TetR转录因子Ms2583对分枝杆菌异烟肼敏感性的影响

转录因子在细菌适应胁迫环境中发挥重要作用,但是参与药物胁迫的转录因子还知之甚少。本研究以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)为研究对象,通过在药物平板上筛选转录因子超表达文库,发现MSMEG_2583(Ms2583)影响耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)对抗结核药物异烟肼(Isoniazid,INH)的敏感性。超表达Ms2583使耻垢分枝杆菌对INH的敏感性增强;基因保守结构域分析表明Ms2583编码一个TetR家族的转录调节蛋白;凝胶迁移率阻滞实验和细菌单杂交实验证明Ms2583能够与自身启动子特异结合。     

表达结核杆菌ppe27基因重组耻垢杆菌的构建及鉴定

采用PCR技术扩增出结核分枝杆菌ppe27基因,并克隆至穿梭质粒pMV261中,将重组pMV261-ppe27-flag穿梭表达载体电转化到耻垢分枝杆菌内,诱导重组耻垢分枝杆菌,通过免疫印迹分析表达产物。结果表明:成功构建表达结核分枝杆菌基因ppe27的重组耻垢分枝杆菌,Western blotting结果显示,表达的重组融合蛋白PPE27-FLAG能与抗FLAG多抗以及兔抗PPE27-HIS蛋白多抗发生特异反应,在37.9ku处有明显特异性条带。表达ppe27基因的重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步研究结核分枝杆菌致病机制奠定基础。     

共表达EGFP和UreB活载体疫苗的体内外稳定性研究

建立共表达人幽门螺杆菌UreB和绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础.利用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增的幽门螺杆菌的尿素酶编码基因全长片段,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pLA 73,构建pLA 73-UreB载体,将pLA 73-UreB和pEGFP共转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素和氨苄青霉素双筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定,Westernblot检测UreB的表达及活性.液体培养菌液在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光.从幽门螺杆菌基因组中扩增出约1 710 bp的基因片段,所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,Western blot检测说明幽门螺杆菌的UreB编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性.成功构建了共表达EGFP和幽门螺杆菌UreB基因的耻垢分枝杆菌疫苗,为其在幽门螺杆菌的防治中的应用奠定了研究基础.     

共表达EGFP和UreB活载体疫苗的体内外稳定性研究

建立共表达人幽门螺杆菌UreB和绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。利用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）扩增的幽门螺杆菌的尿素酶编码基因全长片段,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pLA73,构建pLA73-UreB载体,将pLA73-UreB和pEGFP共转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素和氨苄青霉素双筛选后,柚捉质粒用PCR法鉴定,Westernblot检测UreB的表达及活性,液体培养菌液在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光。从幽门螺杆菌基因组中扩增出约1710bp的基因片段,所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,Westernblot检测说明幽门螺杆菌的UreB编码基因在分枝杆菌中获得了表迭并具有良好的免疫原性。成功构建了共表达EGFP和幽门螺杆菌UreB基因的耻垢分枝杆菌疫苗,为其在幽门螺杆菌的防治中的应用奠定了研究基础。     

分枝杆菌阿拉伯半乳聚糖生物合成途径研究进展

综述了阿拉伯半乳聚糖生物合成关键基因、合成步骤及其调控因素的研究进展,利用结核分枝杆菌的基因组序列,从比较基因组层面分析了阿拉伯半乳聚糖生物合成的保守性,为利用耻垢分枝杆菌模型筛选阿拉伯半乳聚糖合成过程中潜在的药物作用靶标提供了基础。     

分枝杆菌中表达重组蛋白的新载体pMSL的构建

为了能够利用耻垢分枝杆菌表达和纯化结核分枝杆菌蛋白,构建了大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pMSL。该质粒包括来源于牛型分枝杆菌hsp60基因启动子序列,目的蛋白插入的克隆位点和用于目的蛋白表达和定位进行跟踪的绿色荧光蛋白质（EGFP）基因,在目的蛋白插入位点和EGFP基因之间整合了凝血酶识别位点,便于融合蛋白纯化后目的蛋白与EGFP分离,在EGFP基因后面融合有6个组氨酸的密码子。结果表明,pMSL质粒能够在耻垢分枝杆菌中有效地表达绿色荧光蛋白,通过6个组氨酸尾,利用Ni—NTA亲和层析柱很好地被纯化。     

