黄鳝Ⅰ型hepcidin抗菌肽基因的诱导表达分析

采用RT-PCR的方法对健康黄鳝(Monopterus albus)不同组织Ⅰ型抗菌肽hepcidin基因的表达情况及受脂多糖(LPS)注射、嗜水气单胞菌感染后该基因的表达情况进行了分析。结果表明:在正常黄鳝各组织中,该基因在肝脏中表达量最高,其次是肾脏,在心脏、皮肤、脑、血液、小肠、脾脏和胃中的表达量较低,而在肌肉中没有检测到该基因的转录本;LPS注射24h后,各组织里的hepcidin基因表达量都有明显升高;当受到病原菌感染后,在所检测的肝脏、肾脏、皮肤、脑、心脏和脾脏等6个组织中该基因的转录本都在感染后24h后急剧上升。这些结果表明黄鳝的Ⅰ型抗菌肽hepcidin基因可能在黄鳝抵抗外界病原物侵染过程中起着重要作用。     

嗜水气单胞菌对黄鳝血清中四种抗病相关酶活性的影响

为了研究嗜水气单胞菌感染对黄鳝非特异性免疫和抗氧化功能的影响,将60尾黄鳝平均分成4组(对照组,处理组Ⅰ、处理组Ⅱ、处理组Ⅲ),处理组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别腹腔注射浓度为1×108cfu/ml、2×108cfu/ml、4×108cfu/ml的嗜水气单胞菌菌液,对照组注射等浓度生理盐水,测定各组在感染菌后12 h、24 h、48 h血清中溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、总超氧化物歧化酶等四种酶活性。结果显示,在感染初期,与对照组相比,各处理组四种酶活力有不同程度的升高;处理组Ⅱ和处理组Ⅲ的溶菌酶有先升高后降低的趋势;酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力在48 h内总体上持续升高,但在后期升高不明显,酸性磷酸酶活力有下降的趋势;总超氧化物歧化酶处理组Ⅲ则呈现先升高后降低的趋势。结果表明,在感染嗜水气单胞菌初期,黄鳝非特异性免疫相关酶活力随菌液浓度升高而升高;而在感染后期酶活力下降。     

感染后暗纹东方鲀补体组分C3、C4表达分析

通过用不同浓度(0、1×106、2×106、4×106CFU/ml)的嗜水气单胞菌感染暗纹东方鲀,利用RT-PCR技术检测感染后不同时间肝脏以及不同组织补体组分C3和C4的表达量,以了解和比较补体组分C3和C4在鱼体正常和患病状态以及感染后不同时间、不同组织内的表达差异。结果表明,补体组分C3的表达量在用2×106CFU/ml嗜水气单胞菌感染9 h时达到最大,补体组分C4表达量在用4×106CFU/ml嗜水气单胞菌感染10 h时最大;在不同组织中补体组分C3和C4均是在肝脏中的表达量最大。由此可见,补体组分C3和C4在介导病原体清除及创伤修复过程中起着重要作用。     

感染后暗纹东方纯补体组分C3、C4表达分析

通过用不同浓度(0、1×106、2×106、4×106 CFU/ml)的嗜水气单胞菌感染暗纹东方纯,利用RT-PCR技术检测感染后不同时间肝脏以及不同组织补体组分C3和C4的表达量,以了解和比较补体组分C3和C4在鱼体正常和患病状态以及感染后不同时间、不同组织内的表达差异.结果表明,补体组分c3的表达量在用2×106CFU/ml嗜水气单胞菌感染9 h时达到最大,补体组分C4表达量在用4×106 CFU/ml嗜水气单胞菌感染10 h时最大;在不同组织中补体组分C3和C4均是在肝脏中的表达量最大.由此可见,补体组分C3和C4在介导病原体清除及创伤修复过程中起着重要作用.     

