小豆SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为探索适宜小豆SSR-PCR反应的最佳条件以筛选具有多态性的SSR引物,采用L16(45)正交设计优化影响小豆SSR-PCR反应的5个因素(Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、Taq用量、引物浓度、模板DNA用量),利用优化后的SSR-PCR体系,以10份小豆种质为模板,对80对小豆(50对)和绿豆(30对)的SSR引物进行多态性筛选,得出小豆SSR-PCR的最佳反应体系(20μL):Mg~(2+)浓度2.5 mmol/L,dNTPs浓度1.0 mmol/L,Taq活性1.5 U,引物浓度0.6μmol/L,模板DNA用量30 ng。利用优化后的体系在小豆和绿豆引物中筛选出31对条带清晰、多态性丰富、重复性好的SSR引物,有效扩增率为38.75%。小豆SSR-PCR优化体系的建立及多态性引物的筛选为进一步开展小豆遗传育种研究奠定了基础,为小豆遗传多样性分析和遗传图谱库构建等研究提供了技术参数和理论依据。     

利用正交试验设计优化桂花的SSR-PCR体系

以潢川金桂DNA为SSR-PCR扩增模板,采用L_(16)(4~5)正交设计对Taq酶用量、Mg~(2+)浓度、模板DNA用量、dNTPs浓度以及引物浓度在4个水平上进行了优化,建立了桂花SSR-PCR反应的最佳体系,即在10μL反应体系中,不同成分的最佳含量为Taq酶0.2 U、Mg~(2+)3.0 mmol/L、模板DNA 40 ng、dNTPs 0.60 mmol/L、引物0.8μmol/L。应用最佳体系对引物Of P50进行退火温度的优化,得到最适退火温度范围为60~62℃。     

玉米自交系SSR技术反应体系的优化

以玉米自交系为材料,研究了PCR反应体系的Mg(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、模板DNA浓度及退火温度对玉米自交系SSR扩增结果的影响,确定适合玉米自交系SSR分子标记研究的优化体系.最终确定总反应体系为20μmol/L,Mg(2+)浓度3.0mmol/L、dNTPs 0.1mmol/L、引物0.45μmol/L、Taq DNA聚合酶0.4U、模板DNA 50ng.PCR扩增条件:94℃预变性5 min;94℃ 45s,56℃ 45s,72℃ 1 min,35个循环;最后72℃5 min.     

玉叶金花SSR-PCR体系的优化

[目的]优化玉叶金花SSR-PCR扩增反应体系。[方法]以红纸扇为材料,采用正交设计和单因素试验方法,从Mg~(2+)、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度以及退火温度4个方面对玉叶金花SSR-PCR体系进行优化,并采用4对SSR引物和4种玉叶金花植物样品进行验证。[结果]玉叶金花20μL的SSR-PCR反应最优体系为Mg~(2+)浓度1.50 mmol/L、d NTPs浓度0.150 mmol/L、引物浓度0.45μmol/L、TaqDNA聚合酶2.00 U、模板DNA 15 ng、退火温度53.4℃。[结论]该反应体系的扩增条带清晰、稳定、重复性好,可用于玉叶金花的SSR分子标记开发、物种分子鉴定、遗传多样性分析和谱系关系构建等相关研究。     

椰子SSR-PCR反应体系的优化

为进一步开发利用椰子种质资源和开展分子标记辅助幼苗早期筛选及遗传育种工作,采用L_9(3~4)正交试验设计,探索了椰子SSR-PCR的最佳反应体系。通过对模板DNA、Mg~(2+)、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度的筛选优化,建立了椰子SSR-PCR最佳反应体系(10μL)为:模板DNA 60 ng、Mg~(2+)2.5 mmol/L、dNTP 250μmol/L、Taq酶0.5μmol、引物0.5μmol/L、退火温度58℃,在该体系条件下,PCR扩增条带最为清晰,该反应体系的优化,为今后应用SSR标记技术为椰子群体结构分析、种质资源丰富度、基因定位和遗传育种等研究奠定工作基础。     

