兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。     

T7噬菌体p10融合蛋白表达及自组装VLP观察

原核表达T7噬菌体p10融合蛋白,PCR扩增p10基因并在基因下游连接口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原表位基因;将融合基因插入p ET-28a载体,构建重组质粒;用IPTG诱导重组菌表达目标蛋白,通过电镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成。结果成功构建了p ET-p10-VP1表达菌株。SDS-PAGE、Western-blot检测显示目标蛋白高效表达并与VP1特异性抗体产生免疫反应。回收p10-VP1蛋白样品经透射电镜观察,有40 nm VLP生成。表明T7噬菌体p10蛋白具有良好的VLP自组装功能,并可用于抗原表位的表面展示。     

T7噬菌体p10融合蛋白表达及自组装VLP观察

原核表达T7噬菌体p10融合蛋白,PCR扩增p10基因并在基因下游连接口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原表位基因;将融合基因插入p ET-28a载体,构建重组质粒;用IPTG诱导重组菌表达目标蛋白,通过电镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成。结果成功构建了p ET-p10-VP1表达菌株。SDS-PAGE、Western-blot检测显示目标蛋白高效表达并与VP1特异性抗体产生免疫反应。回收p10-VP1蛋白样品经透射电镜观察,有40 nm VLP生成。表明T7噬菌体p10蛋白具有良好的VLP自组装功能,并可用于抗原表位的表面展示。     

猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗原多肽的串联表达及活性鉴定

为获得含合成肽疫苗抗原多肽的重组表达蛋白,根据猪口蹄疫O型合成肽疫苗中抗原多肽的氨基酸序列,使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成该抗原多肽的双拷贝基因序列,并克隆至表达载体pET32a中,构建原核表达质粒pET32a - P2.将重组质粒转化BL21 (DE3),经IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS - PAGE电...     

新城疫病毒HN基因主要抗原位点区段的原核表达

利用生物软件对新城疫病毒GD/GM/03/Ch的血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白进行抗原特性分析,选定169～267位氨基酸、318～405位氨基酸和448～571位氨基酸3个区域作为多肽表位候选区域.用含新城疫病毒HN基因的重组质粒为模板,设计引物通过PCR扩增获得HNa、HNb和HNc 3个抗原结构域基因片段,分别经双酶切定向克隆到原核表达载体pBT上进行表达,并构建了pBT-HNa-b-c串联重组质粒进行表达,经过SDS-PAGE和Western-blot分析,验证了表达产物具有反应原性.     

禽传染性支气管炎病毒nsp4蛋白多克隆抗体制备及其生物学功能研究

【目的】筛选出禽传染性支气管炎病毒（IBV）非结构蛋白4(nsp4)抗原性较好的氨基酸区域并制备多克隆抗体,为进一步研究nsp4蛋白在IBV复制过程中的功能提供物质基础,也为研发IBV新型诊断试剂盒与疫苗打下基础。【方法】对IBV Beaudette株nsp4蛋白进行原核表达,以融合蛋白nsp4作为免疫原免疫健康日本大耳白兔和健康阴性鸡,制备相应的兔多克隆抗体和鸡多克隆抗体,并通过间接ELISA检测、Western blotting检测及IFA验证等对制备获得的多克隆抗体进行生物学功能研究。【结果】选取nsp4蛋白第408～514位氨基酸作为原核表达序列,成功构建了nsp4蛋白原核表达载体pCZN-1-HIS-nsp4和nsp4蛋白真核表达载体pVAX1-nsp4-HA。原核表达的融合蛋白nsp4为13.6 kD,与预期结果相符,能与IBV GX-YL5株和M41株全病毒阳性血清反应。制备的兔、鸡多克隆抗体血清效价分别为1∶128000和1∶6400,均能与融合蛋白nsp4和IBV全病毒反应,且与IBV GX-YL5株、Beaudette株和M41株感染鸡胚肾细胞（CEK）表达的nsp...     

