鸭源新城疫病毒和减蛋综合征病毒在同一鸭胚中增殖的观察

用鸭源新城疫病毒（ＮＤ）Ｄ１０株和减蛋综合征（ＥＤＳ—７６）病毒ＧＣ２株同时在同一鸭胚中复制增殖．结果表明：（１）两种病毒同时感染同一鸭胚后，鸭胚平均死亡时间（ＭＤＴ）７３．６ｈ，死亡率８８．２％（１５／１７）．胚体皮肤出血、淤血，绒毛尿囊膜水肿、增厚，尿囊液能凝集人和鸡红细胞．（２）尿囊液感染鸡胚成纤维（ＣＥＦ）细胞，致细胞病变（ＣＰＥ），证实尿囊液中存在ＮＤＶ．用间接法Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ检测ＥＤＳ—７６病毒抗原，结果为阳性．（３）电镜观察经提纯浓缩后的尿囊液，可见到两种病毒粒子：ＮＤＶ形态不一，多数直径约１２０～１３０ｎｍ或更大．有囊膜；ＥＤＳ—７６病毒呈圆形，直径约７０ｎｍ，有囊膜．（４）用血凝试验（ＨＡ）测定两种病毒．其生长规律与单独接种时一致．（５）接种灭活的含毒尿囊液的雏鸡，在血清中出现抗两种病毒的ＨＩ抗体及抗ＥＤＳ－７６病毒的中和抗体，对ＮＤＶ强毒攻击有坚强的免疫力。     

鸡减蛋综合症病毒在鸭胚中增殖规律的研究

将不同稀释浓度鸡减蛋综合症病毒接种鸭胚 ,在不同时间内收毒 ,测定血凝价。结果表明 :不同稀释倍数病毒之间 ,增殖差异极不显著 (P >0 .0 5 ) ;收毒时间以 12 0h最适宜 (P <0 .0 1)。     

减蛋综合征AQ毒株的分离与鉴定

通过鸭胚接种，从发生产蛋下降、产畸形蛋的鸡群中分离到一株病毒ＡＱ毒株。该病毒能在鸭胚和鸭胚成纤维细胞上生长，并能引起明显的胚体病变和细胞病变，对鸡红细胞的凝集作用能被ＥＤＳ７６标准阳性血清所抑制；病毒对氯仿不敏感、耐酸（ｐＨ３．０）、对热（５０℃３０ｍｉｎ）稳定，核酸型为ＤＮＡ，电镜观察见直径约７０～７５ｎｍ的圆形病毒颗粒。初步鉴定ＡＱ株是鸡减蛋综合征病毒。     

一种非EDSV引起的鸭传染性减蛋症

自1999年5月以来，浙江省许多产蛋鸭发生了一种以产蛋率锐减为特征的新疾病，其中某地区67户养鸭专业户，共饲养蛋鸭15.7万羽，陆续进入产蛋高峰期后，有2375 羽鸭群的产蛋率突然下降，由原来的91.2%减到52.7%，同时伴有畸形蛋、沙壳蛋，蛋质低劣，蛋清稀薄，除少部分病鸭伴有烦躁不安和吵棚外，鸭群的精神体态基本正常，采食量略有下降，一般不引起死亡。起初养鸭户都误认为是当地饲料厂供应的饲料所致，后来发现该病具有传染性，疫病主要沿河流自上而下蔓延。在此后1个多月时间内，共有49户养鸭户12.3 万羽蛋鸭相继发病，产蛋率下降幅度为20%～80%，使用各种抗菌药物治疗无效，提高饲料营养也不起作用。该病发病急，传播迅速，通常在2～3天内产蛋率由80%～90%以上下降到30% ～40%，有的甚至更低，产蛋率越高，感染后下降幅度往往越大。病鸭从产蛋下降到康复需3 -7周时间，恢复后不能达到标准产蛋曲线，产蛋周期缩短。剖检病鸭主要表现为生殖器官病变，卵巢卵泡减少、萎缩，输卵管蛋白分泌部缩小，蛋白分泌腺减少，子宫萎缩，有的严重病例可见卵黄性腹膜炎，肝、心、肾和肺有斑点出血。该病的临床症状类似于减蛋综合征（ EDS）［1］，但是，用减蛋综合征灭活苗免疫预防不能有效保护。作者对病鸭体作无菌检查并分离了病毒（命名为YH99株），用0.2 μm滤器过滤后，经人工感染易感蛋鸭能成功诱导典型发病，再从病鸭中回收到同样病毒。将YH99株与鸡源减蛋综合征病毒（EDSV-AV127）［2～4］和鸭源减蛋综合征病毒［3］（EDSV-JE 1，由上海市畜牧兽医站周锦萍提供）进行比较，结果发现：     

减蛋综合征病毒(EDS_(76))的分离和鉴定

鸡减蛋综合征是由腺病毒引起的鸡的主要传染病之一,自1976年国外首次发现该病以来,已在包括我国在内的许多国家流行,给养禽业造成巨大的经济损失。2005年黑龙江省绥化市一个体养鸡场的190日龄商品蛋鸡突然出现产蛋下降,从发病鸡的输卵管中分离到一株具有血凝性的病毒。经过HI试验、AGP试验、理化特性和PCR序列扩增及测序,证明分离到的病毒是一株EDS_(76)V。     

