pAdKDR-tk自杀基因系统靶向杀伤鼻咽癌肿瘤血管的体内研究

目的探讨pAdKDR-tk自杀基因系统靶向杀伤肿瘤血管对鼻咽癌的治疗作用。方法将24只鼻咽癌荷瘤裸鼠随机分成3组,分别于0、1、7d向瘤体内注入重组腺病毒液0.1mL。第2次注射病毒液时,组Ⅰ、组Ⅱ、组Ⅲ分别腹腔注射pAdKDR-tk/PBS、pAdKDR-tk/GCV和pAdCMV-tk/GCV100mg/kg,每天1次,连续10d。观察治疗前后肿瘤体积、病理及微血管密度变化。结果组Ⅲ裸鼠移植肿瘤缩小速度最快,组Ⅱ次之,而组Ⅰ增大。病理检查显示组Ⅱ、Ⅲ肿瘤出现不同程度坏死,坏死灶中心位于病毒液注射部位。Ⅷ因子相关抗原免疫组化检查发现肿瘤血管密度组Ⅱ最低,组Ⅰ最高,两组之间差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 pAdKDR-tk自杀基因系统对鼻咽癌肿瘤血管有良好的靶向杀伤效应,从而达到破坏肿瘤细胞的作用。     

犬五联病毒活疫苗制备用犬肾细胞系的建库筛选与检定

 以人类子宫颈癌细胞系Hela为阳性对照 ,以连传 3代的犬、猫肾原代细胞 (CKC、FKC)作为阴性对照 ,对来自国内外不同单位收集的另外 4株MDCK传代细胞系培养 2 5～ 6 7代的完整活细胞进行裸鼠致癌 /致瘤实验观察 ,筛选出致癌性极低、符合细胞遗传学要求、无传染因子污染的 2株MDCK细胞系用于制苗 ,并建立了相应的细胞种子库和工作库 ,供科研和生产使用 ,4年运转很好。不同代次MDCK细胞系染色体众数所占比率的相差率一般不超过 5 %～ 15 % ,结构畸变率一般为 0～ 3%。研究表明 ,MDCK细胞染色体遗传特征决定致瘤性质 ,并具有种属特异性 ,MD CK细胞不论核型如何 ,始终具有致癌性 ,但其致癌 /致瘤性差 (2 3/ 5 9) ,且一般致上皮源性恶性肿瘤 ,多为高中分化腺癌。降低制苗毒液中细胞系基因含量 ,完全可以将MDCK细胞系 (WB和H株 )用于犬五联苗生产。MDCK细胞超二倍体YB株和亚二倍体与超二倍体KA株不能用作病毒活疫苗培养基质。找出了MDCK细胞系的染色体变异率、软琼脂中克隆形成率、对植物凝集素的凝集性和在裸鼠体内形成癌肿的潜力之间的可能相关性 ,发现细胞系染色体数目增加、克隆形成率增高、凝集性增强 ,则致癌 /致瘤性相应提高     

应用重组抗原预防猪囊虫病的实验研究

应用两种重组抗原分别制成免疫刺激复合体疫苗进行猪囊虫病免疫预防实验。实验猪接种二次,间隔14d,第二次接种后7d 用有钩绦虫卵感染,2万个·头~(-1)。感染后116d 屠宰剖检。对照组9头猪共发现1067个囊虫,平均118.6个·头~(-1);免疫 A 组8头实验猪共发现510个囊虫,平均63.75个·头~(-1),减虫率为46.2%;免疫 B 组9头实验猪共发现83个囊虫,平均9.2个·头~(-1),减虫率为92.2%.在免疫 B 组实验猪体内发现的囊虫发育不全,眼观虫体小,囊液少,囊膜较厚,不透明,呈乳白色;病理组织学检查发现,囊虫组     

