一株西瓜专化型尖孢镰刀菌抑制菌的分离鉴定及其抑菌活性

以黑龙江省扎龙自然保护区的植物根际土壤为实验材料,采用对峙实验筛选抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum, FON)的菌株,并采用菌丝生长、孢子萌发和扫描电镜等方法研究其抑菌特性。结果表明,分离获得了一株能抑制FON的菌株MLY01,根据其菌落形态特征和16S rDNA碱基序列同源性结果,鉴定MLY01为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis,将其命名为Bacillus licheniformis MLY01。当培养基与无菌滤液比例为1∶1时,菌丝生长抑制率为71.85%,生物量抑制率为79.55%,36 h孢子萌发抑制率为76.81%。将FON孢子悬液与无菌滤液按1∶1比例混合,培养12 h,孢子数目降低,表面粗糙,菌丝畸形扭曲,表面有多处凹陷。菌株MLY01对FON的生长具有明显的抑制作用,在生物菌剂的研发方面具有潜力。     

农杆菌介导尖孢镰刀菌西瓜专化型转化体系的建立及突变体筛选

以尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)FO-11-06菌株为受体,采用农杆菌介导的遗传转化方法,实现了农杆菌AGL1(含pATMT1)介导的西瓜枯萎病菌的转化,并研究了转化介质和pH值对转化效率的影响。结果表明:在25℃下,采用乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L、农杆菌OD600=0.15、尖孢镰刀菌分生孢子含量为1×106个/mL、pH值为5.1～5.8时可实现T-DNA的插入转化。当转化体系pH值为5.3时,转化效率最高,达到每106个分生孢子产生553个转化子。不同共转化介质对转化效率影响明显,玻璃纸和硝酸纤维素滤膜转化效率较高,每106个分生孢子获得551个和549个转化子,显著高于滤纸。通过转化,获得尖孢镰刀菌西瓜专化型转化子1 989个,对生长速度、菌落颜色和产孢量等性状进行分析,发现有46个性状特异的突变体。研究结果为进一步研究尖孢镰刀菌西瓜专化型的生长发育、致病机制和相关基因的功能奠定了基础。     

外源酚酸对生防细菌拮抗尖孢镰刀菌西瓜专化型的影响

为明确外源酚酸影响下生防细菌对尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)的拮抗作用,在添加不同质量浓度邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸的条件下,通过室内培养试验,定期测量FON和生防细菌菌落的直径,结合对峙培养试验,计算不同外源酚酸影响下生防细菌对FO...     

西瓜专化型尖孢镰刀菌FonSIX6缺失突变体的构建

病原菌和植物相互作用时分泌效应蛋白（effectors）抑制植物的防卫反应。枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的真菌病害,尖孢镰刀菌和寄主相互作用时分泌几个特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白（15.8～29.9 kD）进入木质部启动致病力,称为SIX（secreted in xylem）蛋白,其中,SIX6蛋白是一个效应蛋白。西瓜枯萎病是由西瓜专化型尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp.Niveurn,Fon）引起的真菌病害。为了明确FonSIX6在侵染西瓜时的作用,克隆了该基因的上下游序列,以潮霉素为筛选标记构建了该基因的缺失突变体载体pDH\|SIX6;将构建好的基因缺失载体转入农杆菌AGL\|1中,通过农杆菌介导的遗传转化和转化子的筛选获得了FonSIX6基因的缺失突变体。     