感染异育银鲫补体组分C3·C4表达研究

[目的]了解补体组分在感染性鱼类疾病中的作用,为鱼类疾病的诊断和治疗提供参考。[方法]采用不同浓度(2×106、4×106CFU/ml)的嗜水气单胞菌感染异育银鲫,利用半定量RT-PCR技术检测感染不同时间后肝脏中补体组分C3和C4的表达量。[结果]感染后4、5 h时,异育银鲫肝脏中C3的表达量均显著高于对照组。在感染后4 h时,不同浓度组之间C3的表达量无显著差异。而在感染后5 h时,感染浓度1组(注射2×106 CFU/ml嗜水气单胞菌)中C3的表达量显著高于感染浓度2组(注射4×106 CFU/ml嗜水气单胞菌)。异育银鲫肝脏中C4的表达水平远低于C3。在感染后5 h时,感染浓度1组C4的表达量显著高于对照组,其余处理组与对照组均无显著差异。[结论]补体组分C3在鱼类免疫防御系统中具有非常重要的意义。     

碳酸氢钠对嗜水气单胞菌致病性及其主要毒力相关基因表达的影响

为探讨碳酸氢钠对嗜水气单胞菌毒力基因表达的影响,利用荧光定量PCR技术,以未添加碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为对照组,添加0.024、0.048、0.072、0.096和0.120 mol/L碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为实验组,对嗜水气单胞菌的3个主要毒力基因——溶血素基因(AHH-1)、气溶素基因(Aer A)和弹性蛋白酶基因(ahyB)进行相对表达分析。结果表明,5个实验组嗜水气单胞菌的AHH-1、AerA和ahyB表达量均显著低于对照组。且随着碳酸氢钠浓度的增加,基因表达呈逐渐下调趋势。人工感染结果表明,添加碳酸氢钠培养的嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量明显比对照组高,而且随着碳酸氢钠浓度的增加,嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量呈现逐渐加大的趋势,表明毒力逐渐减小。     

大鲵抗菌肽基因KK1/KK5/KK8对嗜水气单胞菌的侵染响应

【目的】探究大鲵(Andrias davidianus)抗菌肽家族基因对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)侵染的响应,为揭示抗菌肽家族基因的功能提供理论依据。【方法】通过腹腔注射嗜水气单胞菌感染大鲵后,采用Trizol提取组织总RNA,反转录合成cDNA,再以实时荧光定量PCR(qPCR)分析抗菌肽家族3个基因(KK1、KK5和KK8)在大鲵皮肤和肝脏器官的表达响应情况。【结果】经腹腔注射嗜水气单胞菌后,抗菌肽基因KK1、KK5和KK8在大鲵皮肤组织中的相对表达量在攻毒后12~36 h均显著高于注射PBS的对照组(P0.05,下同);而在肝脏组织中,抗菌肽基因KK1、KK5和KK8的相对表达量分别在攻毒后24、12和24 h时显著高于对照组,其他时间点均低于对照组,说明这3个抗菌肽基因在早期积极响应嗜水气单胞菌的侵染,但相对于皮肤组织,其高表达量持续时间较短。【结论】抗菌肽家族基因KK1/KK5/KK8在嗜水气单胞菌侵染大鲵时积极作出应答,尤其在皮肤组织中的特异表达对启动机体天然免疫应答抵抗病原微生物感染具有重要作用。     

孟加拉进口黄鳝中致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定

[目的]了解致病性啫水气单胞菌的存在状况和风险水平。[方法]采用分离培养、生化鉴定、序列测定和动物试验等方法,对2批孟加拉进口黄鳝进行致病性啫水气单胞菌检测。[结果]从孟加拉进口黄鳝体内分离出4株高度致病性的嗜水气单胞菌。嗜水气单胞菌对孟加拉黄鳝本身致病性不明显,但是对小鼠的致病性却高达10 000~100 000 CFU/ml。[结论]孟加拉进口黄鳝存在致病性啫水气单胞菌的感染,且对我国的食品和卫生安全存在一定的风险。     

孟加拉进口黄鳝中致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定

[目的]了解致病性睹水气单胞菌的存在状况和风险水平.[方法]采用分离培养、生化鉴定、序列测定和动物试验等方法,对2批孟加拉进口黄鳝进行致病性睹水气单胞菌检测.[结果]从孟加拉进口黄鳝体内分离出4株高度致病性的嗜水气单胞菌.嗜水气单胞菌对孟加拉黄鳝本身致病性不明显,但是对小鼠的致病性却高达10 000～ 100 000 CFU/ml.[结论]孟加拉进口黄鳝存在致病性睹水气单胞菌的感染,且对我国的食品和卫生安全存在一定的风险.     

