荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

鹧鸪茶种质资源ISSR分子标记中的引物筛选

[目的]为快速和准确地对鹧鸪茶种质材料进行ISSR分析提供有效引物。[方法]基因组DNA的提取采用改良的CTAB法。利用99个ISSR引物,对来自海南岛境内的10个居群中共20份鹧鸪茶种质材料进行PCR扩增,以筛选出适合于所有鹧鸪茶种质材料进行ISSR分析的有效引物。[结果]从99条供试引物中共筛选出15条多态性丰富、条带清晰且可重复性良好的有效引物。用筛选出的15条引物对66份鹧鸪茶种质材料进行ISSR-PCR扩增,均可获得带型丰富和清晰可辨的DNA指纹图谱;共扩增出286条DNA谱带,其中231条为多态性带,占总扩增带数的80.77%,平均每个引物扩增出19.1条谱带。[结论]所筛选的15条引物可以有效地应用于鹧鸪茶种质资源材料的ISSR分析。     

华东黄杉ISSR引物反应体系的优化与筛选

在研究华东黄杉(Pseudotsuga gaussenii Flous)的遗传多样性过程中,为了获得清晰、重复性好的ISSR扩增结果,对影响ISSR-PCR的多个因素包括模板浓度、Mg2 浓度、dNTPs浓度、Taq酶的用量、退火温度和循环次数等指标进行了筛选和优化,确定了华东黄杉ISSR-PCR分析的最佳扩增条件为:20μL PCR反应体系中,2μL10×Taq酶配套缓冲液,1.5 UTaq聚合酶(上海Promega公司),1.5~2.5 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs,10 ng/L模板DNA。用来自江西三清山的4个个体,以100个ISSR引物进行PCR扩增,筛选出扩增效果较好的12个引物。     

鹧鸪茶种质资源ISSR分子标记中的引物筛选（摘要）

[目的]为快速和准确地对鹧鸪茶种质材料进行ISSR分析提供有效引物。[方法]基因组DNA的提取采用改良的CTAB法：先用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,EB染色,以Lambda DNA/HindⅢ＋Eco RIMarkers为参照,电泳结果用Gel Doc XR型凝胶成像分析系统下照相并记录。再用Biophotometer紫外分光光度计分别测定OD_（260）和OD_（280）,并计算出OD_（260）/OD_（280）值,每份样品的OD_（260）/OD_（280）比值均要求在1.8～2.0范围内。测定每份样品DNA浓度（ng/μl）,并将其稀释至20 ng/μl,分装后置-20℃保存。利用99个ISSR引物,对来自海南岛境内的10个居群中共20份鹧鸪茶种质材料进行PCR扩增,以筛选出适合于所有鹧鸪茶种质材料ISSR分析的有效引物。[结果]从99个供试引物中共筛选出15个多态性丰富、条带清晰且可重复性良好的有效引物。用筛选出的15个引物对66份鹧鸪茶种质材料进行ISSR-PCR扩增,均可获得带型丰富和清晰可辨的DNA指纹图谱;15个引物共扩增出286条DNA谱带,其中231条为多态性带,占总扩增带数的80.77%,平均每个引物扩增出19.1条谱带。[结论]所筛选的15条引物可以有效地应用于鹧鸪茶种质资源材料的ISSR分析。     

女贞ISSR分子标记的引物筛选

利用60个ISSR引物，对来自不同地域的12份女贞种质材料进行PCR扩增，筛选出12个多态性丰富、条带清晰且重复性良好的、适合于所有女贞种质材料进行ISSR分析的有效引物。筛选出的12个有效引物对12份女贞种质材料进行ISSR—PCR扩增，均可获得带型丰富和清晰可辨的DNA指纹图谱，共扩增出228条DNA谱带，其中210条为多态性带，占总扩增带数的92．1％，平均每个引物扩增出19条谱带。本试验筛选的12条引物可以有效地应用于女贞种质资源材料的ISSR分析。     