构建表达猪瘟病毒E0基因的重组杆状病毒

为了得到可溶性重组猪瘟病毒E0蛋白并便于观察重组蛋白的表达情况,将增强型水母绿色荧光蛋白基因(EGFP)与E0基因相连插入昆虫杆状病毒转移载体中,与线性杆状病毒DNA共转染Sf9细胞后通过噬斑纯化得到纯的重组杆状病毒,将其感染Sf9细胞制备P1种子液,同时用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,剔除表达效果差的重组杆状病毒。再用P1种子液感染Sf9细胞制备高效价的P2种子液。通过病毒液的梯度稀释和噬斑测定,确定P2种子液的病毒滴度达1.14×107pfu/mL。将P2种子液以MOI 5~10接种指数期Sf9细胞,3 d后呈现出最强的荧光。重组杆状病毒在Sf9细胞中的初步成功表达为进一步制备重组E0糖蛋白,研究E0蛋白的结构与功能、免疫诊断新方法和猪瘟基因工程疫苗奠定基础。     

猪囊尾蚴“四性细胞系”代射产物（可溶性抗原）的免疫原性

应用仔猪20头,以猪囊尾蚴“四性细胞系”的可溶性抗原作为免疫原,对经过第1次用不同细胞剂量疫苗免疫的猪,再次用与细胞数量相适应的细胞代射产物的不同剂量疫苗,对其中的11头进行第2次免疫以第2次还是注射细胞疫苗的3头、只注射1次细胞疫苗的2头,和空白对照猪2头作对照组,以观察代射产物抗原的免疫原性。于第1次细胞疫苗免疫后的68d,最长94d用细胞加代谢产物疫苗进行了这次免疫,14d后攻虫,每头使用人有钩绦虫卵,6000枚,3个月后屠宰检查虫体。第1次用10万细胞疫苗免疫,第2次用1千万细胞加代谢产物疫苗免疫该组动物中的2头,平衡有5个囊尾蚴,但这2头猪均发生了囊尾蚴钙化;另一组第1次用100万细胞疫苗免疫,第2次用2千万细胞加代谢产物疫苗免疫该组全部3头动物,平均有3.6个囊尾蚴,这3头猪也都有囊尾蚴钙化。2个实验组出现免疫猪的100%的钙化现象,是免疫治疗作用,是猪囊尾蚴四性细胞系代谢产物的特殊免疫作用。     

猪睾丸细胞保存期试验及致瘤性鉴定

分别从液氮罐中取出保存12个月、36个月、60个月的猪睾丸细胞(ST细胞),在同等条件下培养,观察细胞生长情况。在3次传代后,每批次细胞分别接种PPV及PRV,观察细胞病变出现的时间,并测定TCID_(50)。细胞传代50次后,取活细胞及经反复冻融的细胞分别接种裸鼠,进行临床观察。结果表明:ST细胞在液氮罐中保存60个月,对细胞生长和病毒繁殖无显著影响,经50次传代后的细胞无致瘤性。     

五种人细癌胞系裸小鼠移植瘤转移特征的初步研究(摘要)

我们将五种来源于人类的低分化恶性上皮性肿瘤细胞系(鼻咽低分化鳞癌、肺低分化腺癌,宫颈低分化鳞癌各一种,胃低分化腺癌二种)移植到饲养于层流架中的1～3月龄NC 及 Swiss(nu/nu)两系裸小鼠,观察其移植瘤转移的某些生物学特性。原代接种细胞数为1～2×10~6细胞/0.5 ml,均一次获成功,共接种裸鼠10只,成活率为100%。五种人癌移植瘤鼠间连续传3～17代不等,共皮下移植两系裸鼠     

BHK-21细胞用于塞内卡病毒培养最高代次范围研究

根据《兽用生物制品生产用细胞系试验技术指导原则》,将BHK-21细胞原始细胞库F11代传至F52代,取其中部分代次按照《制造及检验试行规程》进行细胞形态、纯净性、胞核学检查、细胞致瘤性检验、病毒培养适应性检验。结果表明,BHK-21细胞F11～F52代各指标的鉴定结果符合规程要求。为确保细胞种子稳定性,建议疫苗生产用细胞限定在43代以内。     

禽流感免疫注射关键事项

从疫苗的运输与保存,疫苗使用前的检查和选择,疫苗的预温,接种期间的管理,免疫日龄,免疫剂量,注射部位、方法,免疫接种的针头要严格消毒,加强免疫空白期的饲养管理等方面介绍了禽流感免疫注射应注意的事项。     