红麻Ms5基因的克隆及多转录本分析

为研究Ms5基因在红麻(Hibiscus canabius L.)花药中的转录特征,以L23A不育系为试材,基于已知的红麻Ms5基因5′端cDNA序列,采用3′RACE和RT-PCR技术对该基因全长cDNA序列进行克隆。序列比对分析结果表明,红麻花药组织中同时存在Ms5基因2种不同的转录本,其长度分别为972和1 105bp,依次命名为HcMs5-α和HcMs5-β。这2种转录本均包含了完整且一致的编码序列,其编码序列(CDS)全长为858bp,预测编码的蛋白质含有285个氨基酸残基,分子质量为32.4ku,理论等电点为7.62;两者5′端前972bp序列完全一致,但3′端的非编码区(UTR)长度有所不同,HcMs5-β在第972bp以后比HcMs5-α多出133bp的序列,具有选择性转录终止的特征。这种转录终止信号的可选择性可能与该基因转录后水平的调控有关。     

Cloning and multiple transcript analysis of Ms5 gene in kenaf(Hibiscus canabius L.)

为研究Ms5基因在红麻(Hibiscus canabius L.)花药中的转录特征,以L23A不育系为试材,基于已知的红麻Ms5基因5 ′端cDNA序列,采用3′RACE和RT-PCR技术对该基因全长cDNA序列进行克隆.序列比对分析结果表明,红麻花药组织中同时存在Ms5基因2种不同的转录本,其长度分别为972和1105 bp,依次命名为HcMs5-α和HcMs5 -β.这2种转录本均包含了完整且一致的编码序列,其编码序列(CDS)全长为858bp,预测编码的蛋白质含有285个氨基酸残基,分子质量为32.4 ku,理论等电点为7.62;两者5 ′端前972 bp序列完全一致,但3′端的非编码区(UTR)长度有所不同,HcMs5-β在第972 bp以后比HcMs5-α多出133 bp的序列,具有选择性转录终止的特征.这种转录终止信号的可选择性可能与该基因转录后水平的调控有关.     

广西沼泽型母水牛发情淡季生殖激素的变化规律研究

[目的]研究发情淡季母水牛生殖激素的变化规律及各激素之间的相互关系。[方法]采用酶联免疫分析方法(ELISA)测定了发情淡季广西沼泽母水牛血样中促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、抑制素(INH)、雌二醇(E2)和孕酮(P4)的浓度变化,并结合B超技术检测了母水牛卵泡在发情周期中的变化。[结果]广西沼泽型母水牛血样中E2和P4浓度呈波动式变化。其中,E2分别在排卵后第13天d下降到基础水平。FSH在排卵后的第10天出现峰值;LH在排卵前2天出现峰值;INH在排卵后第4天出现峰值。各种激素之间存在相关性。FSH、LH和INH三者两两之间存在极显著相关性,INH与E2、P4存在显著相关性,E2与P4存在极显著相关性。[结论]该研究可为指导适时配种、提高广西本地沼泽型母水牛的繁殖力提供理论参考。     

佐剂在兽医上的应用 Ⅱ.特异性佐剂

1 分枝菌许多实验证明结核性损害提高了机体对抗原的免疫反应.这些发现导致了弗氏佐剂(FCA)的发展和不同分枝杆菌及分枝杆菌碎片佐剂性质的研究.分枝菌,特别是牛结核分枝菌——卡介苗(BCG)在动物和人的癌症免疫学治疗中已被广泛地研究了。1.1 弗氏佐剂(FCA) 由活的或杀死的结核杆菌和矿物油组成.当特异抗原与FCA结合时,免疫反应优化,但在注射部位引起强烈的炎症反应,仅限于实验动物使用.     