梨种质资源遗传多样性研究中的RAPD技术引物筛选

[研究目的]RAPD技术已广泛用于种质资源遗传多样性研究,中国梨属植物资源丰富,通过对RAPD多态性引物的筛选,为RAPD技术在梨属种质资源中的应用提供参考;[方法]以梨属44个种和品种为试验材料,通过RAPD扩增技术,筛选RAPD多态性引物;[结果]从50个随机引物中筛选出18个多态性引物,所选出的多态性引物每个引物扩增出的条带数在4～11之间,扩增出的DNA片段分子量大多在450～2000 bp之间,共扩增出118个条带,其中样品间相同的条带数有11条,呈现多态性的条带107条,所选引物的多态百分率达90.8%.[结论]所筛选的18个引物为梨属植物RAPD扩增多态性引物,可广泛用于梨属植物的RAPD扩增技术.     

石榴种质资源RAPD反应体系的引物筛选

以产自山东省枣庄市的18个石榴品种叶片为材料,采用CTAB法提取各石榴品种基因组DNA,对所提取的DNA采用紫外分光光度计测定D260nm和D280nm,并计算D260nm/D280nm,分析DNA的浓度和纯度.结果表明D260nm/D280nm均接近于1.8,纯度较高,能用于RAPD-PCR扩增的模板.以5种遗传背景差异大的石榴品种的DNA为模板,筛选用于石榴RAPD扩增的多态性引物,结果表明,通过分析多态性位点,筛选出重复性好、条带清晰的3条多态性引物S66、S1304、S1440,其多态性位点比例较高,分别为75.0％、60.9％、63.6％.     

芦笋ISSR引物筛选及遗传多样性分析

采用ISSR技术对26份芦笋品种进行遗传多样性分析。以芦笋基因组DNA为模板,筛选出18条适用于芦笋的ISSR引物,并确定了它们的最佳退火温度。用这18条引物对收集自5个国家的26份芦笋品种进行ISSR分析,共获得扩增位点145个,其中多态性位点111个,多态性位点比例为76.6%。采用NTSYS2.10e软件进行相似系数分析,构建聚类树状图。在相似系数0.78处划线,可将样品划分为5个类群。     

山药种质资源亲缘关系的ISSR分析

采用ISSR标记技术,分析了94份山药种质资源的遗传多样性及亲缘关系.从100条引物中优选出24条引物,共扩增出352条清晰条带,其中多态性带344条,多态性百分率为97.7％.聚类分析结果将94份山药资源分为4类,第Ⅰ类为薯蓣群、第Ⅱ类参薯群、第Ⅲ类为山薯群、第Ⅳ类褐苞薯蓣群,各种类群的遗传距离依次为:0.053 8～0.088 4,0.035 3～0.068 2,0.053 3～0.138 2,0.054 2～0.126 6,说明4个类群内各资源间亲缘关系由远到近的顺序为:参薯＞山薯＞薯蓣＞褐苞薯蓣.以遗传相似性为标准,以种群为单位,参薯群与山薯群亲缘关系最近;与薯蓣群亲缘关系次之;与褐苞薯蓣群亲缘关系最远.     

丝瓜种质资源亲缘关系的ISSR分析

利用ISSR标记,对来源于不同地区的丝瓜种质资源的亲缘关系进行了分析.从80个ISSR引物中筛选出多态性强、重复性好的9个引物,对43份丝瓜种质基因组DNA进行扩增,共扩增出60条谱带,平均每个引物扩增出6.67条带,其中多态性带47个,多态性位点百分率为78.3%.丝瓜种质间遗传相似系数变化范围在0.37～0.98之间,暗示了丝瓜栽培种内的遗传基础相对狭窄.利用UPGMA聚类分析,43份丝瓜种质被划分为6个类群,类群的划分与形态学性状较吻合,而且与地理来源也有较高的相关性.     

毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建

目的针对毛白杨优树种质资源形态学差异小、不易区分等问题,利用多态SSR引物构建优树种质资源指纹图谱,为毛白杨种质资源管理、新品种选育、知识产权保护等提供参考。方法本研究以山东冠县毛白杨种质资源库469个优树无性系为对象,从毛白杨SSR多态引物筛选入手,通过荧光SSR引物PCR扩增和毛细管电泳仪检测筛选SSR引物,并构建指纹图谱。结果在2 317对SSR引物中,共计得到清晰、特异、多态、稳定扩增的SSR引物406对,这些SSR引物在19条染色体上的分布数量介于3 ~ 39对之间,利用BLAST比对分析可将其中389对SSR引物定位到毛果杨基因组,构建了毛白杨优树种质资源多态SSR引物库。应用多态性较高的SSR核心引物,以及特异的SSR辅助引物相结合的技术策略,筛选出25对多态性较高的SSR核心引物,以及13对特异的SSR辅助引物,构建了毛白杨种质资源库内469个优良无性系指纹图谱库,并完成了指纹图谱的QR编码。结论本研究成功构建了毛白杨种质资源多态SSR引物库和优树无性系指纹图谱库,对与毛白杨类似的林木种质资源遗传变异研究以及品种鉴定、系谱分析等具有重要意义。      

亚麻ISSR的反应体系优化及引物筛选

使用引物U853对亚麻ISSR反应条件进行优化筛选。结果表明:20μL反应体系中,10×Buffer 2μL,Mg2+2.5 mmol/L,Taq酶1.5 U,基因组DNA 50 ng,dNTP 0.25 mmol/L,引物0.5μmol/L。PCR反应程序为:94℃4 min;94℃40 s,55℃1 min,72℃90 s,40个循环;72℃10 min。在该条件下,使用60条ISSR引物对3个有代表性的亚麻(原2003-84、K-6542、SXY8)DNA样品扩增,筛选出13条多态性好,重复性高的引物。     

果蔗种质资源的RAPD和ISSR分析

利用RAPD和ISSR分析30份果蔗种质的遗传背景，筛选出几个扩增条带清晰、多态程度较高、稳定可靠的引物(其中RAPD引物SS和ISSR引物WW可一次性准确地检测出黑皮果蔗、地方果蔗和自育杂交种间的区别)，而且ISSR又比RAPD检测到更多的遗传多态性(二者的多态性条带比分别为61．35％和56．8％)。     

11种荆芥种质资源ISSR分析

利用ISSR分子标记技术对不同地区的11种荆芥种质资源进行分析,以此来探讨我国荆芥种质资源的遗传多样性。以11种荆芥幼苗为材料,CTAB法提取其基因组DNA;采用正交试验优化ISSR技术体系影响因素;利用100条ISSR引物进行ISSR扩增,最后计算供试材料之间的遗传距离并进行聚类分析。结果表明,最优ISSR-PCR体系,在25 μL体系中,模板DNA 50 ng,引物0.75 μmol·L^-1,Taq DNA聚合酶1 U;100条引物中55条引物可扩增出结果,共扩增出458条条带,平均每个引物扩增出8.3条,其中246条为多态性带,多态性比率为53.71%;11个荆芥种质资源的遗传距离在0.208 3~0.709 1;在遗传距离为0.50处,可将供试的11种荆芥材料分为2大类;在遗传距离为0.40处,可将供试的11种荆芥材料分为5大类,研究结果表明我国荆芥种质资源遗传多样性较低。     

龙眼种质资源的ISSR分析

采用ISSR分子标记技术对51份龙眼种质资源进行遗传多样性和聚类分析.从100条内部简单重复序列(ISSR)引物中筛选出12条多态性好的引物,共扩增出110个可重复多态性位点,多态性条带比例为64.1%.聚类结果将51份样品分为中国龙眼和泰国龙眼两大品种群,其中的中国龙眼品种群分为7组.结果表明,龙眼种质资源具有遗传多样性.     

甘薯种质资源遗传多样性的ISSR分析

【目的】明确保存的甘薯种质资源的遗传背景,为甘薯杂交育种提供理论依据。【方法】应用ISSR分子标记技术,对34份甘薯种质资源进行了遗传多样性分析。【结果】15个ISSR引物在34份甘薯种质材料中共扩增出2 187条带,其中多态性带有1 099条,平均每个引物扩增出73.27条多态性带,多态性百分率为50.25%;聚类分析将34份甘薯种质材料划分为4大类。【结论】明确了具有代表性的甘薯种质材料的遗传背景,为今后甘薯杂交育种提供了初步理论依据。     