口蹄疫病毒3D蛋白C端Th表位的重组表达及免疫功能鉴定

为获得含有口蹄疫病毒( foot and mouth disease virus,FMDV)3D蛋白C端多个Th表位的重组表达蛋白,根据口蹄疫3D C端160个氨基酸序列,设计优化并人工合成相应的核酸序列,将其克隆至pET28a,构建原核表达质粒pET28a C160,并将重组质粒转化BL21(DE3),0.5 mmol/L IPTG诱导后,收集菌液进行SDS PAGE和Western blot鉴定。结果显示,在25 ku处有一条明显的蛋白表达条带,且重组蛋白能与豚鼠抗O型口蹄疫病毒阳性血清发生特异性反应。对表达产物进行可溶性分析,结果显示,表达蛋白全部以包涵体形式存在,经变复性后获得较高质量浓度的纯化蛋白。可见：用纯化的3D C160蛋白作为Th佐剂与口蹄疫主抗原混合制成疫苗,免疫后能刺激猪体产生较高水平的口蹄疫抗体。     

小鼠抗人ABHD16A多克隆抗体制备

克隆并原核表达人含α/β水解酶结构域丝氨酸酶16A(ABHD16A)基因,制备小鼠抗ABHD16A多克隆抗体。采用反转录PCR克隆ABHD16A的cDNA序列,对该序列进行同源性分析,将克隆的ABHD16A cDNA序列克隆至原核表达载体pET-28a(+)导入E.coli BL21(DE3)进行原核表达,将纯化ABHD16A的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗血清。研究结果显示,人ABHD16A cDNA序列长度为1 677 bp,序列高度保守,并具有保守的脂肪酶样基序和相应的功能区,原核表达的重组ABHD16A蛋白免疫小鼠后制备的多克隆抗血清在1∶5 000的稀释度具有较好的抗原抗体结合活性。成功制备了小鼠抗人ABHD16A多克隆抗体。     

副猪嗜血杆菌hhdA克隆、抗原表位预测和表达

根据Gen Bank中的副猪嗜血杆菌hhd A的基因序列,设计并合成l对特异性引物,对从江西分离的HPS的hhd A基因进行扩增、克隆、测序、生物信息学分析和原核表达。测序结果表明,扩增的目的基因大小为1 797bp,共编码氨基酸599个氨基酸。与Gen Bank上公布的ZJ0906株(CP005384.1)中对应的核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性99.6%。生物信息学分析表明,HPS hhd A蛋白是一种混合型结构蛋白,含有α-螺旋、β-折叠、β转角和无规则卷曲;综合柔性区域、亲水性位点、抗原指数和表面可能位点预测了hhd A蛋白可能的B细胞抗原表位的优势表位。将目的基因转入原核表达载体p ET-32a(+)构建重组原核表达质粒p ET-32a(+)-hhd A,将重组质粒转化到BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达,经过SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白约80 k D。为进一步研究HPS hhd A生物学功能及抗体制备和开发hhd A基因工程产品奠定了基础。     

兔出血症病毒VPg蛋白的原核表达及抗体制备

【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Western blot检测其特异性。【结果】构建了pET-30a/VPg原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,成功表达了VPg蛋白。用该蛋白免疫试验兔后,制备的多克隆抗体能与VPg蛋白特异性反应。【结论】成功表达了RHDV VPg蛋白,并制备了特异性良好的多克隆抗体。     

猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

病毒受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的重要因素.利用原核细胞表达了猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后免疫兔,制备兔多克隆抗体.以含有猪β8亚基全长cD-NA的质粒为模板,经PCR扩增得到位于β8成熟肽氨基端的LBD基因片段,与带有GST标签的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β8LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组β8LBD融合蛋白.通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,鉴定血清效价和特异性.结果显示,实现了重组猪β8LBD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在于菌体中.制备的兔多克隆抗体效价达1∶12 800以上,该血清可与目的蛋白发生特异性反应.这将为进一步研究猪整合素β8亚基在宿主体内的分布及其在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础.     

