山羊体细胞重编程过程中慢病毒对细胞的毒性作用

[目的]检测慢病毒对普通山羊、克隆奶山羊和转基因克隆奶山羊的作用.[方法]采用慢病毒作为载体感染普通山羊、克隆奶山羊(♂12001)和转基因克隆奶山羊(♀12003)体细胞,通过细胞生长曲线,检测慢病毒对3种山羊细胞的毒性作用.[结果]感染后的3种体细胞在感染前3 d,细胞大量凋亡,4~7 d筛选出的细胞大量增殖.未经慢病毒感染的3种细胞接种2 d后数量开始明显增加,第25天进入对数生长期,第57天进入平台期,呈现典型的"潜伏期-对数生长期-停滞期"生长模式.[结论]慢病毒对细胞有毒性作用,会引起细胞大量凋亡.     

慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10~6 TU·mL~(-1)之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显, sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。     

慢病毒法生产转基因鸡的初步研究

[目的]探索利用慢病毒生产转基因鸡的适宜方法。[方法]以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建慢病毒载体,包装病毒后感染鸡早期受精卵,并检测不同注射操作和不同接种滴度对鸡胚存活率的影响,同时对接种病毒鸡胚的GFP表达情况进行检测。[结果]采用105、106和107IU/ml的慢病毒滴度,鸡胚孵化率分别为87%、72%和66.7%。以雏鸡血液基因组为模板PCR鉴定转基因阳性率为45.5%;冰冻切片技术发现GFP基因在鸡体内不同组织的表达强度差异显著,免疫系统内表达最强,生殖系统和肌肉组织中GFP基因无表达。[结论]试验初步筛选出较适宜的慢病毒感染滴度,该结果为研制蛋鸡生物反应器和转基因鸡抗病新品系奠定了基础。     

猪口蹄的发病特点和防控方法

猪口蹄疫是猪只感染口蹄疫病毒引发的急性、热性传染病,具有起病急、传播快、死亡率高的特点。世界动物卫生组织界定为A类动物疫病,我国界定为一类动物传染病。由于猪口蹄疫的危害性较大,必须引起高度重视。本文从口蹄疫病毒病原特点、流行特点、临床症状、病理变化、治疗措施和防控方法,为有效预防猪口蹄疫病毒感染奠定理论基础。     

慢病毒法生产转基因鸡的初步研究(英文)

[目的]探索利用慢病毒生产转基因鸡的适宜方法。[方法]以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建慢病毒载体,包装病毒后感染鸡早期受精卵,并检测不同注射操作和不同接种滴度对鸡胚存活率的影响,同时对接种病毒鸡胚的GFP表达情况进行检测。[结果]采用105、106和107IU/ml的慢病毒滴度,鸡胚孵化率分别为87%、72%和66.7%。以雏鸡血液基因组为模板PCR鉴定转基因阳性率为45.5%;冰冻切片检测技术发现GFP基因在鸡体内不同组织的表达强度差异显著,免疫系统内表达最强,生殖系统和肌肉组织中GFP基因无表达。[结论]试验初步筛选出较适宜的慢病毒感染滴度,该结果为研制蛋鸡生物反应器和转基因鸡抗病新品系奠定了基础。     

表达sFat-1基因慢病毒载体的构建及病毒生产

为了建立有效地用于转基因动物生产的慢病毒表达系统,以线虫C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)为目的基因构建了慢病毒表达载体,通过与慢病毒包装载体PLP1、PLP2和PLP/VSVG一起共转染293FT细胞系生产了慢病毒颗粒,并对其感染哺乳动物细胞NIH3T3细胞系的能力进行了检测。结果表明,该系统所生产的病毒滴度约为5.0×106TU/mL,这种病毒能够感染哺乳动物细胞,说明构建的慢病毒表达系统是有效的,应用其可以生产感染力良好的慢病毒颗粒,并高效地进行sFat-1基因转移。     