斑点叉尾鮰败血症3种病原多重PCR检测方法的建立

【目的】建立可同时快速检测斑点叉尾鮰败血症3种病原(嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌)的多重PCR检测方法。【方法】根据嗜水气单胞菌溶血素基因(Hly)、维氏气单胞菌脱氧核糖核酸酶Ⅰ基因(DNaseⅠ)以及鮰爱德华菌溶血活化基因(Eha)的保守序列,设计3对特异性引物,优化并建立斑点叉尾鮰败血症3种主要病原菌的多重PCR方法,对其特异性和灵敏度进行考察,并将其用于临床样品的检测。【结果】建立的多重PCR方法,当Hly基因、DNaseⅠ基因以及Eha基因的引物浓度分别为1.0,1.0和0.5μmol/L,退火温度为59.5℃时,各目的片段均可较好地扩增。特异性试验结果表明,建立的多重PCR方法可从嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌分别扩增出1 091,262和450bp的目的片段,从多种细菌DNA的混合种也可扩增出上述目的片段,而对其他对照组的扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,建立的多重PCR最低可分别检测出200CFU/mL的嗜水气单胞菌、300CFU/mL的维氏气单胞菌和200CFU/mL的鮰爱德华菌;对临床样本的检出率为100%,与传统生物学检测结果的符合率为100%。【结论】建立的多重PCR检测方法特异、灵敏、快速,可单独或同时检测斑点叉尾鮰败血症嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌3种主要病原菌,也可以用于其他水生动物上嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌的检测。     

人工感染嗜水气单胞菌对黄鳝血细胞的影响

用不同浓度嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染健康黄鳝(Monopterus albus),采用血细胞计数、血涂片及显微测量等方法分别测定感染24 h、48 h、72 h后各组黄鳝血细胞数量,红细胞长、短径。结果表明:随着处理组菌浓度增加,感染24 h的黄鳝红细胞浓度逐渐减小,感染48h和72h的呈先增大后减小的变化趋势,但各处理组差异不显著;感染后白细胞中主要是嗜中性粒细胞、单核细胞核淋巴细胞在血细胞中所占百分比显著升高。     

团头鲂补体因子Bf/C2的克隆和表达分析

为探索团头鲂(Megalobrama amblycephala)补体因子Bf和C2(complement factor B/C2,Bf/C2)的可能功能,在转录组数据基础上,采用RT-PCR克隆得到Bf/C2A和Bf/C2B基因的cDNA序列;采用荧光实时定量PCR技术检测了两基因在团头鲂早期发育过程、健康成鱼及感染嗜水气单胞菌后各组织中的表达变化。结果显示,Bf/C2AcDNA全长2 520bp,包含5′UTR 42bp、ORF 2 298bp、3′UTR 180bp,编码765个氨基酸。Bf/C2B基因ORF全长2 130bp,编码710个氨基酸。两基因的氨基酸序列分别与鲤B/C2-A2及草鱼Bf/C2B相似性最高。在早期发育阶段Bf/C2A和Bf/C2B均在在出膜后1d表达量最高,肠管形成期次之,其他时期的表达量相对较低;两基因在健康成鱼10个组织中均有表达,肝脏中表达量最高,肾脏、头肾、脾脏次之,其他组织表达量相对较低;在嗜水气单胞菌感染后,两基因在免疫相关组织如肝脏和脾脏中的表达均显著上升。上述结果表明Bf/C2在应对细菌感染的免疫过程中发挥着重要的作用。     