西瓜、水稻根分泌物及酚酸类物质对西瓜专化型尖孢镰刀菌的影响#br#

 【目的】探讨西瓜、水稻根分泌物及其中的酚酸类物质对西瓜专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. niveum,FON)的影响,阐释西瓜枯萎病的发生和西瓜/旱作水稻间作系统改善西瓜连作枯萎病的机理。【方法】营养液培养法收集西瓜根分泌物(REW)和水稻根分泌物(RER),研究其对FON生长的影响;HPLC法分离鉴定REW和RER中的酚酸类物质,并通过外源添加法研究该类物质对FON生长的影响。【结果】REW能显著促进FON孢子萌发和产孢,与对照相比,1.0 mL和5.0 mL 的REW对FON孢子萌发的促进率分别为46.9%和59.2%;在0.1 mL至2.0 mL范围内,REW对FON产孢的促进率从10.8 %逐渐增加到84.6 %;而RER能显著抑制FON孢子萌发和产孢,1.0 mL和5.0 mL RER对FON孢子萌发抑制率分别为14.3 %和6.1 %;并在0.1 mL至2.0 mL范围内,对该菌产孢的抑制率由4.6%增至37.5%。在REW和RER中同时检测到水杨酸、对羟基苯甲酸和邻苯二甲酸,而阿魏酸和香豆酸分别单独存在于REW和RER中;且RER中以香豆酸含量最高(占总量的37.9%);其酚酸总量是REW的1.4倍。综合FON孢子萌发、产孢能力和菌丝生长三项测定指标,香豆酸的抑菌效果最显著,抑制率分别为9.1%—70.5%、24.1%—100.0%和2.5%—47.5%,其次是水杨酸;而阿魏酸、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸对FON孢子萌发、产孢有不同程度的促进作用,以阿魏酸最为突出,浓度为40—160 mg•L-1时促进率分别为28.6%—114.3%和17.7%—54.8%。【结论】西瓜根分泌物对FON有刺激作用而水稻根分泌物对FON却具有抑制作用,这为阐释西瓜/旱作水稻间作系统改善西瓜连作枯萎病提供了理论依据。     

尖孢镰刀菌亚麻专化型生物学特性研究

文章旨在研究尖孢镰刀菌亚麻专化型病原体的生物学特性.探索温度、pH、光照、培养基、碳源及氮源等条件对该病原体菌丝生长、分生孢子产生和萌发的影响.结果表明,该菌菌丝分别在30℃、pH 7、8条件下生长最快;持续黑暗及PDA培养基上生长状况最好;可有效利用多种碳、氮源,其中以淀粉、氯化铵最适.分生孢子的产量及萌发率分别在2...     

尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型原生质体制备优化及再生性能

唐菖蒲(Gladiolus hybridus Hort)根腐病是由尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Gladioli)引起的真菌性病害。原生质体是研究尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型与唐菖蒲之间的互作关系的重要工具,试验以尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型为供试菌株,进行原生质体制备条件的优化与再生,明确培养基、菌龄、β-巯基乙醇预处理、酶选择以及酶解时间对原生质体产生的影响。试验结果表明:在PDB培养基中原生质体制备的最优条件为15μLβ-巯基乙醇预处理1 h,在5%崩溃酶溶液酶解3 h。在此条件下,12~14 h菌丝的原生质体产量可达到1.4×107个/m L,再生率为57.4%。     

西瓜尖孢镰刀菌FOV-135的绿色荧光蛋白基因转化

建立并优化了PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,成功地将绿色荧光蛋白基因转入到西瓜尖孢镰刀菌FOV-135菌株中.转化子连续转接5代能够稳定遗传,荧光强度良好,每微克质粒DNA可获得4～6个性状稳定的转化子.PCR验证也表明gfp基因已转入到菌株FOV-135中.     

