基因恢复系及组合的研究,以提高其抗病虫害能力.     

SYBR Green实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数

采用SYBR Green I real-time PCR方法检测转基因大豆中外源基因35S边界基因的拷贝数,以大豆凝集素基因(Lectin)作为内参照基因,以转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,初始浓度为0.43μg·μL-1,进行5倍梯度稀释得到内参照基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线:y=-2.9915x...     

转hFat-1基因猪外源基因整合分析及拷贝数测定

对转人源化Fat-1基因猪的15头传代仔猪进行PCR检测,发现有7头阳性猪,其断奶后成活5头仔猪。对这5头仔猪进行Southern印迹杂交试验,确认3头仔猪整合有hFat-1基因。采用荧光实时定量PCR法测定原代转hFat-1基因公猪及3头阳性仔猪外源基因的拷贝数,分别是2、1、1、2个拷贝。转hFat-1基因猪能够将外源基因遗传到下代仔猪,但外源基因具有遗传不稳定的趋向。     

水稻OsCERK2转基因植株的获得及初步分析

以水稻粳稻品种日本晴为研究材料,利用拟南芥CERK1的蛋白质序列检索,在水稻基因组候选了与拟南芥CERK1同源的水稻基因OsCERK2,通过RT-PCR分离了该基因的全长cDNA。生物信息学分析显示,OsCERK2是一种含有信号肽的质膜蛋白,胞外结构域含有LsyM基序,激酶结构域含有酪氨酸蛋白激酶结构域。构建了由35S启动子驱动该基因的过表达遗传转化载体和由玉米的泛素基因的启动子驱动的RNA干涉（RNAi）的遗传转化载体,利用农杆菌介导的遗传转化技术,将OsCERK2基因导入水稻,得到T0代转基因植株。对T0代植株进行了PCR检测和半定量RT-PCR检测,获得了OsCERK2有效表达的转基因植株。     

转hFat-1基因猪外源基因整合分析及拷贝数测定

对转人源化Fat-1基因猪的15头传代仔猪进行PCR检测,发现有7头阳性猪,其断奶后成活5头仔猪。对这5头仔猪进行Southern印迹杂交试验,确认3头仔猪整合有hFat-1基因。采用荧光实时定量PCR法测定原代转hFat-1基因公猪及3头阳性仔猪外源基因的拷贝数,分别是2、1、1、2个拷贝。转hFat-1基因猪能够将外源基因遗传到下代仔猪,但外源基因具有遗传不稳定的趋向。     

反向PCR克隆转基因水稻的外源基因旁侧序列

以反向PCR（IPCR）为基础建立了适合于处理大量材料的克隆转基因水稻中外源基因旁侧序称的技术体系，该方法中用小量法提取转基因水稻总DNA；总DNA用10倍过量的限制性内切酶在50μL反应体积中进行过夜酶切；酶切片段在20μL体积中进行自连接，之后进行套式PCR（nested-PCR)扩增旁侧序列。在套式PCR结合了热启动PCR和降落了PCR技术以增强PCR反应的特异性。用这种方法，本实验室在一周内克隆了35个转基因水稻株系中外源基因的旁侧序列，长度在300－750bp之，PCR产物的特异性用Southern杂交进行了证明，实验结果表明这个方法具有快速、稳定和高效的优点。     

拟南芥CDR6基因过表达载体构建及过量表达植株筛选鉴定

[目的]以拟南芥为材料克隆CDR6基因,构建CDR6基因的过量表达载体并筛选鉴定获得过表达植株.[方法]提取拟南芥mR-NA,反转录成cDNA,并以此为模板克隆CDR6基因CDS全长,通过限制性内切酶切割、T4 DNA连接酶连接,将CDR6基因CDS全长连接到带有35S强启动子的pXB094载体上;然后转化至Trans1-T1感受态细胞中,菌落PCR鉴定阳性单克隆并测序确认.将重组质粒转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,通过浸花法侵染拟南芥野生型植株,通过抗性筛选和鉴定获得预期的转基因植株.[结果]菌落PCR鉴定和测序结果表明CDR6基因已成功构建至pXB094载体;通过抗性筛选并鉴定获得了过量表达阳性植株.[结论]筛选和鉴定获得的过量表达植株为研究CDR6基因的分子功能奠定了基础.