犬细小病毒病的剖析

近几年,由于饲养纯种犬、名贵犬的人越来越多,同时,犬的疾病也越来越多,通过广泛的进行疫苗注射,犬的一些病毒性疾病虽然已得到较好地控制。但犬细小病毒病是由犬细小病毒感染引起的一种以频繁呕吐、剧烈腹泻、出血性肠炎和白细胞显著减少特征的急性、热性、接触性传染病,一直没有得到有效地根治,从生产实践和临床治疗来看,细小病毒感染是犬科动物最常见的、最主要的病毒性疾病之一,是动物细小病毒的典型代表。     

鸡冠状病毒病的防治

鸡传染性支气管炎是鸡惟一的一种冠状病毒病,是由冠状病毒科冠状病毒属鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的。该病1931年首先报道于美国,1972年传入我国,现在全国各地均有其踪迹。2003年5月下旬,我国农业部动物冠状病毒疫源调查组已指出,人类“非典”病毒与鸡(家禽)的冠状病毒病无关。尽管如此,由于此病对养鸡业危害较大,仍应高度重视其防治工作。⒈病原特性:鸡传染性支气管炎病毒重组变异较快,目前其血清型全世界已有30多种。只传染鸡,不同年龄的鸡均可感染。⒉流行特点:病鸡为主要传染源,病毒在病鸡粪便中可存活12~56天。病鸡的粪便、口鼻…     

慢病毒活体介导精原干细胞生产转基因小鼠

【目的】用慢病毒在体内感染精原干细胞,建立转基因动物生产技术平台。【方法】用三质粒慢病毒载体系统转染293T细胞包装慢病毒,转染后裂解细胞,收集携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒。将慢病毒液注射到小鼠曲细精管,获得F0代小鼠,制备小鼠睾丸组织切片,进行免疫双荧光检测。将F0代小鼠与野生型母鼠交配,获得F1代小鼠,PCR检测F1代是否为转基因小鼠。【结果】通过裂解细胞的方法成功制得慢病毒,将其注射到小鼠曲细精管,获得了10只F0代小鼠,经免疫双荧光检测,发现慢病毒可在活体上感染精原干细胞。8只F0代小鼠与野生型母鼠交配后共获得了41只F1代小鼠,经PCR检测,21只携带慢病毒基因片段,转基成功率为51.22%,表明慢病毒介导的基因改造是可遗传的。【结论】建立了一种操作简单、花费少、易于实施的慢病毒活体介导精原干细胞生产转基因小鼠的技术体系,该技术也可以推广到其他动物上,对于加速功能基因鉴定、疾病模型构建和家畜转基因育种等领域的研究有促进作用。     

浅谈犬细小病毒病的诊治

正犬细小病毒病是由细小病毒科细小病毒属的犬细小病毒引起的一种急性传染病。犬细小病毒对犬有高度的接触性传染性,各种年龄的犬均可感染,以刚断乳至90日龄的犬发病比较多,病情会较严重。被细小病毒感染后的犬,在临床上可分为出血性肠炎型和非化脓性心肌炎型。犬细小病毒病已经成为危害宠物犬健康的一个重要疾病,其发病率为20%~100%,死亡率为10%~60%,但在精心治疗与护理下死亡率可     

人B7-H4慢病毒表达载体的构建

目的构建人B7-H4慢病毒表达载体。方法将RT-PCR扩增的B7-H4基因全长编码序列克隆到慢病毒转移载体,通过脂质体转染293细胞,包装成人B7-H4慢病毒颗粒。RT-PCR、流式细胞术和Western blot鉴定B7-H4在重组慢病毒感染293细胞中表达,50%组织培养感染剂量法（TCID50法）检测重组慢病毒滴度。结果成功构建了pMD18-T-hB7-H4质粒和pEZ-Lv105-hB7-H4质粒。基因测序分析证实人B7-H4编码序列成功整合到质粒载体。TCID50法测定Lenti-hB7-9H4慢病毒滴度为1.7×10^9 copies/mL。RT-PCR、流式细胞术和Western blot证实Lenti-hB7-H4慢病毒转染细胞后可有效表达人B7-H4 mRNA和蛋白质。结论成功构建了表达人B7-H4的慢病毒颗粒。     