永生化山羊子宫内膜上皮细胞系的建立及其生物学特性

为建立永生化山羊子宫内膜上皮细胞系并研究其生物学特性,将人端粒酶逆转录酶催化亚单位(Human telomerase reverse transcrip tase,hTERT)导入原代培养的山羊子宫内膜上皮细胞(Endometrium epithelial cells,EECs),经G418筛选培养,以获得一株永生化山羊子宫内膜上皮细胞(hTERT-EECs);利用流式细胞仪检测其生长周期、凋亡情况及倍体情况;利用MTT法检测其血清依赖性;软琼脂克隆形成试验检测其在半固体培养基中的克隆形成能力;裸鼠致瘤实验检测其成瘤性。结果显示:hTERT-EECs处于S期的细胞(43.2%±2.3%)大于2代EECs(38.7%±1.2%),差异显著(P0.05);hTERT-EECs的凋亡率(1.1%±0.2%)明显低于2代EECs(3.6%±0.5%)(P0.05);倍体分析结果表明hTERT-EECs为二倍体细胞;血清依赖性检测证明hTERT-EECs仍有血清依赖性;软琼脂中无克隆形成能力;对于裸鼠无致瘤性。证明hTERT-EECs具有更强的生长活性,基本属于正常细胞,不具有潜在致瘤性。     

犬肾细胞系的染色体组型分析与致癌/致瘤性的实验研究

 以人类子宫颈癌细胞系Hela为阳性对照 ,以连传 3代的犬、猫肾原代细胞 (CKC、FKC)为阴性对照 ,对来自国内外不同单位收集的 4株MDCK传代细胞系培养 2 5～ 4 5代的完整活细胞或冻融裂解细胞进行裸鼠致癌 /致瘤实验观察 ,筛选出致癌性极低、符合细胞遗传学要求、无传染因子污染的几株MDCK细胞系用于制苗 ,并建立了相应的细胞种子库和工作库 ,供科研和生产使用 ,4年运转很好。不同代次MDCK细胞系染色体众数所占比率的相差率一般不超过 5 %～ 15 % ,结构畸变率一般为 0～ 3%。研究表明 ,MDCK细胞染色体遗传特征决定致瘤性质 ,并具有种属特异性 ,MDCK细胞不论核型如何 ,始终具有致癌性 ,但其致癌 /致瘤性差 ,只有超二倍体以上细胞才具有高的致癌 /致瘤率 (如YA株的为 2 8/ 5 8) ,亚二倍体细胞的致癌 /致瘤率很低 (其它 3株MDCK细胞的致癌 /致瘤率为 5 / 5 4 ) ,且一般致上皮源性恶性肿瘤 ,多为高中分化腺癌。冻融裂解癌细胞系 (X株Hela、JA株Vero、M株BHK 2 1、YA株MD CK)的致癌 /致瘤性相应降低 ,极低致癌 /致瘤性细胞系 (M株或JC株MDCK)不会因冻融裂解而增加致癌 /致瘤性。证明MDCK细胞系冻融裂解物不致癌 ,降低制苗毒液中细胞系基因含量 ,完全可以将MDCK细胞系 (M ,JB ,JC株 )用于犬五联苗生产。MDCK细胞     

IL-18基因转染对大鼠胶质瘤体内生长及肿瘤细胞凋亡的影响

目的分析转染外源性IL-18基因后9L胶质瘤细胞体内成瘤及对肿瘤细胞凋亡的影响。方法用立体定向技术将体外用逆转录病毒转染IL-18基因的9L胶质瘤细胞(9L/IL-18)、转染空载体的9L胶质瘤细胞(9L/LXSN)及未转染的9L细胞接种到F344大鼠颅内建立实验动物模型,观察各组细胞对大鼠的致瘤性,计算成瘤率;原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡情况,计算各组肿瘤细胞的凋亡率;RT-PCR和Westen Blot法检测肿瘤组织中Bax和Bcl-2的表达。结果三组大鼠成瘤率均为100%;TUNEL法检测结果显示,接种9L/IL-18细胞组肿瘤组织内出现大量凋亡细胞,凋亡率为(22.2±1.02)%,明显高于接种9L/LXSN[(5.7±0.32)%]及9L[(6.4±0.51)%]细胞组(P0.05);接种9L/IL-18细胞组肿瘤组织中Bax的表达较其他两组升高,Bcl-2的表达较其他两组降低。结论 9L胶质瘤细胞转染外源性IL-18基因后,可通过上调Bax的表达,下调Bcl-2的表达促进肿瘤细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。     