柽柳cpSSR-PCR反应体系的建立和优化

[目的]建立并优化柽柳cpSSR-PCR反应体系和反应条件。[方法]对影响PCR反应的5个变量(Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度)进行L_(16)(4~5)正交试验设计,并对引物退火温度进行梯度筛选。[结果]最优反应体系:Mg~(2+) 2.0 mmol/L、dNTPs 0.125 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.25 U、引物0.25μmol/L、模板DNA 20 ng,共10μL。反应程序:94℃预变性4 min;94℃30 s,引物退火温度30 s,72℃30 s,30个循环;72℃延伸10 min。[结论]该反应体系成功扩增1个柽柳天然群体的23个个体,为柽柳群体扩散路线的确定奠定基础。     

绿豆SSR-PCR反应体系的建立与优化

为探究影响绿豆SSR-PCR反应的因素,建立绿豆SSR-PCR最佳反应体系,为绿豆遗传多样性分析、品种鉴定等提供参考。采用正交设计与单因素试验联合分析法,从Mg~(2+)、Taq酶、引物、d NTPs及模板DNA 5个因素对绿豆SSR-PCR反应体系进行优化分析。5个因素中,Mg~(2+)对SSR-PCR结果影响最大。SSR-PCR反应最佳体系为20μL体系中含0.8 mmol/L Mg~(2+)、1.25 U Taq酶、1.4μmol/L引物、1.8 mmol/L d NTPs、25 ng模板DNA。该绿豆SSR-PCR反应体系的建立为进一步利用SSR分子标记技术研究绿豆资源奠定了基础。     

小桐子SSR-PCR反应体系的优化

采用改良的CTAB法从小桐子嫩叶中提取基因组DNA,通过琼脂糖凝胶电泳和SSR-PCR扩增检测,结果表明,改良CTAB法提取的小桐子基因组DNA完整性好,纯度较高,可作为SSR分子标记的模板。同时,对影响小桐子SSR-PCR扩增的d NTPs、Taq DNA聚合酶、引物及Mg2+浓度等4个因素进行了优化,优化后的小桐子SSR-PCR扩增的最佳反应体系为:在20μL的反应体系中含有模板DNA 100 ng,d NTPs 0.2 mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶100 U·m L~(-1),引物0.6μmol·L~(-1),Mg~(2+)1.5 mmol·L~(-1)。适宜的扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃变性1 min,51~53℃(退火温度随引物不同而改变)退火1 min,72℃延伸2 min,35个循环;72℃延伸10 min。     

桑树SSR-PCR反应体系的优化

为了建立经济稳定的桑树简单重复序列(SSR)-PCR反应体系,为SSR分子标记在桑树研究中更广泛地应用提供试验基础,采用L_(16)(4~5)正交试验设计和单因素试验,对桑树SSR-PCR反应体系中的模板DNA浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度和rTaq酶用量5个因素的4个水平进行优化分析,并比较这5个因素的不同浓度对扩增效果的影响。结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为Mg~(2+)、dNTPs引物模板DNArTaq酶。研究最终确立了最佳反应体系,即在10μL反应体系中,含有1.5μL 10～20 ng/μL DNA模板、0.4μL 25 mmol/L Mg~(2+)、0.5μL 2 mmol/L dNTPs、各0.15μL 20μmol/L正反向引物、0.1μL 5 U/μL rTaq酶和1μL 10×loading buffer。通过稳定性检测,表明该体系能够用于桑树的SSR分析。     

木槿ISSR-PCR反应体系的建立及优化

建立木槿ISSR-PCR反应体系,为木槿种质资源的创新与鉴定提供理论基础。采用正交试验法,对影响PCR结果的Taq酶用量、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、模板DNA用量及引物浓度5个因素进行分析,采用单因素试验对退火温度进行筛选,并利用最佳体系对24个木槿品种进行扩增验证。结果表明,最优反应体系(25μL)中,含10×buffer(Mg~(2+) free) 2.5μL、Taq酶0.75 U、Mg~(2+) 2.0 mmol/L、dNTPs 0.10 mmol/L、模板DNA 100 ng、引物0.5μmol/L。PCR反应程序为94℃预变性2 min;94℃变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,34个循环;72℃延伸6 min,4℃保温。建立的体系对24个木槿品种能够扩增出清晰稳定、无拖带、多态性高的条带。     

