鸡肌腱干细胞的分离培养与初步鉴定

为了建立鸡肌腱干细胞的分离培养体系和鉴定方法,试验使用Ⅰ型胶原酶消化20日龄鸡胚肌腱组织,低密度接种得到鸡肌腱干细胞,用结晶紫染色细胞克隆团块,选择50,500,5 000个/cm~2密度接种7~10 d,镜下观察细胞形态,用细胞计数仪测定细胞增殖能力,用分化诱导试剂对细胞进行成脂与成骨分化诱导,采用油红O和碱性磷酸酶进行染色鉴定。结果表明:原代细胞及传代细胞为长梭形,接种7~10 d后开始形成克隆团块,细胞生长曲线呈S型。500个/cm~2的细胞密度接种细胞克隆能力与增殖能力最强;将该密度接种细胞消化后,按1×10~4个/cm~2接种,分别对其进行成脂与成骨诱导,可发现成脂分化过程中有脂滴形成,油红O染色呈阳性;成骨分化过程中有钙结节形成,碱性磷酸酯酶染色呈阳性。说明消化20日龄鸡胚肌腱组织可成功分离出鸡肌腱干细胞,克隆增殖能力强,且具有分化多种细胞的潜能。     

荷斯坦奶牛乳腺干细胞的成脂诱导及鉴定

为了探究荷斯坦奶牛乳腺干细胞的多向分化潜能,试验采用油红O染色法对第5代乳腺干细胞向脂肪细胞分化的情况进行鉴定,采用RT-PCR技术对诱导后的乳腺干细胞进行基因水平检测。结果表明:荷斯坦奶牛乳腺干细胞经成脂诱导后,细胞中出现油滴,经油红O染色呈阳性;诱导后脂肪细胞标记性基因LPL和PPARG呈阳性表达。说明荷斯坦奶牛乳腺干细胞具有分化为成脂肪细胞的潜能。     

绵羊骨髓间充质干细胞分离培养与鉴定

旨在分离绵羊骨髓间充质干细胞(sheep bone marrow mesenchymal stem cells, SBMSC),建立绵羊骨髓间充质干细胞系,为相关研究提供种子细胞。取新生健康绵羊肋骨为试验材料,利用贴壁法分离获得SBMSC;取生长良好的P3代细胞通过免疫荧光,进行CD73、CD90、CD105、CD106表型鉴定;取生长良好的P3代细胞分别进行成软骨、成脂、成骨方向的诱导,对诱导结果分别进行阿利新蓝、油红O和茜素红染色,鉴定分化结果。SBMSC呈成纤维样贴壁生长;体外培养P3代细胞表面标记物CD73、CD90、CD105和CD106完全符合标准;P3代细胞经软骨、脂肪、骨方向诱导3周后,经阿利新蓝染色,细胞呈亮蓝色;经油红O染色,细胞质内出现橙红色脂滴;茜素红染色表明聚集的细胞团中央能形成钙化结节。说明SBMSC经体外诱导培养后可向软骨细胞、脂肪细胞和成骨细胞分化,并具有明显的成软骨、成脂和成骨表型,表明SBMSC具有多向分化潜能。通过贴壁培养法建立了SBMSC完整的体外培养体系,为绵羊育种等方面提供种子细胞。     

蒙古羊骨髓间充质干细胞的分离培养及多向诱导分化

本研究旨在建立蒙古羊骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)体外分离、纯化、增殖方法,诱导其向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。穿刺法抽取蒙古羊骨髓组织,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化BMSC,增殖,并测定其生长曲线及细胞倍增时间。对第3代蒙古羊BMSC进行成脂、成骨及成软骨诱导,观察诱导后的细胞形态。采用油红O、茜素红、HE等染色法在组织学水平对BMSC进行成脂、成骨和成软骨分化鉴定。结果显示,蒙古羊BMSC呈现均一梭形成纤维细胞样生长,生长曲线呈S型,生长增殖能力良好。在不同分化诱导之后,细胞呈现脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞的表型特征。表明获得的蒙古羊BMSC具有多向分化潜能,所分离细胞确为骨髓间充质干细胞。     