结直肠癌生殖器官移植性肿瘤动物模型的建立

【目的】建立CT26细胞株BALB/c小鼠生殖器官移植肿瘤模型的方法.【方法】将CT26细胞株传代培养于小鼠皮下3代后取指数生长期细胞制成悬液,采用纤维蛋白凝胶移植接种和荷包缝合移植接种2种手术方法,移植固定于小鼠生殖器官皮下,观察小鼠生理状况、成瘤率、移植瘤成长形状和组织病理学变化.【结果】纤维蛋白凝胶移植接种成瘤率为72%,雄性雌性分组平均成瘤时间(13.37±3.06)d和(12.33±2.45)d,荷包缝合移植接种成瘤率为59%,雄性雌性组成瘤时间(15.66±3.77)d和(14.25±2.08)d,成瘤组织病理切片无明显差异.【结论】纤维蛋白凝胶移植成瘤组织病理特征符合肿瘤学动物模型需求且建模成功率高.     

EPF单抗联合顺铂对家畜膀胱肿瘤抑瘤效果的影响 ——基于膀胱肿瘤裸鼠移植瘤模型

为观察早孕因子单克隆抗体(EPF-McAb)联合顺铂(DDP)对膀胱癌细胞EJ裸鼠移植瘤的抑制作用,常规将EJ细胞接种于裸鼠右侧背部皮下,待肿瘤长至直径约5 mm时随机分为4组,每组5只,即空白对照组、顺铂组、低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组。定期测量裸鼠肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。给药2周后处死裸鼠,剥取肿瘤,称瘤重,计算抑瘤率。通过苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察细胞病理学改变;免疫印迹法检测早孕因子(EPF)的表达情况。结果表明,顺铂组、低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组裸鼠移植瘤生长速度均慢于空白对照组。与顺铂组比较,低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组裸鼠末次给药的移植瘤体积分别为(131.05±8.26)和(97.92±7.35)mm~3。低剂量单抗联合组抑瘤率(35.78%)和高剂量单抗联合组抑瘤率(53.04%)均高于顺铂组抑瘤率(22.36%),差异均达显著水平(P0.05)。与空白对照组比较,单抗联合组裸鼠EPF蛋白的表达量下降(P0.05)。表明EPF-McAb联合顺铂可抑制膀胱癌细胞EJ在裸鼠体内增殖,其机制可能通过抑制EPF的表达发挥作用。     

人鼻咽癌裸小鼠移植瘤(NCN-Z1)的建立

国内外人鼻咽癌组织裸鼠移植成功的报道仍很少,作者自1985年底起,接种38例人鼻咽癌活检组织于裸小鼠皮下,1例移植成功,至今已在鼠间传11代。该移植瘤皮下移植具有成功率高(100％)、生长较稳定、宿主带瘤存活时间较长及无自发消退等特点,光镜及电镜检查均保留了来源组织的低分化鳞状细胞癌特征,染色体检查证实为人类肿瘤染色体,认为可作为整体研究人鼻咽癌生物学特性的有用模型。     

南方根结线虫侵染黄瓜幼根组织病理学观察

人工接种南方根结线虫（Meloidogyn incognita）,观察不同侵染时间黄瓜根部组织的病理特征。结果显示：接种后6 d的根尖分生区、伸长区出现膨大、对称的根结,根中心的原形成层细胞分化出巨型细胞;10 d在根毛区及以上部位出现既有对称又有偏于一侧的根结,周围有原生木质部导管出现,根结中巨型细胞阻断了导管;16 d次生维管组织提早出现;20～30 d导管纵向排列无序,形状扭曲,皮层中有新维管组织产生。总之,随侵染时间的延长,根部受害部位逐渐由内皮层扩展至皮层,根结逐渐由巨型细胞、提早形成的次生维管组织以及皮层中的新维管组织共同形成;导管逐渐受阻,排列扭曲无序。     