鸡减蛋综合征病毒的分离与鉴定

从产蛋率下降．出现软壳蛋、薄壳蛋等畸形蛋的鸡场采集病料，接种鸭胚后分离到1株病毒，经过电镜观察，脂溶剂敏感性试验、HA试验、HI试验、AGP试验，分离病毒被鉴定为EDS-76病毒。     

不同方法提纯鸡减蛋综合征病毒的比较

通过相关系数的计算与显著性检验,结合病毒蛋白浓度的大小,同时进行电镜观察,证实了由鸭胚增殖的ＥＤＳ病毒采用６０％饱和度的硫酸铵或１０％聚乙二醇（ＭＷ６０００）深沉法初提后,再经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００层析法提纯的效果优于ＤＥＡＥ５２纤维素色谱法。     

减蛋综合征病毒基因文库的构建

采用差速离心法纯化了鸭胚尿囊液中的减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）ＷＰＤＶ２０５病毒并提取了病毒基因组核酸。选用ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨⅠ两种限制性内切酶对病毒基因组ＤＮＡ进行双酶切处理，结果产生７个片段，在这７个片段中，只具有ＢａｍＨⅠ酶切位点的片段有２个，只具有ＥｃｏＲⅠ酶切位点的片段有３个，具有双酶切位点的片段有２个。将其中的５个片段分别插入到ｐＵＣ１８相应多克隆位点中，建立了ｐＥＤＳＶＢＥ１、ｐＥＤＳＶＢＥ２、ｐＥＤＳＶＢ１、ｐＥＤＳＶＢ２、ｐＥＤＳＶＥ５个重组子，并对这５个重组子进行了酶切鉴定     

减蛋综合症病毒（EDS76V）VSH—23株灭活试验研究

对EDS76病毒HSH－23株进行了灭活试验研究，采用最终浓度为0．1％福尔马林在不同时间及温度条件下灭活HSH－23株病毒液，将灭活病毒液接种鸭胚以检查其灭活效果。结果表明：在37℃条件下，经过10h可将病毒完全灭活；该毒株具有较强的热稳定性，在37℃下，放置35天其HA价保持不变，灭活检验中发现，必须将灭活病毒液进行连续2次鸭胚接种。方可作出病毒是否完全灭活的判定。     

减蛋综合征病毒HSH23株与AV127株免疫效力比较研究

[目的]比较本室分离EDS75VHSH23毒株与AV127参考毒株的免疫效力。[方法]采用本室制备的ND—IB—EDS（HSH23株）三联灭活疫苗和市售ND—IB—EDS（AV127株）三联灭活疫苗,分别免疫海兰褐商品蛋鸡,免后采血测定EDSHI抗体,并于免后7周用AV127株强毒攻击。[结果]免后4、7周,本室三联苗EDSHI抗体分别为8．9、8．05log2,而市售三联苗分别为7．6、5．95log2,对照鸡抗体为阴性。攻毒后,疫苗免疫鸡产蛋率始终保持90％以上,而对照组鸡产蛋率急剧下降到40％左右,蛋质量变差;攻毒后第26天对照组试验鸡产蛋开始有所恢复,产蛋率达60％,攻毒后第32～42天产蛋率约75％,仍未恢复到正常水平。统计3组试验鸡攻毒后6周内平均每只鸡的产蛋个数,本室三联苗组、市售三联苗组及对照组分别为39．48、38．41和26．60枚,每只免疫组鸡比对照组多产鸡蛋12枚。[结论]EDS76VHSH23株、AV127株均具有良好的免疫原性。     

减蛋综合征病毒单克隆抗体的生物学特性鉴定

该研究在建立分泌减蛋综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的基础上，鉴定了１０株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体（４Ｂ１，１Ｄ４，２Ｄ６，３Ｄ６，２Ａ１，３Ａ５，３Ｃ６，３Ｃ１，１Ｂ３和２Ｃ５）和生物学活性，这１０株杂交瘤细胞分泌的抗体有高度的特异性，只特异地作用于减蛋综合征病毒，微量血凝抑制试验（ＨＩ）发现４Ｂ１，３Ｃ１，２Ｃ５和３Ｃ６有血凝抑制活性，腹水效价分别为２４（ｌｏｇ２），４（ｌｏｇ２），７（ｌ     

PCR方法检测鸡减蛋综合征病毒

根据已报道的鸡减蛋综合征(Egg drop syndrome 1976 EDS-76)病毒DNA序列,设计合成了1对能扩增300 bp DNA片段的引物,建立了EDS-76病毒的聚合酶链式反应(PCR)诊断方法。该方法对EDS-76病毒标准株AV-127扩增结果为阳性;对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)和鸡新城疫病毒(NDV)的扩增结果均为阴性。结果表明该方法特异且敏感,检测的最低病毒DNA含量达到2.5×10-2pg,PCR检测表明,从试验感染鸡的心脏中不能检测出病毒,肝脏和肾脏只有在感染后7~15 d检出,在试验感染后4~21 d的子宫、血液和4~17 d的脾中均能检测到病毒。     