褐苞薯蓣ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过单因素考察结合正交试验的方法,基于反应体系中Taq DNA聚合酶量、DNA模板用量、dNTPs浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度等因素对简单重复序列间扩增(ISSR)反应体系进行优化。结果表明,褐苞薯蓣ISSR-PCR的20μL最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1. 875 U,DNA模板量52. 5 ng,d NTPs浓度0. 25 mmol/L,引物浓度0. 437 5μmol/L,Mg~(2+)浓度1. 5 mmol/L,10×Taq Buffer 2. 0μL,其余用dd H_2O补齐。     

濒危植物蒙古扁桃ISSR反应体系优化

为利用简单重复序列区间(inter simple sequence repeat,简称ISSR)技术研究蒙古扁桃资源遗传多样性评价和种质资源鉴定,利用正交试验法进行L_(16)(4~5)正交设计,从Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶活性和模板DNA质量5种因素和4个浓度水平来优化蒙古扁桃ISSR-PCR反应体系。结果表明,最佳反应体系如下:在25μL反应体系中加入2.0 U Taq聚合酶,引物浓度0.80μmol/L,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,dNTPs浓度0.25 mmol/L,模板DNA质量50 ng。对蒙古扁桃ISSR-PCR反应影响程度排序依次为Taq聚合酶活性引物浓度Mg~(2+)浓度dNTPs浓度模板DNA质量。     

椰子SSR-PCR反应体系的优化

为进一步开发利用椰子种质资源和开展分子标记辅助幼苗早期筛选及遗传育种工作,采用L_9(3⁴)正交试验设计,探索了椰子SSR-PCR的最佳反应体系。通过对模板DNA、Mg4)正交试验设计,探索了椰子SSR-PCR的最佳反应体系。通过对模板DNA、Mg⁽²⁺⁾、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度的筛选优化,建立了椰子SSR-PCR最佳反应体系(10μL)为:模板DNA 60 ng、Mg(2+)、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度的筛选优化,建立了椰子SSR-PCR最佳反应体系(10μL)为:模板DNA 60 ng、Mg⁽²⁺⁾2.5 mmol/L、dNTP 250μmol/L、Taq酶0.5μmol、引物0.5μmol/L、退火温度58℃,在该体系条件下,PCR扩增条带最为清晰,该反应体系的优化,为今后应用SSR标记技术为椰子群体结构分析、种质资源丰富度、基因定位和遗传育种等研究奠定工作基础。     

春兰SRAP-PCR反应体系的建立与优化

[目的]构建适合春兰SRAP-PCR反应的最佳体系。[方法]对影响PCR反应的5个变量(dNTPs浓度、Mg~(2+)浓度、引物浓度、Taq酶量、模板DNA用量)采用L16(45)正交试验设计,建立春兰SRAP-PCR最适反应体系。[结果]最佳优化体系为0.25 mmol/L d NTPs、2.50 mmol/L Mg~(~(2+))、0.80μmol/L引物、1.00 U Taq酶、200.00 ng模板DNA,共20μL。扩增程序:94℃预变性4 min,反应前5个循环在94℃变性1 min、35℃复性1 min、72℃延伸1 min的条件下运行,随后的30个循环复性温度提高至50℃,最后72℃延伸10 min。[结论]该体系有利于SRAP分子标记在春兰材料上的应用,为春兰分子遗传育种奠定了基础。     

