牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、灵敏的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Taq Man实时荧光定量RT-PCR的方法,根据NCBI GenBank上已公布的BVDV、猪瘟病毒(CSFV)核酸序列进行比对,利用Oligo 6.71软件设计一对引物及一条探针,建立了检测BVDV的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、重复性及其敏感性进行相关试验,结果表明该方法检测出BVDV标准毒株Oregon C_(24)V为阳性,猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和CSFV的检测均为阴性。对BVDV标准毒株最低检测量达到10~(-2.5) TCID_(50)。该方法检测同一样品重复进行8次检测,结果均一致,表明方法的重复性较好。应用该方法对6批猪瘟疫苗专用血清进行BVDV检测,阳性率为16.7%;猪瘟弱毒苗中未检出BVDV。建立的BVDV Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法为生产无BVDV污染的猪瘟苗提供了有力的保障。     

应用定量RT-PCR对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量评价研究

为进一步验证猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)与兔体定型热试验之间存在正相关性,本研究利用qRT-PCR方法对278批次HCLV疫苗进行检测,分别检测其疫苗含量及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)污染情况。结果表明,278批次猪瘟疫苗中有66批(24%)疫苗含量达不到规程标准,有42批(15%)疫苗存在BVDV污染;从所检疫苗中抽取6份qRT-PCR检测HCLV含量较低的疫苗,采用兔体定型热试验进行验证,两种方法结果吻合,表明qRT-PCR方法可以作为评价猪瘟疫苗质量的一种备选方法。     

猪用疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染的检测与分析

为调查我国猪用疫苗中牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的污染情况,本文用巢式RT-PCR方法检测了部分蓝耳病弱毒疫苗和猪瘟细胞苗中的牛病毒性腹泻病毒,并分析其核酸序列的遗传特性,结果共检测出9份BVDV阳性样品,分子遗传分析表明污染的牛病毒性腹泻病毒分别属于BVDV的1a型和1b型。     

牛病毒性腹泻病毒不同检测方法的比较研究

采用Idexx公司抗原捕获ELISA试剂盒对新疆部分地区160份牛血清进行了牛病毒性腹泻病毒抗原检测,结果有6份样品为阳性,对该6份血清用BVDV阴性血清进行了系列稀释后,分别用抗原捕获ELISA、RT-PCR和荧光RT-PCR进行检测,发现RT-PCR方法比ELISA检测灵敏度高10-100倍,荧光RT-PCR比RT-PCR灵敏度高约10-100倍。     

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

为同时检测猪源临床样本中的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV),基于这两种病毒的5'UTR序列设计特异引物和TaqMan探针,建立了一种检测CSFV和BVDV的双重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、最低检出限和重复性等进行了评价。结果显示,该方法只对CSFV和BVDV呈现特异性扩增,对猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,对阳性标准对照CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA和BVDV-2-5'UTR-RNA,最低可分别检出27、36和32拷贝/μL。该方法的组内和组间试验Ct值变异系数介于0.11%～1.20%,具有良好的重现性。对152份猪组织样本用该方法进行CSFV和BVDV核酸检测,结果检出CSFV阳性样本16份,BVDV阳性样本3份,CSFV和BVDV双阳性样本1份,与国标和OIE《陆生动物诊断试验和疫苗》相应的荧光RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的双重荧光RT-PCR方法可用于临床样本中的CSFV和BVDV检测,从而为猪瘟防制和净化提供了一种有效的技术手段。     

牛病毒性腹泻病毒在猪瘟疫苗中的污染情况及其检测方法的研究进展

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)和猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)同属黄病毒科瘟病毒属,猪瘟疫苗中污染BVDV可引起免疫失败。但由于两者在病毒粒子结构、基因组结构和抗原特性等方面均很接近,在血清学上存在交叉反应,因此难以检测猪瘟疫苗中污染的BVDV。文章对BVDV在猪瘟疫苗中的污染情况和检测方法进行了论述,旨在为猪瘟疫苗污染BVDV的检测提供理论基础。     

猪瘟疫苗中BVDV污染一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猪瘟(CSF)疫苗中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)污染的方法,试验根据GenBank上登录的BVDV 5'端非编码区基因组序列设计1对引物,经一步法RT-PCR反应条件的优化,建立了检测猪瘟疫苗中BVDV污染的一步法RT-PCR。结果表明:该方法对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒的扩增结果均为阴性,对BVDV基因组RNA的检测灵敏度达0.1 ng,与细胞培养法的符合率达100%。应用该方法对猪瘟疫苗、牛血清等138份样品进行BVDV污染的检测,阳性污染率达11.59%。该一步法RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、准确性和适用性,可用于猪瘟疫苗生产中血清、细胞、毒种、半成品等的质量控制及猪瘟疫苗临床应用中的质量检验。     

BVDV一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为实现对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的快速检测和分型,本试验根据GenBank已发表的BVDV1和BVDV2 5′UTR基因特异性保守区域设计特异性引物和探针,以体外转录病毒RNA作为模板,建立了BVDV1和BVDV2一步法双重荧光RT-PCR方法。结果显示,双重荧光RT-PCR对BVDV1和BVDV2的检测下限均为102拷贝;具有较强的特异性,对口蹄疫病毒、猪瘟病毒、Hobi样病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、施马伦贝格病毒等病毒核酸的扩增均为阴性;BVDV1和BVDV2的扩增均在102~107拷贝内呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数(R2)分别为0.999和0.998;方法重复性好,BVDV1和BVDV2的变异系数(CV值)分别在0.68%~1.87%和1.25%~1.90%。本试验对665份样品进行检测,共检出BVDV阳性样品45份,其中BVDV1阳性样品39份,BVDV2阳性样品5份,BVDV1和BVDV2均阳性样品1份。结果表明,本试验建立的BVDV一步法双重荧光RTPCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,可广泛应用于BVDV的快速检测、分型和流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列,设计合成了1对特异性引物,参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4 ng和7×10-4 ng,对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测,结果PRRSV有55份阳性,BVDV有14份阳性,PRRSV和BVDV混合感染的有12份,与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。     

2012～2017年猪瘟活疫苗中牛病毒性腹泻病毒检测情况

为控制本公司猪瘟疫苗中牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的污染,采用RT-PCR方法对猪瘟疫苗生产的全过程进行控制。2012～2017年共检测4089头新生牛血清、152批新生牛牛睾丸、1255份猪瘟抗原、114批猪瘟疫苗,BVDV阳性数分别为115、34、78和2份。