内蒙古绒山羊毛囊干细胞的成神经诱导及初步鉴定

本研究旨在探究内蒙古绒山羊毛囊干细胞的成神经诱导及初步鉴定。实验采用尼氏染色法对毛囊干细胞向神经细胞分化的情况进行鉴定,利用RT-PCR技术对诱导后的毛囊干细胞进行基因水平检测。结果表明:内蒙古绒山羊毛囊干细胞经成神经诱导后,细胞中有类似神经元的细胞出现,并且细胞周围出现许多微管样的结构,经尼氏染色呈阳性。诱导后神经细胞标记基因β-TubulinⅢ和NSE呈阳性表达,表明内蒙古绒山羊毛囊干细胞具有分化为神经细胞的潜能。     

南阳牛骨髓间充质干细胞的分离培养及多向分化

本研究旨在建立南阳牛骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法,在此基础上研究其生物学特性和多向分化的能力。采用骨髓穿刺法取3月龄小牛的肋骨骨髓,分离培养BMSCs,传代培养并测定其生长曲线,RT-PCR检测Oct4、Nanog、Sox2基因的表达,然后取P3 BMSCs分别向神经和脂肪细胞进行诱导分化,并利用组织学染色技术和RT-PCR技术进行鉴定。结果表明,分离得到的BMSCs大小均匀,多呈梭形的成纤维细胞样生长;RT-PCR可检测到干细胞因子Oct4、Nanog、Sox2的表达;不同代次细胞生长曲线呈S型,一般在第3天时进入指数生长期,第7天后进入平台期;成神经诱导后,甲苯胺蓝染色可见明显的尼氏体结构,RT-PCR检测ENO2和GFAP基因表达呈阳性;成脂肪诱导后,油红O染色后可见大量的脂滴存在,RT-PCR检测Leptin和PPAR基因表达呈阳性。试验证明,成功分离得到了南阳牛BMSCs,且其具有多向诱导分化潜能。     

盘羊脐带间充质干细胞的分离培养及诱导分化

试验旨在研究野生盘羊脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs）的分离、培养及体外多向分化潜能等生物学特性。取盘羊分娩后的新生雄性胎儿脐带,采用组织块培养法分离盘羊UC-MSCs后进行体外培养,并对UC-MSCs进行成骨、成软骨和成脂诱导分化,检测其多向分化潜能。结果显示,应用组织块培养法获得的盘羊UC-MSCs具有UC-MSCs特有的呈簇、成纤维状的特性,细胞呈"S"型曲线生长,细胞的倍增时间平均为33.50 h,且可以向成骨细胞、成软骨细胞和成脂细胞分化。诱导分化特异性染色结果表明,野生盘羊UC-MSCs经诱导后的成骨细胞经茜素红S染色呈现典型的橙红色钙沉积物聚集,成软骨细胞经阿利新蓝染色呈现蓝色的软骨基质,成脂细胞经油红O染色呈现深红色的脂滴。实时荧光定量PCR检测结果发现,随着诱导时间的延长,成骨分化的细胞中骨内γ-羧基谷氨酸蛋白（BGLAP）、骨桥蛋白基因（OPN）、Runt相关转录因子2（RUNX2）基因的相对表达量极显著升高（P<0.01）;成软骨分化的细胞中光蛋白聚糖（LUM）基因的表达量明显增加,而双糖链蛋白多糖（BGN）和Y染色体性别决定区基因盒9（SOX9）基因表达量极显著提高（P<0.01）;成脂分化的细胞中脂蛋白酶（LPL）和过氧化物酶体增殖因子活化受体γ（PPAR-γ）基因的相对表达量极显著上升（P<0.01）。试验结果表明,用盘羊胎盘附带的脐带组织可以分离到盘羊UC-MSCs,且分离到的UC-MSCs具有分化为成骨细胞、成软骨细胞及成脂细胞等多向分化潜能。     

绒山羊羔羊和成年羊前体脂肪细胞的原代培养及传代方法

本试验主要探索绒山羊羔羊和成年羊前体脂肪细胞的培养及传代方法,为研究绒山羊的脂肪代谢机理提供细胞模型。以3月龄阿尔巴斯白绒山羊羔羊肾周脂肪组织为试验材料,采用胶原酶法直接得到羔羊前体脂肪细胞,结合其细胞形态观察、生长曲线和油红O染色进行鉴定;以绒山羊成年羊肾周脂肪组织为试验材料,采用胶原酶法和"天花板"法得到成熟脂肪细胞后,通过去分化得到前体脂肪细胞,诱导分化后利用油红O染色鉴定其向成熟脂肪细胞分化的情况。绒山羊羔羊肾周脂肪组织中前体脂肪细胞的适宜分离条件为0.1%Ⅰ型胶原酶、37℃消化1 h,250×g离心10 min;传代时分离细胞采用0.25%胰蛋白酶消化60 s。细胞形态为梭形,生长曲线呈"S"型,油红O染色结果呈阳性。成年羊采用和羔羊相同的胶原酶法获得成熟脂肪细胞后,通过改进的"天花板"法获得前体脂肪细胞,经诱导分化后,油红O染色结果呈阳性。综上,采用Ⅰ型胶原酶消化法可直接分离培养3月龄绒山羊羔羊的前体脂肪细胞;采用胶原酶法和改进后的"天花板"法分离培养成年绒山羊的前体脂肪细胞是可行的。     