连翘酯苷A对嗜水气单胞菌耐恩诺沙星的延缓效果及其外排作用

[目的]明确连翘有效成分延缓嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对恩诺沙星的耐药性及其对药物主动外排作用中耐药节结化细胞分化家族(RND)相关基因表达的影响,为明确连翘延缓氟喹诺酮类药物耐药性的有效成分及揭示其延缓机制提供参考依据.[方法]观测连翘提取液及其与恩诺沙星联合作用对嗜水气单胞菌耐药菌株生长的影响,测定连翘有效成分(连翘苷、连翘酯苷A和连翘酯苷B)作用于嗜水气单胞菌前后的最小抑菌浓度(MIC),并利用实时荧光定量PCR检测连翘脂苷A作用于嗜水气单胞菌耐药菌株后RND相关基因(aheA、aheB和aheC)的表达变化.[结果]连翘提取液与64μg/mL恩诺沙星联合作用下,连翘提取液对嗜水气单胞菌耐药菌株的MIC为3.12μg/mL;在MIC和2MIC的条件下,连翘提取液与恩诺沙星联合作用能有效抑制嗜水气单胞菌耐药菌株的生长,24 h内未见明显的生长趋势.连翘的3种有效成分对嗜水气单胞菌耐药菌株均表现出抑制作用,在1.00μg/mL浓度条件下,连翘脂苷A的整体抑制效果较连翘苷和连翘脂苷B的效果更好.以1.00μg/mL连翘脂苷A作用于嗜水气单胞菌耐药菌株后,aheA、aheB和aheC基因均呈不同程度的下调表达,其中aheA基因的相对表达量较连翘脂苷A作用前显著下降(P<0.05).[结论]连翘提取液与适宜浓度的恩诺沙星联合使用对嗜水气单胞菌有明显抑制效果,同时能延缓嗜水气单胞菌的耐药性,其中又以连翘脂苷A对RND主动外排系统的抑制作用最明显.     

黄鳝主要组织相容性复合体Iα基因的克隆及多态性分析

通过同源克隆,结合RACE技术,从黄鳝肝脏c DNA中分离得到了MHC Iα基因的全长c DNA序列。结果表明:黄鳝MHC Iα基因c DNA全长1 731 bp,5′UTR长78 bp,3′UTR长600 bp,编码1条350个氨基酸的多肽;与其他鱼类不同,黄鳝Iα基因只具有4个外显子和3个内含子。二级结构分析结果表明,该基因具有MHC Iα基因的典型特征和保守区域。实时荧光定量PCR检测结果表明:黄鳝MHC Iα基因在不同组织中表达量的差别较大;嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)感染可显著影响黄鳝肝脏、肾脏和脾脏MHC Iα基因的表达。对42个个体MHC Iα基因外显子3序列的测定结果表明,42个个体共分离到50个等位基因,每个个体包含1~6个等位基因,推测黄鳝具有至少3个Iα基因座位;等位基因PBR位点和非PBR位点的dN值均显著大于dS(P0.05),提示黄鳝Iα基因曾经历过强烈的正选择作用。     