西瓜专化型尖孢镰刀菌的分离鉴定及水稻根系分泌物对其生长的影响

利用尖孢镰刀菌选择性培养基从西瓜枯萎病发病部位分离出病原菌,通过Booth＇s镰刀菌分类鉴定标准和专化型试验,确定该菌株为西瓜专化型尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f．sp．niveum）。以该菌株为材料,研究水稻根系分泌物对其生长的影响。结果表明,2个水稻品种ELIO和4007的根系分泌物均能显著抑制其孢子萌发和孢子产生。当根系分泌物的加入量为1．5mL时,ELIO和4007对孢子萌发的抑制率分别为37．8％和41．0％;当加入20mL水稻根系分泌物时,ELIO和4007对孢子产生的抑制率达到96．3％和76．4％。水稻根系分泌物对西瓜尖孢镰刀菌孢子产生过程的抑制作用主要发生在孢子萌发阶段和孢子在尖孢镰刀菌瓶状小梗上的生成阶段,而对菌丝营养生长没有影响。西瓜与旱作水稻间作的盆栽试验表明,间作系统中西瓜苗的鲜重和株高分别提高了186．0％和80．5％。单作西瓜枯萎病发病率为66．7％,死亡率为44．4％,而间作处理中西瓜均生长正常。间作条件下,西瓜根际土壤中的尖孢镰刀菌数量显著降低,与单作根际土壤相比减少了91％。表明：水稻根系分泌物能显著抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌生长,采用旱作水稻与西瓜间作能有效缓解西瓜枯萎病的发生。     

茄科尖孢镰刀菌3 个专化型细胞壁降解酶的比较

对茄科作物致病尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,FOL)、茄子专化型(F.oxysproum f. sp. melongenae,FOM)和辣椒专化型(F.oxysporum f. sp. capsicum,FOC)细胞壁降解酶多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)、果胶甲基反式消除酶(PMTE)及纤维素酶(Cx)进行比较。对3个专化型分别在寄主植物体内细胞壁降解酶活性测定表明:发病茄子和番茄体内酶活性从高到低依次为PG、PMG、PGTE、Cx 和PMTE,发病辣椒体内酶活性从高到低依次为PG、PGTE、PMG、PMTE 和Cx。体外诱导试验发现,FOC所产生的PG活性比FOM和FOL高,而FOM所产生的PGTE比FOC和FOL高,3个专化型的PMG、PMTE和Cx活性没有显著差异。通过PG同工酶薄层等电聚焦电泳分析,FOL、FOM和FOC分别产生5、5、3个PG同工酶,各有1条特异的PG同工酶条带。推测此3个专化型PG同工酶的差异可能和病原菌的致病作用和寄主专化性差异有关。     

尖孢镰刀菌寄主专化型脂肪酸生物标记鉴别特性

【目的】分析不同寄主尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记的结构组成和分布特性,建立尖孢镰刀菌寄主专化型脂肪酸生物标记鉴别模型。【方法】通过脂肪酸鉴定系统（Sherlock MIS）对来自于西瓜、香蕉和花生寄主的22株尖孢镰刀菌进行脂肪酸生物标记检测,采用聚类分析方法分析尖孢镰刀菌脂肪酸的同质性,采用主成分分析提取尖孢镰刀菌寄主专化型特征脂肪酸,利用Bayes逐步判别方法,建立尖孢镰刀菌寄主专化型判别模型。【结果】从供试的22个菌株中检测到8种脂肪酸,其中常见脂肪酸有6条,相对含量60%以上的主要脂肪酸有16:0、18:0 和18:2 CIS 9,12/18:0a。对常见脂肪酸进行聚类分析,结果表明脂肪酸与尖孢镰刀菌寄主专化型的系统发育存在着对应关系。对常见脂肪酸进行主成分分析,得到尖孢镰刀菌脂肪酸中的特征脂肪酸有5个,分别为14:0（X1）、16:0（X2）、16:1 CIS 9（W7）（X3）、18:0（X4）和18:2 CIS 9,12/18:0a（X5）。利用Bayes逐步判别分析,建立的尖孢镰刀菌寄主专化型判别模型为Y1=-183.06+12.24X1+8.05X2+5.39X4+3.58X5、Y2=-174.09+10.40X1+ 7.96X2+5.40X4+3.42X5、Y3=-173.97+ 14.85X1+7.25X2+ 6.58X4+ 3.53X5,当1≤Yi＜2时,菌株的寄主为西瓜;当2≤Yi＜3时,菌株的寄主为香蕉;当Yi＞3时,菌株的寄主为花生,且模型判对的概率为0.91。利用这套模型,对从西瓜、香蕉、花生上采集的56株尖孢镰刀菌寄主专化型进行判别,准确率达92.86%。【结论】脂肪酸生物标记可以作为尖孢镰刀菌寄主鉴别指标,脂肪酸14:0、16:0、18:0、18:2 CIS 9,12/18:0a是判别尖孢镰刀菌寄主的4个重要指标,建立的判别模型比较符合实际,有很好的应用价值。     