斑马鱼血管新生相关因子PTPRB的原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】原核表达斑马鱼（Danio rerio）蛋白酪氨酸磷酸酶受体B（PTPRB）并制备多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB基因功能及血管发育相关信号传导通路打下基础。【方法】采用无缝克隆技术将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m构建重组表达质粒,转化大肠杆菌B21感受态细胞后采用IPTG进行诱导表达,然后以诱导表达的融合蛋白免疫大耳兔制备多克隆抗体,并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性及免疫效价。【结果】斑马鱼PTPRB蛋白亲水性均值为-0.490,属于亲水性蛋白,且具有较丰富的潜在抗原表位位点,分布均匀,无典型的跨膜区。将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m成功构建获得重组表达质粒pET-B2-PTPRB,转化B21感受态细胞后经IPTG诱导表达,即获得35.0 kD的融合蛋白。融合蛋白PTPRB主要以包涵体形式存在;以纯化融合蛋白PTPRB免疫大耳兔,其血清抗体效价为1∶2048000,说明采用融合蛋白PTPRB可有效刺激大耳兔产生较强的免疫反应,获得较高效价的PTPRB多克隆抗体。Western blotting检测结果显示,PTPRB多克隆抗体具良好抗原特异性。采用Protein A/G亲和层析柱对制备获得的PTPRB多克隆抗体进行亲和层析纯化,可获得高纯度的多克隆抗体,纯化后的PTPRB多克隆抗体浓度在10 mg/mL以上。【结论】构建的斑马鱼PTPRB基因原核表达载体能高效表达具备良好免疫原性的融合蛋白PTPRB,以融合蛋白PTPRB免疫大耳兔可获得高效价、高特异性的PTPRB多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB蛋白功能提供有利工具,也为揭示PTPRB在鱼类血管发育中的作用机制提供技术支持。     

新城疫病毒F48E9株HN蛋白抗原结构域区段的原核表达

利用生物软件对新城疫病毒F48E9株的血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白进行抗原特性分析,选定172～570位氨基酸区域作为多肽表位候选区域。以pUC18-F-HN为模板,设计引物通过PCR扩增,获得HN抗原结构域基因片段,SaⅠl、NoⅠt双酶切定向克隆到原核表达载体pET28a,获得重组质粒分别命名为pET28a-HNa。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,筛选出阳性克隆,诱导表达并取产物进行分析。结果表明,HN抗原结构域基因片段获得了融合表达,Western-blotting分析证实表达产物HN与NDV阳性血清具有免疫反应性。为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白相互作用奠定了基础。     

中华蜜蜂囊状幼虫病病毒非结构蛋白抗体的制备及其应用

应用Gateway重组技术构建CSBV非结构蛋白,RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)的原核表达载体,将重组表达载体转化大肠杆菌Rosetta,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)诱导获得RdRp基因原核表达蛋白.以重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备相应的多克隆抗体,Western blot检测表明,该抗体能与RdRp重组蛋白和感病中华蜜蜂幼虫蛋白特异性结合,说明获得的抗体特异性高.利用制备的抗体进行免疫荧光标记,发现其能特异地定位在感病中华蜜蜂血淋巴细胞内.     

O型口蹄疫病毒VP1基因及其多表位基因的原核表达与纯化鉴定

[目的]通过原核表达并纯化获得O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因及其多表位基因的重组蛋白,为建立O型FMDV抗体ELISA检测试剂盒及制备动物高免血清提供技术支持.[方法]以O型FMDV VP1全基因重组质粒pMD18-T-T-VP1及串联的ⅥP1多表位基因重组质粒pMD 18-T-O-VP1为模板,通过特异性引物扩增并回收目的基因,构建重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1,然后转入大肠杆菌BL211 (DE3)中诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行分析鉴定.[结果]O型FMDV的VP1基因及其多表位基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到正确表达,表达的两种融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯度较高,且均能与猪抗O型FMDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性.[结论]表达获得的融合蛋白具有良好的反应原性,可作为包被抗原应用于O型FMDV抗体检测试剂盒研发.     