三氧化二砷影响人乳腺癌裸鼠移植瘤侵袭性和黏附性Syk机制

目的探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,AS2O3)影响人乳腺癌裸鼠移植瘤侵袭性和黏附性Syk作用机制。方法成功建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型,随机分为实验组(AS2O3)和对照组(生理盐水)。7d后观察肿瘤体积的变化,流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡情况及两组荷瘤裸鼠肿瘤组织中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达情况。结果实验组荷瘤裸鼠肿瘤体积明显低于对照组,差异有统计学意义;实验组荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞凋亡率明显高于对照组(P0.01);实验组ICAM-1表达明显高于对照组(P0.05);实验组MMP-9表达低于对照组(P0.05)。结论 AS2O3对人乳腺癌裸鼠移植瘤具有明显的抑瘤作用,可降低肿瘤组织侵袭性增加其黏附性,其作用机制可能与蛋白酪氨酸激酶Syk的表达有关。     

猪细小病毒NJ株ST细胞适应性研究

为评价ST细胞代次的增高对猪细小病毒NJ株免疫原性的影响,将第10、30、60代ST细胞分别接种猪细小病毒NJ株F8、F18代毒种进行病毒培养,通过检测其病毒含量、血凝价以及制备疫苗免疫机体的抗体水平等指标来进行评价。结果表明,各代次病毒含量为10~(7.2)～10~(7.5)TCID_(50)/mL,血凝价为2~9～2~(10);制苗后免疫阴性豚鼠与后备母猪,免疫28 d后均出现抗体反应,HI效价分别为2~7～2~9和2~8～2~9。不同代次毒种接种不同代次ST细胞培养的病毒含量、血凝价及疫苗免疫效力均符合要求。各代次细胞增殖性能稳定,培养的PPV NJ株均能满足兽用生物制品的生产要求。     

ST细胞的鉴定及种子细胞库的建立

为确保疫苗生产的的安全性,对不同代次的ST细胞进行鉴定。从中国兽医药品监察所引进第40代的ST细胞,传至80代,每个代次各冻存3瓶于液氮中。细胞复苏后,对细胞的特征、纯净度、核型、致瘤性及对细胞的毒性进行了研究。结果表明,ST细胞系呈现梭状上皮细胞,生长状态良好,细胞的生长速度基本一致;细菌、霉菌、支原体、外源病毒的检测均为阴性;染色体数目为19对且核型相同;无致瘤性;对豚鼠和兔子无毒性;病毒在ST细胞系中稳定地繁殖,TCID50≥107.00,HI≥1∶32。建立ST细胞的种子细胞库,为开展猪细小病毒疫苗的生产提供安全保障,也为猪伪狂犬病疫苗及猪细小病毒弱毒苗的研究提供基础理论依据。     

SCID小鼠原位接种LNCaP前列腺癌模型的建立

通过在SCID小鼠前列腺内接种LNCaP前列腺癌细胞建立了原位接种模型并探讨其应用价值。用微量注射器在SCID小鼠的前列腺左右背外侧叶包膜下接种小鼠前列腺癌LNCaP细胞106个建立原位移植瘤模型,以皮下移植瘤模型作为对照比较两者的生存期、肿瘤转移发生情况,并在电镜下观察LNCaP前列腺肿瘤细胞和小鼠正常前列腺组织细胞的特征。结果发现原位模型组小鼠平均生存时间为(21±2.1)d较对照组(35.0±4.5)d明显缩短,差异非常显著(P0.01);原位模型组小鼠全部发生肿瘤转移,其中盆腔淋巴和肺的转移发生率分别为100%(15/15)、60%(9/15);电镜观察发现SCID小鼠的正常前列腺细胞与癌变后的细胞体积及细胞器均有很大差异。SCID小鼠的前列腺癌原位移植瘤模型较好地模拟了人癌体内的自然生长状况,为进行前列腺癌的研究提供有用的工具。