尖孢镰刀菌HG-11响应解淀粉芽胞杆菌B501胁迫的机制分析

前期研究发现生防拮抗菌解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B501能够显著抑制尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）HG-11,检测发现B501可以形成生物膜,具备产生纤维素酶和淀粉酶的能力。目前生物防治主要着眼于生防微生物的抑菌机制,而病原菌如何应对生防微生物胁迫的机制却常被忽略,因此旨在利用RNA-seq技术研究HG-11对B501生防胁迫响应的分子机制。结果表明,与对照HG-11样品相比,B501发酵液处理的HG-11样品中共有3 171个基因显著差异表达,其中2 106个基因上调表达,1 065个基因下调表达。上调表达有与细胞壁和细胞膜结构相关的基因如甾醇3-β-葡萄糖基转移酶基因、脂肪酸合成酶基因等,与抗氧化相关的上调表达基因有氧化物酶基因、P-P-键-水解驱动的跨膜转运蛋白基因等,以及与核糖体和线粒体相关的上调表达基因,如核糖体蛋白复合物、异柠檬酸脱氢酶等基因;下调表达的酰基转移酶基因、DNA连接酶基因等均为与细胞修复相关的基因。推测B501的抗菌物质通过破坏细胞壁及细胞膜的结构,并进入细胞内部破坏核糖体和线粒体从而抑制真菌生长。而HG-11通过调节与此相关的多个靶标蛋白或合成途径的基因表达,以缓解B501的生防胁迫作用。初步明确了尖孢镰刀菌应对生防解淀粉芽胞杆菌胁迫的基因表达差异,病原菌的自我防御机制或许是生防菌株易变表现的一个重要因素,提高了对病原菌与生防菌互作结构的认识。     

几株尖孢镰刀菌的绿色荧光蛋白基因转化

利用PEG介导的原生质体转化方法,将绿色荧光蛋白基因转入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中。结果表明:转化子连续转接5代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入到菌株中,为后续研究香蕉枯萎病菌和棉花枯萎病菌的侵染、防治等提供可视化的检测和分析手段。     

拮抗尖孢镰刀菌的芽孢细菌的筛选

通过80℃水浴加热20 min、系列梯度稀释和涂布平板法,从土样中分离不同菌落形态的芽孢细菌32株。通过十字划线法进行初筛,获得对尖孢镰刀菌有拮抗作用的菌株21株,其中13株拮抗作用显著。通过打孔法进行复筛,获得对尖孢镰刀菌有显著拮抗作用的菌株6株,其中ZH-15菌株拮抗作用最显著,为尖孢镰刀菌的生物防治打下基础。     

尖孢镰刀菌的分布与西瓜枯萎病病程的相关性

【研究目的】研究西瓜枯萎病菌在植株体内数量分布及其扩展规律。【方法】在福建省永泰的西瓜地调查了枯萎病不同发病级别西瓜植株的生长状态,以及尖孢镰刀菌在根际土壤和植株体内的分布情况。【结果】随着枯萎病病情的发展,枯萎病显著地影响着植株的生长态势,地上部和地下部的生长都受到抑制。健株平均蔓长较发病植株的蔓长15.5～205.4cm,地下部根长比1级和3级植株分别长0.3cm和8.6cm。在同一块田地中,西瓜健株与枯萎病病株的根际土壤均存在着枯萎病菌尖孢镰刀菌,病原菌的数量与发病程度并无明显相关性。但是,西瓜健康植株仅在根部检测到尖孢镰刀菌,发病初期的植株在根部和主茎基部检测到尖孢镰刀菌,而发病中期植株是在根、主茎基部和茎蔓中部检测到尖孢镰刀菌;植株根部的尖孢镰刀菌数量表现为发病中期植株>发病初期植株>健康植株,分别为3.97×103cfu/g、2.07×103cfu/g和0.27×103cfu/g。【结论】病株内的尖孢镰刀菌的数量与病情呈现正相关,菌体有自下而上的扩展连续性。     