药用植物苦参SSR-PCR体系的优化与验证

为有效利用SSR-PCR技术对药用植物苦参进行遗传多样性分析,采用正交设计L16(45)对影响苦参SSRPCR体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化,PCR结果用DPS数据处理软件分析,筛选出各因素的最佳水平,建立适宜苦参SSR-PCR的反应体系和扩增程序,并选用内蒙古苦参对该体系进行稳定性验证。结果表明:在10μL的苦参SSR-PCR体系中,模板DNA的用量为20.0ng,Taq DNA聚合酶的用量为0.2~0.6U,Mg2+的浓度为2.5mmol/L,dNTPs浓度为0.1mmol/L,引物的浓度为0.6μmol/L。扩增程序为:94℃预变性3min;94℃变性1min,56℃退火45s,72℃1min,35个循环;72℃延伸10min。4℃保存。选用12份苦参DNA对该体系进行稳定性验证,该体系具有较高的扩增稳定性,可用于药用植物苦参SSR标记的研究。     

水稻SSR-PCR技术反应体系的优化

以水稻为材料,研究了SSR-PCR反应体系中Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA浓度时水稻SSR扩增效果的影响.结果表明,在试验设计范围内,Mg2+和dNTP浓度对扩增影响较大,引物浓度在1.6～3.0μmol·L-1范围内对扩增影响较小,TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度对扩增影响也很小.确定的最佳反应体系为20μL,Mg2+浓度为1.75 mmol·L-1、dNTPs为0.20 mmol·L-1、引物为2.4 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶为0.75U、模扳DNA为45ng.     

濒危植物蒙古扁桃SRAP反应体系优化

为利用SRAP技术研究蒙古扁桃资源遗传多样性评价和种质资源鉴定,利用正交试验法L_(16)(4~5)正交设计,对影响蒙古扁桃SRAP-PCR反应体系的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度4个因素以及模板DNA浓度进行筛选。优化的蒙古扁桃SRAP-PCR最佳反应体系为Mg~(2+)浓度为2.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.25 mmol/L,模板DNA浓度为100 ng,Taq酶浓度为2.00 U,引物浓度1.0μmol/L,2.5μL 10×PCR buffer,总体积为25μL。筛选结果表明,对蒙古扁桃SRAP-PCR扩增结果影响最大的是Taq聚合酶浓度,最小的是dNTPs浓度。运用该体系对144个随机SRAP引物组合进行筛选,筛选出12个条带清晰、多态性高的引物组合,为蒙古扁桃种质资源的研究奠定了基础。     

思茅松SSR-PCR反应体系优化研究

以思茅松杂交亲本JG1号基因组DNA为模板,利用正交设计实验对影响SSR-PCR反应体系的主要因子进行了优化,建立了一套最佳思茅松SSR-PCR反应体系。结果表明:在25μL最佳反应体系中,各组分最佳含量分别为Mg~(2+) 2.0 mmol/L、DNA 60 ng、引物0.50μmol/L、Taq DNA聚合酶0.25U、dNTP 0.20 mmol/L。利用11份个体对此SSR反应体系进行验证,获得扩增谱带清晰且多态性较好,证明该体系稳定可靠。     

珍稀保护竹种筇竹SSR反应体系的优化

为建立高效的筇竹SSR反应体系,以筇竹新鲜幼嫩叶片提取的基因组DNA为模板,研究了影响SSR反应效果的因素,包括Taq酶、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA浓度等,建立了适合筇竹SSR反应的PCR体系,即20 μL反应体系中含有Taq酶0.8 U,Mg2+为1.5 mmol·L-1,dNTP 0.2 mmol·L-1,引物 0.25 μmol·L-1,模板DNA 60 ng.扩增程序为:94 ℃ 3 min,然后94 ℃ 40 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,30 个循环,72 ℃延伸5 min,4 ℃保存.     

普通菜豆SSR反应条件的优化

在作物育种中,SSR是主要农艺性状分子标记及标记辅助育种的一项重要技术。以紫花、八月绿、将军、73-8、96-9、9z622等6个普通菜豆品种为试材,采用改良的SDS法提取了高质量的基因组DNA。为建立适宜的SSR反应体系,对影响SSR-PCR扩增的模板DNA浓度、Mg~(2+)的用量、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等因素进行了优化。结果表明,在25μLPCR反应体系中,DNA模板的最适浓度为0.8ng·μL~(-1),Mg~(2+)的优化浓度为1.5mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶的最适浓度为0.05μmol·(μL·min)~(-1),dNTPs的最适浓度为0.2mmol·L~(-1)。