鸡传染性法氏囊病的诊疗体会

鸡传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病毒感染引起雏鸡的急性、高度接触性传染性疾病,以法氏囊发炎坏死萎缩和法氏囊的淋巴细胞受到严重损害为主要特征。由于该种病毒主要攻击的鸡群的免疫器官,导致身体免疫机能出现障碍,免疫能力受到干扰而引起发病疾病传播。本文主要就一起鸡传染性法氏囊病的发病经过、临床症状、病理学变化、实验室诊断方法与防治手段这种分析,希望通过本次具体案例研究,对更好防控该种病毒疾病有一定帮助。     

慢原甲藻研究进展

慢原甲藻(Prorocentrum rhathymum)是一种有毒甲藻,有报道称其会形成赤潮,不但可能危害海洋生态平衡,还会通过海洋食物链的富集威胁人类健康。对慢原甲藻形态学、生态学、生理学、毒理学等方面的研究进展进行综述,指出开展我国南海慢原甲藻研究的必要性与重要意义,并对其发展方向进行了展望。     

慢病毒介导EGFP在小鼠胚胎的体外表达

为探讨3种感染方法对不同发育阶段胚胎中EGFP基因表达影响,利用透明带下注射法、胞质内注射法及透明带切口与慢病毒共培养法感染1-细胞期小鼠胚胎,分别提取以上3种方法感染慢病毒的不同发育阶段胚胎的EGPF基因,并以其为模板,扩增出630bp的EGPF基因片段。结果表明:慢病毒转染后在不同发育阶段的胚胎中,均扩增出EGFP目的片段(630bp)。当透明带下注射病毒时,90p L注射组(C组)和60p L注射组(B组)的EGFP基因阳性率显著优于30p L注射组(A组)(p0.05)。当胞质注射病毒时,C组显著优于其他组(p0.05),但胚胎发育的后期A组和B组差异不显著(p0.05)。透明带做切口的胚胎与含不同浓度慢病毒共培养时,从1-细胞期到4-细胞期胚胎为止组间差异不显著(p0.05),而胚胎发育的后期2×103cfu·μL~(-1)组和3×103cfu·μL~(-1)组均极显著优于1×103cfu·μL~(-1)组(p0.01),但2×103cfu·μL~(-1)组和3×103cfu·μL~(-1)组间差异不显著(p0.05)。透明带下注射慢病毒与胞质内注射慢病毒时,注射90p L(病毒滴度3×103cfu·μL~(-1))组的EGFP基因体外表达效果最好;透明带做切口的胚胎与含不同浓度慢病毒共培养时,在3×103cfu·μL~(-1)滴度培养液中培养的EGFP基因体外表达效果最好。     

慢病毒介导PNX沉默细胞株的构建与鉴定

[目的]构建慢病毒介导的PNX沉默载体,感染GnRH分泌细胞(GT1-7)后进行筛选鉴定,获得稳定的PNX沉默细胞株。[方法]结合RNAi干扰技术构建出慢病毒沉默载体,在293T细胞中包装病毒并测定滴度。感染GnRH分泌细胞(GT1-7),嘌呤霉素筛选得到稳定细胞后利用Real-time PCR和Western blot检测PNX沉默效果。[结果]慢病毒介导的PNX沉默载体构建成功,包装的慢病毒成功感染GT1-7细胞,并且Real-time PCR和Western blot证实了PNX沉默细胞株的PNX沉默效果。[结论]成功构建了慢病毒介导的PNX沉默细胞株,为以后探索PNX对动物生殖发育的作用打下了基础。     