溶血性嗜水气单胞菌XF-6的分离鉴定及其对鲥鱼机体免疫功能的影响

【目的】本文研究了湖北省武汉市一些养殖场鲥鱼发病原因以及致病菌对其免疫因子的影响。【方法】采用划线培养方法对染病鲥鱼进行了病原菌分离鉴定,从其肝脏中分离得到病原菌XF-6,经VITEK-32全自动细菌分析仪鉴定,为嗜水气单胞菌。用多重PCR方法确认嗜水气单胞菌XF-6属于溶血性嗜水气单胞菌,含有气溶素基因(aer A)和溶血素基因(ahh1)。同时研究了嗜水气单胞菌XF-6侵染对鲥鱼机体免疫功能的影响,通过腹腔注射嗜水气单胞菌XF-6,在侵染后不同时间点采集鲥鱼的血液和肝脏,分别采用分光光度计法和ICP-AES法检测血清和肝脏铁浓度,运用实时荧光定量PCR法对铁调素基因(hepc)、白细胞介素基因(il-6)、JAK3/STAT3信号通路的酪氨酸激酶3基因(jak3)、信号转导和转录激活因子3基因(stat3)的表达量进行检测。【结果】侵染嗜水气单胞菌XF-6后,鲥鱼血清中铁浓度明显降低,在12、24、48 h时显著低于对照组;血清中总铁结合力有所上升,但没有达到显著水平;肝脏中铁浓度相对于对照组没有达到显著性差异水平,但仍有升高。肝脏中hepc基因的表达量在6、12、24 h时显著上升;肝脏中il-6基因的表达量在12、24、48 h时显著上升、肝脏中jak3基因的表达量在12、24 h时显著上升,肝脏中stat3基因的表达量在6、12、24 h时显著上升。这4种基因表达量随后有所下降,但各时间点的表达量均高于对照。【结论】鲥鱼机体通过调节铁调素基因(hepc)、白细胞介素基因(il-6)、JAK3/STAT3信号通路的酪氨酸激酶3基因(jak3)、信号转导和转录激活因子3基因(stat3)等铁相关基因的表达,进而降低自身游离铁浓度和增加储存铁浓度来应对病原菌的侵染。     

鲤鱼源嗜水气单胞菌FAH5分离鉴定及其对寄主感染的解剖病理学研究

【目的】对具有典型溶血性病征的染病鲤鱼进行病原菌分离纯化鉴定,并研究其对寄主感染的解剖病理学特征。【方法】采用营养琼脂平板划线方法从染病鲤鱼肝脏样本中分离得到病原菌菌株FAH5,使用VITEK-32全自动细菌分析仪进行其生理生化特性探讨,初步鉴定为嗜水气单胞菌。然后,采用嗜水气单胞菌FAH5人工感染健康鲤鱼,并通过解剖分析其器官病变情况。【结果】感染嗜水气单胞菌FAH5后,鲤鱼体表粘液增加,分泌物增多,鳍部和腹部泛红,鳃部出现腐烂现象,并充血发黑。解剖后腹腔和内脏有出血点,肝脏,肾脏,脾脏等器官病理变化以血液循环障碍,血管扩张为主,严重感染时这些器官有充血、出血和溶血现象,活性细胞经感染病变至弥散性坏死。【结论】有溶血性病征的染病鲤鱼分离纯化得到了嗜水气单胞菌FAH5,人工感染健康鲤鱼后出现相同症状,解剖病理学特征为腹腔和内脏有出血点,肝脏,肾脏,脾脏等器官病变以血液循环障碍,血管扩张为主。     

大鲵不同发育阶段及组织中内参基因稳定性评价

【目的】研究18S核糖体RNA(18SrRNA)、延伸因子1-α(EF1-α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(β-actin)和琥珀酸脱氢酶A亚基(SDHA)等5种常见内参基因在大鲵不同组织、不同发育阶段及嗜水气单胞菌感染下的稳定性,为大鲵后基因组学研究提供指导。【方法】采集3龄健康大鲵的肝脏、肠、胃、胰腺、肾脏、肌肉、皮肤、脾脏等组织,3龄、2龄、1龄、9月龄、1周龄健康大鲵的皮肤组织及嗜水气单胞菌感染大鲵后第3,5,7天的皮肤组织,提取其RNA,进行实时荧光定量PCR检测,应用3种内参基因稳定性评价分析工具(geNorm,NormFinder,BestKeeper)分析5种内参基因在大鲵不同组织、不同发育阶段以及不同病理状态下的稳定性。【结果】5种内参基因在大鲵不同组织中表达稳定性较好的是EF1-α和SDHA,而在不同发育阶段及嗜水气单胞菌感染大鲵的皮肤组织中,5种内参基因的表达稳定性不同于在不同组织中的表达,稳定性较好的是EF1-α和GAPDH。【结论】EF1-α表达最为稳定,是大鲵定量PCR首选内参基因,而SDHA、GAPDH以及β-actin表达稳定性受生理状态的影响较大,作为第二内参基因时应视试验目的而定,在不同组织中进行定量PCR比较时应选用SDHA,而在不同生理状态下则应选用GAPDH为第二或备用内参基因。     