崂山奶山羊脂肪间充质干细胞系的建立及鉴定

旨在建立崂山奶山羊脂肪间充质干细胞系并对其进行初步鉴定.采集崂山奶山羊脂肪组织,在Ⅰ型胶原酶的分解消化作用下,将脂肪组织中的单核细胞进行分离并扩增培养;测定其生长曲线,利用Real time RT-PCR技术对其表达的干细胞因子进行鉴定;将传至第3代的脂肪间充质干细胞进行成骨诱导分化,利用茜素红染色进行鉴定.结果显示,崂山奶山羊脂肪间充质干细胞形态为长梭形、星形等成纤维细胞样细胞形态,但比成纤维细胞饱满,第3代细胞生长至3 d左右时细胞进入指数生长期,生长至6~7 d时进入平台期;经成骨诱导分化后,经茜素红染色可见骨结节被染成深红色.综上提示,崂山奶山羊脂肪间充质干细胞具有诱导分化潜能.     

马脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性试验

为马的关节炎、肌腱和韧带损伤的临床治疗提供种子细胞,本试验通过采集马颈部脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶消化法分离脂肪间充质干细胞,并进行传代培养;绘制细胞生长曲线、测定细胞群体倍增时间;通过流式细胞术检测P3代细胞表面标记物,RT-PCR法扩增细胞表面标记物目的基因片段;油红O和茜素红染色法测定脂肪间充质干细胞的成脂和成骨诱导分化能力。结果发现:马脂肪间充质干细胞体外培养条件下呈长梭形和典型的旋涡状,生长状态良好、折光性强;经测定细胞生长曲线呈典型的"S"型,符合Logistic生长曲线规律;P3、P6和P9代细胞群体倍增时间分别为21.5 h、26 h、36 h;流式细胞术检测结果显示,P3代细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD44、CD90和CD105,不表达造血系细胞表面标志物CD45;PCR扩增得到CD44、CD90、CD105和CD73特异性目的片段;油红O和茜素红染色证明,马脂肪间充质干细胞具有成脂和成骨诱导分化能力。     

CRISPR系统促进脂肪干细胞成骨分化与抑制成脂分化的研究

本研究旨在优化组织培养法分离小鼠脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）,为研究成骨分化和成脂分化在间充质干细胞分化过程中的相互影响奠定基础。通过细胞形态学观察、细胞生长曲线和流式仪器检测所分离获得的间充质干细胞的特性,利用CRISPR-dCas9系统在快速促进间充质干细胞成骨分化的前提下观察其对成脂分化的影响,并通过生化染色、实时荧光定量PCR和免疫细胞学等手段进行分析。结果显示,接种3~5 d后可见细胞从组织块周围爬出,光镜下可见细胞形态多为成纤维细胞样的梭形细胞,且形态单一均匀,具有较高的爬出率,可以大大提高脂肪间充质干细胞的分离效率;通过CRISPR-dCas9系统激活Runx2和Osterix基因后可以促进间充质干细胞的成骨分化,实时荧光定量PCR及油红O染色结果显示,CRISPR-dCas9系统可以同时抑制间充质干细胞的成脂分化;通过CRISPR-dCas9-KRAB系统同时抑制成骨相关基因Runx2和Osterix后可以促进成脂分化。本研究利用组织贴壁法成功获得了高纯度的脂肪间充质干细胞,具有间充质干细胞的特性和分化能力;利用CRISPR系统可以同时过表达Runx2和Osterix两个基因,可以在进成骨分化的同时抑制成脂分化,表明成脂分化和成骨分化的相关性,为基因编辑在间充质干细胞诱导分化和临床应用方面提供了新的思路和方法。     