枯草芽孢杆菌BSK1对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)拮抗作用的研究

通过对枯草芽孢杆菌菌株BSK1的对峙培养和菌株代谢物对尖孢镰刀菌的抑制作用研究。结果表明菌株BSK1对尖孢镰刀菌具有较强的拮抗作用,对峙培养明显抑制靶标菌菌丝向四周扩展,抑菌带宽度0.8cm,菌株的浓度1%无菌发酵液对靶标菌的生长抑制率在60%以上。菌株BSK1对多种植物病源菌也具有明显抑制作用。     

尖孢镰刀菌甜瓜专化型基因组规模分泌蛋白的预测与分析

利用Signal P、Wo LF PSORT、TMHMM、big-PI Predictor、Target P和Secretome P等软件,对尖孢镰刀菌甜瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.melonis,FOM)全基因组26 811条蛋白质氨基酸序列进行了分泌蛋白的预测分析。结果表明,FOM全基因组编码蛋白中有1 145个经典分泌蛋白,占编码蛋白总数的4.3%;有8 471个非经典分泌蛋白,占编码蛋白总数的31.6%。对经典分泌蛋白特征进行分析,发现其氨基酸长度集中在100~600个氨基酸,信号肽长度集中在17~22个氨基酸。对经典分泌蛋白的功能预测分析表明,有605个分泌蛋白获得了注释,主要涉及糖代谢、转运过程、过氧化氢代谢和生物合成等。对碳水化合物酶类(CAZymes)进行分析,结果表明有277个分泌蛋白为CAZymes,占经典分泌蛋白总数的24.2%。     

乌头酸对尖孢镰刀菌百合专化型抑制作用分析

乌头酸是兰州百合一种重要的根系分泌物,为探究乌头酸对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）百合专化型的作用效果,测定外源乌头酸对F.oxysporum生长及抗氧化酶活性基因表达量的影响。结果表明,浓度为1.175~1 175 mg·L^-1时,乌头酸对F.oxysporum的生长具有抑制作用,且随着浓度增加,抑菌作用显著。浓度为1 175 mg·L^-1时,与CK相比,乌头酸对F.oxysporum抑菌率、产孢量抑制率和孢子萌发抑制率分别达到91.95%、77%、93%。乌头酸处理引起菌丝体电导率增大,随着浓度和时间的增加,SOD、POD活性呈现先增加后降低的趋势。SOD酶合成基因在转录水平上于11.75~1 175 mg·L^-1处理下调表达, 1.175 mg·L^-1处理时SOD酶合成基因出现上调,与CK差异不显著。POD酶合成基因在转录水平上所有处理均下调表达。可见,乌头酸可以作为化感抑制剂应用于植物土传病害的防治。     

尖孢镰刀菌F86—15防治西瓜枯萎病的研究

经培养制成的尖孢镰刀菌F86-15菌剂,播种时用于浸种和穴施,可有效地控制西瓜枯萎病[Fusarirm oxysporum f. sp. niveum (E. F. Smith)Snyder et Hansen]。在重病地两年试验,施用F86-15保护菌菌剂的防效为48.7％和75.0％,比对照增产16.1％和53.9％。机理研究表明,F86-15保护菌与Fw-3西瓜枯萎病菌孢子悬浮液含孢量按10:1同时接种,其保护效果为72.1％。