亚麻ISSR的反应体系优化及引物筛选

对亚麻ISSR反应条件进行了优化。同时利用3个有代表性的亚麻样品从60条ISSR引物中筛选出13条多态性好、重复性高的引物,为亚麻的分子鉴定奠定了基础。     

早熟马铃薯 ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为得出马铃薯ISSR-PCR最佳的反应体系,采用正交试验设计,对rTaq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs和引物进行5因素4水平筛选.结果表明,马铃薯ISSR-PCR的最佳反应体系为:总体积25 μL的反应体系中含有rTaq DNA聚合酶0.5 U、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、模板DNA用量为75 ng、dNTPs浓度为200 μmol/L、引物浓度为0.8 μmol/L.这些因素对PCR反应的影响大小顺序为Mg2+浓度＞rTaq DNA聚合酶用量＞dNTPs浓度=引物浓度＞模板DNA用量.应用该最佳反应体系对39条ISSR引物进行筛选,得出15条条带清晰、条带数多、重复性好的引物.并通过退火温度梯度试验得出筛选引物的最佳退火温度.     

果梅种质资源亲缘关系的ISSR分析

利用ISSR技术分析39份果梅种质资源多样性和亲缘关系。结果表明,从51条引物中筛选出10条分辨率强的引物,共扩增出120个位点,平均每个引物扩增出12个位点,最多为16（UBC834）,最少为10（UBC857）,其中,多态性条带98条,多态性比率（PPB）为81．67％,表明ISSR标记在检测果梅基因组遗传多态性上有较显著的检出效率。DNA片段大小分布在0．2～3．0kb。基于各材料的Jaccard系数,利用UPGMA法进行聚类分析构建亲缘关系树状图。各材料之间的亲缘关系较复杂,并非平行分化的关系。39份供试材料的相似系数为0．5263～0．9910,其中,相似系数最大的为浙江的白毛和肖山选,达0．9910,属于青梅类,表明两者的亲缘关系最近;相似系数最小的为广东的矮白梅和湖南的红梅二号,仅为0．5263,表明两者的遗传差异较大。以0．65为阈值将39份材料分为3个类,第1类为矮白梅一个品种,该品种因其树形矮化,适熟时果皮呈均匀的浅绿色,无红晕,梅果含酸量高等特征独立于其他品种之外,可能是一份比较特殊的种质资源;第Ⅱ类包括4个品种,自毛、肖山选、红梅2号和木瓜梅,其余的34个品种为第Ⅲ类。在第Ⅲ类的34个品种中,以0．71水平值又可以分为5个亚类,第1亚类（ⅢA）包括21个品种,可再分成5个组：第1组（a）包括大叶青、桐绿四号、石庵白粒圆、三排早、中脂梅、核梅、腊梅、新白梅等8个品种,除中脂梅和腊梅外,其余的6个品种属于青梅类;第2组（b）包括软枝大粒梅、大沛梅2号、大青梅、三排选一、山溪选一、软枝乌叶梅、大沛梅10号和白粉梅等8个品种,除三排选一、山溪选一属于青梅类外,其余的6个品种属于红梅类;第3组（c）包括竹梅和沙梅;第4组（d）包括白梅和桃梅,都属于红梅类;第5组（e）包括1个品种,沅江青梅。第2亚类（ⅢB）包括9个品种,皇后梅、胭腊梅、青水梅、大横核、横核、天水梅、双水梅、白头鹰和红面梅,除皇后梅、胭腊梅、红面梅属于红梅类,其余的6个品种属于青梅类。第3亚类为（ⅢC）大核青。第4亚类（Ⅲp）为鸳鸯梅和红花梅。第5亚类（ⅢE）是李梅。供试材料间的聚类结果与传统园艺学分类基本一致,表明供试材料间的聚类与地域无明显相关性。     

果梅种质资源亲缘关系的ISSR分析

利用ISSR技术对39份果梅种质资源多样性和亲缘关系分析,结果表明,从51条引物中筛选出10条分辨率强的引物,共扩增出120个位点,其中,多态性位点98个,约占总数的81．67％。基于Jaccard系数对ISSR扩增结果进行UPGMA法聚类,聚类结果将供试材料分成3类,与传统园艺学分类基本一致,表明供试材料间的聚类与地域无明显相关性。