红龙鱼源β-溶血性嗜水气单胞菌AH的分离及其对机体铁代谢的影响

对具有典型败血症病症的染病红龙鱼进行病原菌分离鉴定分析。从其肝脏中分离得到病原菌菌株AH,经VITEK-32全自动细菌分析仪鉴定为嗜水气单胞菌。通过多重PCR检测确认该嗜水气单胞菌AH属于β-溶血性嗜水气单胞菌,含有气溶素基因(aer A)和溶血素基因(ahh1)。此外研究嗜水气单胞菌AH侵染红龙鱼后对其机体铁代谢的影响,通过腹腔注射嗜水气单胞菌AH,在侵染后不同时间点收集红龙鱼的血液和肝脏组织,分别采用分光光度计法和电感耦合等离子体原子发射光谱(inductively coupled plasma-atomic emission specrometry,简称ICP-AES)法检测红龙鱼血清和肝脏中的铁含量,同时采用实时荧光定量PCR法对铁调素基因(hepc)、白细胞介素基因(il-6)、JAK/STAT信号通路的蛋白质酪氨酸激酶3基因(jak3)、信号转导子和转录激活因子3基因(stat3)表达量进行检测。结果表明,侵染嗜水气单胞菌AH后,红龙鱼血清中铁浓度明显降低,在24、48h时显著低于对照组,总铁结合力有所上升,但没有达到显著水平;肝脏中铁含量相对于对照组差异没有达到显著水平,但仍有明显升高。肝脏中hepc基因的表达量在一定时间范围内显著上升;il-6、jak3和stat3基因表达量开始均有所上调,随后有所下降,但在各时间点的表达量均高于对照。由结果可知,机体通过调节铁调素基因(hepc)等铁相关基因的表达,进而降低自身游离铁含量,并增加储存铁含量来应对细菌的侵染。     

香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用

为筛选出抗嗜水气单胞菌感染的天然化合物,以嗜水气单胞菌和香叶木素为研究对象,通过最小抑菌浓度测定、生长曲线、溶血试验、免疫印迹、荧光定量PCR和细胞毒性试验研究了香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用。结果发现,对嗜水气单胞菌生长没有影响的香叶木素能在较低浓度下通过抑制气溶素的表达降低共培养物上清液的溶血活性;荧光定量PCR试验发现香叶木素能剂量依赖性地降低气溶素编码基因aerA 的表达。此外,通过活/死细胞染色发现香叶木素可减轻气溶素介导的细胞损伤。以上结果表明,香叶木素通过降低aerA的转录水平降低了嗜水气单胞菌的体外致病力,可作为一种抗嗜水气单胞菌感染的候选药物。     

嗜水气单胞菌感染对团头鲂肝脏铁代谢的影响

为研究细菌感染对鱼类肝脏铁代谢的影响,以团头鲂为研究对象,通过腹腔注射嗜水气单胞菌,在感染后不同时间点取团头鲂的血液和肝脏组织,分别采用分光光度法和ICP法检测血清和肝脏中的铁含量,采用实时荧光定量PCR法对铁代谢调节相关基因——铁调素(hepc)、白细胞介素6(il-6)、JAK/STAT信号通路的蛋白质酪氨酸激酶3(jak3)、信号转导子和转录激活因子3(stat3)等表达量进行检测。结果显示:感染嗜水气单胞菌后,团头鲂血清中铁浓度明显降低,在12、24h时显著低于对照组,总铁结合力有所上升,但没有达到显著水平;肝脏中铁含量相对于对照组虽没有达到显著性差异水平,但仍有明显升高。肝脏中hepc基因的表达量显著上升;il-6、jak3和stat3基因表达量开始均有所上调,随后有所下降,但各时间点的表达量均高于对照。试验结果说明,机体通过调节hepc等铁代谢相关基因的表达,进而降低自身游离铁和增加储存铁来应对病原菌的感染。