C-terminal signal sequence promotes virulence factor secretion in Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis uses the ESX-1/Snm system [early secreted antigen 6 kilodaltons (ESAT-6) system 1/secretion in mycobacteria] to deliver virulence factors into host macrophages during infection. Despite its essential role in virulence, the mechanism of ESX-1 secretion is unclear. We found that the unstructured C terminus of the CFP-10 substrate was recognized by Rv3871, a cytosolic component of the ESX-1 system that itself interacts with the membrane protein Rv3870. Point mutations in the signal that abolished binding of CFP-10 to Rv3871 prevented secretion of the CFP-10 (culture filtrate protein, 10 kilodaltons)/ESAT-6 virulence factor complex. Attachment of the signal to yeast ubiquitin was sufficient for secretion from M. tuberculosis cells, demonstrating that this ESX-1 signal is portable.     

结核分枝杆菌RD1区T细胞表位分布情况预测及分析

[目的]对结核分枝杆菌RD1区T细胞表位分布情况进行预测和分析。[方法]利用NetMHC server生物信息学软件,以和HLA-Ⅱ和HLAⅠ-类分子结合能力为指标,分别对结核分枝杆菌RD1区9个编码蛋白进行T细胞抗原表位预测。[结果]通过预测,共获得和HLA-Ⅱ类分子结合的抗原表位1 580个和HLA-Ⅰ类分子结合的抗原表位336个。[结论]预测获得的T细胞抗原表位将对结核病特异性检测及新的结核疫苗研发起到借鉴作用。     

结核分枝杆菌RD1区T细胞表位分布情况预测及分析

[目的]对结核分枝杆菌RD1区T细胞表位分布情况进行预测和分析。[方法]利用NetMHC server生物信息学软件,以和HLA-Ⅱ和HLA-Ⅰ类分子结合能力为指标,分别对结核分枝杆菌RD1区9个编码蛋白进行T细胞抗原表位预测。[结果]通过预测,共获得和HLA-Ⅱ类分子结合的抗原表位1580个和HLA-Ⅰ类分子结合的抗原表位336个。[结论]预测获得的T细胞抗原表位将对结核病特异性检测及新的结核疫苗研发起到借鉴作用。     

Granuloma-specific expression of Mycobacterium virulence proteins from the glycine-rich PE-PGRS family

Pathogenic mycobacteria, including the agent of tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, must replicate in macrophages for long-term persistence within their niche during chronic infection: organized collections of macrophages and lymphocytes called granulomas. We identified several genes preferentially expressed when Mycobacterium marinum, the cause of fish and amphibian tuberculosis, resides in host granulomas and/or macrophages. Two were homologs of M. tuberculosis PE/PE-PGRS genes, a family encoding numerous repetitive glycine-rich proteins of unknown function. Mutation of two PE-PGRS genes produced M. marinum strains incapable of replication in macrophages and with decreased persistence in granulomas. Our results establish a direct role in virulence for some PE-PGRS proteins.     

29种中药提取物抗结核药物敏感性研究

本研究选取29种对结核分支杆菌和其他呼吸疾病有治疗作用生长在中国的药用植物,通过MABA (Microdilution alamar blue assay) 药敏实验方法检测了这些药物的乙醇和水提取物对结核分支杆菌M. tuberculosis H37Rv的敏感性。筛选到金银花、大蓟、小蓟和水车前等有显著的抗结核活性,为进一步考查其单体化合物的作用机制和有新型作用机制的抗结核药物开发打下基础。     

抗牛型结核分支杆菌单克隆抗体的制备和鉴定

运用杂交瘤细胞技术,以牛型结核分支杆菌免疫Balb/c小鼠,用其超声波裂解液筛选杂交瘤细胞,得到了2株能稳定分泌抗牛型结核杆菌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5D4和4C3,并对它们的特性作了初步鉴定.经鉴定,2株单克隆抗体均为IgG1亚类.腹水经ELISA检测,效价可达1∶1×104~1∶1×105,同时分析了2株单抗的抗原位点,结果表明2株单抗针对不同的抗原位点.单抗的特异性试验结果显示,2株单抗与大肠杆菌,沙门氏菌,金黄色葡萄球菌等均没有反应,但都与人型结核分支杆菌有不同程度的交叉反应.并应用免疫胶体金技术制备牛结核杆菌胶体金快速诊断试纸条做应用性鉴定.该试纸条只与结核杆菌发生反应,而不与沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、李氏杆菌等发生交叉反应.该试纸条最低能检测出浓度为1×106个/mL的牛结核杆菌菌液,有较高的灵敏度.