犬瘟热和犬细小病毒病的治疗原则

犬瘟热和犬细小病毒病都是由病毒引起的急性接触性传染性疾病，始终是威胁养犬业和毛皮动物养殖业的两大杀手。这两种传染病的发生没有明显的季节性，但以冬、春的寒冷季节多发。这两种病虽然在临床症状上有所区别，但也有相似之处，比如都有呕吐、腹泻现象，并且同是病毒感染，发病季节、发病年龄以及传染性上有很大的相似性，在临床上还可能出现这两种病同时混合感染的情况。     

睾丸注射慢病毒生产转基因鸡的研究

【目的】采用睾丸注射慢病毒的方法生产转基因鸡以提高转基因效率,使转基因鸡的批量生产变得简单可行。【方法】用磷酸钙沉淀法包装慢病毒,对慢病毒包装体系中的质粒总量和HN Buffer的pH值进行优化,以包装出滴度较高的慢病毒;然后将慢病毒注射到受精鸡蛋的胚胎中验证其活性;最后,将慢病毒注射到8日龄公鸡的睾丸内,待其性成熟以后,将精液DNA呈阳性的公鸡与非转基因母鸡进行交配生产出转基因鸡。【结果】当90mm培养皿中质粒总量为50μg、HN Buffer的pH值为7.05时慢病毒的包装效率最高,在该条件下包装出的慢病毒滴度高达7.5×107 TU/mL;采用慢病毒胚胎注射途径成功地生产出增强绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)转基因鸡;采用慢病毒睾丸注射途径生产的转基因鸡后代中能检测到eGFP目的基因,但未检测到其相关的表达。【结论】慢病毒睾丸注射途径能够将外源基因整合到精原干细胞中,并遗传给后代。     

昭通市马铃薯病毒病发生情况分析

为了解昭通市马铃薯种薯质量及生产中病毒病发生情况，在马铃薯主产区昭阳区、大关县、鲁甸县、镇雄县、彝良县、巧家县采集具有典型病毒病症状的样品、疑似病毒样品和随机无症状样品共计90个。应用DAS-ELISA方法检测6种马铃薯主要病毒PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA。结果表明，各县区样品普遍有病毒感染，其中PVA检出率最高，PVS最低。不同级别种薯病毒发病率最高的为PVA,最低的为PVS。其中感染率表现为原原种<原种<商品薯。因此推广马铃薯脱毒种薯是马铃薯病毒病防治的重要方法，同时在生产中主要以预防为主，通过减少蚜虫等传毒媒介对病毒的传播来减少病毒对马铃薯的危害。     

草莓无病毒苗的培育

草莓植株非常容易受病毒的感染,在生产实践中经常发现植株逐渐矮化,产量降低,果实变小,品质变劣等现象,这些都是由于病毒的侵染造成的.据调查,我国草莓产区主要品种已受到草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓镶脉病毒、草莓皱缩病毒等病毒感染.目前,草莓病毒病还没有药剂可以防治.国内外的实践均表明,通过组织培养获得无病毒苗是防治草莓病毒病的主要措施.     

精子与慢病毒共孵育条件的优化以及转基因猪的制备

【目的】探索慢病毒与精子共孵育的方法,并制备转基因猪。【方法】采用正交试验分析精子密度、病毒量、精子与慢病毒共孵育时间、精子与慢病毒共孵育温度对精子活力的影响,采用PCR和Southern blotting检测转基因。【结果】①优化慢病毒与精子共孵育条件为：100 µL慢病毒原液（5×105cfu）与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min;②与病毒孵育后的精子（109个/mL）给母猪人工授精时,经PCR检测49头仔猪中有14头呈阳性;③Southern blotting结果表明,8头PCR阳性仔猪中,4头融合了外源基因。【结论】优化了精子与慢病毒共孵育的条件（100 µL慢病毒原液（5×105cfu）与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min）,成功制备了转基因猪,并检测有外源基因的融合。