O型口蹄疫病毒VP1-2A基因及多表位片段在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统串联表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因及O型FMDV多表位片段(CTE),将O型FMDVvp1基因和CTE多表位片段克隆到毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-VP1-2A-CTE并测序。经SalI线性化后,通过电击转化法将重组质粒导入毕赤酵母GS115中,并对表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组质粒通过电转进入毕赤酵母后,能表达相对分子量为41.8KD(CTE)和26.5KD(VP1-2A)的蛋白,经Western blot分析,两种蛋白均具有抗原性。在毕赤酵母中成功地表达O型FMDVVP1-2A蛋白和多表位片段(CTE),为研制新型口蹄疫的基因工程疫苗奠定了基础。     

尼罗罗非鱼TGF-β1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为制备尼罗罗非鱼TGF-β1多克隆抗体,采用同源重组技术构建尼罗罗非鱼pET-B2m-TGF-β1原核表达载体,转入大肠杆菌B21中诱导表达,将重组表达蛋白质纯化后免疫大耳兔制备多克隆抗体,采用Western Blot和ELISA检测抗体的特异性和效价。结果表明,构建的pET-B2m-TGF-β1原核表达载体经诱导表达获得了分子量为5.2×10~4的重组蛋白质,免疫大耳兔获得效价为1∶2 048 000的抗尼罗罗非鱼TGF-β1多克隆抗血清,该抗体能够特异性地识别原核表达的TGF-β1蛋白。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3D原核表达、纯化和反应原性分析

采用RT-PCR技术扩增获得口蹄疫病毒(FMDV)细胞毒O/Akesu/58的非结构蛋白3D(NSP 3D)基因编码区,并定向克隆到pProexHTb原核表达载体上,再将重组pProex-3D转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达产物用亲和层析法纯化,经SDS-PAGE鉴定和Western-blot分析抗原性;以纯化的表达蛋白免疫豚鼠制备其多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,间接免疫荧光法检测制备的豚鼠抗NSP 3D多克隆抗体与细胞毒天然抗原的反应原性.结果表明:表达的目的蛋白大小为53ku左右;ELISA结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶1 024以上;Western-blot分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应;间接免疫荧光检测发现,豚鼠抗3D蛋白多克隆抗体可与细胞毒天然抗原反应,与阴性对照未见反应.     

新型番鸭细小病毒Rep蛋白羧基端亚片段的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】获得特异性识别新型番鸭细小病毒（New-genotype muscovy duck Parvovirus,N-MDPV）Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。【方法】通过蛋白序列分析，选取N-MDPV Rep羧基端亚片段区域487～627 aa，后全基因合成序列，并在其C末端添加His-tag标签，利用无缝克隆的方法，将该段基因克隆至pET-28a(+)载体，随后转化Rosetta(DE3)大肠杆菌，诱导表达得到重组蛋白。利用镍柱亲和层析技术纯化表达重组蛋白，将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔，制备针对Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。【结果】构建了pET-28a-Rep-487-627原核表达质粒，纯化表达了该重组蛋白。SDS-PAGE结果表明该重组蛋白分子大小约24 kDa，主要以可溶性形式表达。间接免疫荧光和免疫印迹试验表明制备的多克隆抗体能与细胞内过表达的N-MDPV Rep蛋白特异性反应。【结论】制备的Rep多克隆抗体具有良好反应特异性，可识别Rep蛋白的构象表位和线性表位，满足进一步研究的需要。     

团头鲂转录因子Oct4的原核表达和多克隆抗体的制备

为进一步分析鱼类干细胞多能性转录因子Oct4的功能,将团头鲂(Megalobrama amblycephala)Oct4进行原核表达并制备了兔抗Oct4多克隆抗体。采用RT-PCR方法从团头鲂卵巢中扩增Oct4基因的部分编码片段,插入载体pET32a中构建重组原核表达载体pET32a-MaOct4;将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导、Ni~(2+)亲和柱层析纯化获得分子量约49 ku的可溶性重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备抗体,通过ELISA法测定其效价,Western blot鉴定其特异性。实验结果表明:该重组载体在37℃,0.5 mmol/L IPTG条件下诱导4 h可获得Ma-Oct4重组蛋白的高效表达;制备的团头鲂Oct4多克隆抗体能够分别与纯化的Oct4蛋白、原核表达的Oct4蛋白、团头鲂胚胎中的内源Oct4蛋白以及HepG2细胞中过表达的Ma-Oct4:DsRed融合蛋白特异结合。为后续深入研究团头鲂Oct4在干细胞多能性调控中的作用提供了有效的分子工具。