减蛋综合征病毒环介导等温扩增检测方法的建立

根据GenBank登录的减蛋综合征病毒(EDSV)六邻体基因的保守区,设计了3对环介导等温基因扩增(LAMP)引物,优化反应体系,并对其灵敏性、特异性进行验证.结果表明:LAMP优化后的反应体系为外引物浓度0.1μm01·L-1,内引物浓度0.8 μmol·L-1,环引物浓度0.4μmol·L-1,Mg2+浓度8.0 ...     

减蛋综合征病毒NE4株全基因组序列测定与分析

根据减蛋综合征病毒(EDSV-76)AV-127株的全基因序列(序列号BK000404),用Premier5.0软件设计22对引物,利用PCR方法对EDSV-76病毒NE4株的全基因组进行了分段扩增、克隆和序列测定,并用DNAStar分析软件对各片段的测序结果进行拼接,将该序列与GenBank中已登录的相应序列进行同源性分析,并用六邻体蛋白构建进化树.结果表明:NE4株基因组序列全长33214bp,GC含量为43%,与国际标准株AV-127相比,核苷酸序列同源性为99.6%.碱基的插入或缺失主要在非编码区,在100K蛋白编码区距羧基端1/10处插入了1个碱基C,其ORF编码696个氨基酸,而AV-127株100K蛋白编码709个氨基酸,预计其发挥功能的基团在N端.蛋白同源性分析表明,EDSVNE4株主要蛋白与羊腺病毒OAV(Ovine adenovirusD)、牛腺病毒BAV(Bovine adenovi-rusD)和蛇腺病毒SAV(Snake adenovirus)有较高的同源性,而与禽腺病毒Ⅰ群(CELO)的同源性较低,说明NE4株与禽腺病毒Ⅰ群亲缘关系较远,进化树分析也证实了此特性.     

减蛋综合征1976病毒单克隆抗体的制备及其初步鉴定

采用经层析方法提纯的减蛋综合征１９７６（ＥＤＳ‘７６）病毒免疫ＢＬＡＢ／ｃ小鼠。最后一次加强免疫后第３ｄ制备脾脏细胞，然后用５０％的聚乙二醇（ＰＥＧ，分子量４００）融合脾脏细胞和ＳＰ２／０骨髓瘤细胞。通过选择培养、特异性抗体检测、筛选和克隆詈笾票赋觯抵攴置诳固宓南赴辏停玻停常停保埃停保春停停保怠Ｎ⒘垦种剖匝椋ǎ龋桑┲っ鳎停保档タ寺】固寰哂醒种苹钚裕龋杉畚叮ǎ欤铮纾玻     

减蛋综合征病毒PVⅢ蛋白基因的克隆与序列分析

根据减蛋综合征病毒PV 蛋白基因序列设计了1对特异性引物,应用降落PCR法对PV 蛋白基因进行了扩增。将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,经酶切和PCR鉴定,初步证明了目的片段的正确性。进一步核苷酸序列测定表明,所扩增的基因片段长度为0.756kb,共编码250个氨基酸。     

鸡减蛋综合征油乳灭活苗的制备及其免疫效果的测定

本研究以鸡减蛋综合征(EDS—76)当地流行毒株做为种毒培养病毒,配以油佐剂制奋了鸡减蛋综合征油乳灭活苗。经实验室免疫试验和大田免疫试验证明,该苗在免疫后第10天即可产生坚强的免疫力(HI效价为8.5log2),到第30天血清中HI效价达到高峰(11.25log2),直到第150天,其HI效价仍为(7.5log2)。对所有用苗鸡群(10万余只)跟踪调查10个月,未发现有发病鸡群,免疫效果普遍反映良好。保存期试验证明,该苗在4℃可保存18个月以上,室温阴暗处可保存10个月以上,这些均证明该苗产生免疫力快,强而且持久,可以有效地控制鸡减蛋综合征在本地区的流行,应进行大面积的推广应用。     

减蛋综合征病毒五邻体重组蛋白的原核表达及抗原性鉴定

根据减蛋综合征病毒(EDSV)AV-127株的全基因序列(GenBank序列号AC000004)设计了1对引物,采用PCR扩增出五邻体(Penton)完整基因,将其连接到克隆载体pMD18-T,经过鉴定后测序。序列分析表明,所获得的DNA片段核苷酸序列和GenBank中AV-l27株的五邻体比较有9个碱基突变,但利用DNAstar分析,两者的氨基酸完全一致。然后酶切胶回收后将目的片段连接到质粒表达载体pET-30a(+),获得的阳性克隆命名为pET-30a-Penton。将pET-30a-Penton转化E.coli Rosetta,经37℃、1.0 mmol·L-1 IPTG诱导表达5 h,SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀,结果显示目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为54.0 ku。Western Blot试验结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。