崂山奶山羊永生化骨髓间充质干细胞的诱导分化研究

为研究崂山奶山羊永生化骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导分化潜能,采用P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs进行体外成脂和成神经诱导分化。结果显示,当细胞传至P30代时,TERT-BMSCs生长旺盛;在成脂诱导后,P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs均能观察到细胞中透明脂滴的形成,油红O染料染色后可见脂滴被染成红色;在成神经诱导后,P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs均能形成树突样或三角形的形态,甲苯胺蓝染色后可观察到细胞中尼氏体的存在。综上提示,永生化的崂山奶山羊BMSCs在多次传代后仍具有较强的多向诱导分化能力,这为永生化MSCs的广泛应用提供了理论依据。     

胰岛素样生长因子结合蛋白3和胰岛素样生长因子结合蛋白5基因在内蒙古白绒山羊皮肤中的表达研究

本研究旨在探明胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor-binding protein,IGFBP)在内蒙古白绒山羊绒毛发育的不同生长阶段皮肤组织中的表达变化情况。试验采用实时荧光定量PCR技术,对内蒙古白绒山羊绒毛生长发育的各个时期皮肤中IGFBP-1~IGFBP-6基因的表达进行了测定,并通过埋植褪黑素组改变绒毛生长周期的研究,来鉴定IGFBP-1~IGFBP-6基因中高表达的结合蛋白的作用。结果表明,IGFBP-3和IGFBP-5在绒山羊绒毛生长发育的各个时期的皮肤组织中均有表达,但是IGFBP-5的表达相对于IGFBP-3的表达具有很强的规律性。结果提示,在内蒙古白绒山羊的绒毛发育过程中,IGFBP-5可能是一个主要的调控因子。     

Wnt10b参与外源褪黑激素促进绒山羊绒毛生长的研究

本实验旨在研究Wnt10b在内蒙古成年绒山羊皮肤中的表达变化规律和褪黑激素(MT)对其表达量的影响。每隔1个月按照2 mg/kg BW的剂量在受试内蒙古成年绒山羊耳后皮下埋植MT。连续采集12个月(从2009年8月到2010年7月)的肩胛部皮肤样品,应用实时荧光定量PCR技术检测Wnt10b的表达量。结果表明:Wnt10b在内蒙古成年绒山羊皮肤组织中毛囊生长中期和休止前期高表达;埋植MT提高了Wnt10b在内蒙古成年绒山羊皮肤组织中毛囊休止期和退行期的表达量。结果提示,Wnt10b参与内蒙古绒山羊毛囊生长的信号传递过程,并在退行期和休止期转变过程中发挥作用;Wnt10b参与了外源MT促绒毛生长的毛囊周期性变化过程。     

Impact of source tissue and ex vivo expansion on the characterization of goat mesenchymal stem cells

Background: There is considerable interest in using goats as models for genetically engineering dairy animals and also for using stem cells as therapeutics for bone and cartilage repair. Mesenchymal stem cells(MSCs) have been isolated and characterized from various species, but are poorly characterized in goats.Results: Goat MSCs isolated from bone marrow(BM-MSCs) and adipose tissue(ASCs) have the ability to undergo osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation. Cytochemical staining and gene expression analysis show that ASCs have a greater capacity for adipogenic differentiation compared to BM-MSCs and fibroblasts. Different methods of inducing adipogenesis also affect the extent and profile of adipogenic differentiation in MSCs. Goat fibroblasts were not capable of osteogenesis, hence distinguishing them from the MSCs. Goat MSCs and fibroblasts express CD90, CD105, CD73 but not CD45, and exhibit cytoplasmic localization of OCT4 protein. Goat MSCs can be stably transfected by Nucleofection, but, as evidenced by colony-forming efficiency(CFE), yield significantly different levels of progenitor cells that are robust enough to proliferate into colonies of integrants following G418 selection.BM-MSCs expanded over increasing passages in vitro maintained karyotypic stability up to 20 passages in culture,exhibited an increase in adipogenic differentiation and CFE, but showed altered morphology and amenability to genetic modification by selection.Conclusions: Our findings provide characterization information on goat MSCs, and show that there can be significant differences between MSCs isolated from different tissues and from within the same tissue. Fibroblasts do not exhibit trilineage differentiation potential at the same capacity as MSCs, making it a more reliable method for distinguishing MSCs from fibroblasts, compared to cell surface marker expression.     

Myogenic and adipogenic properties of goat skeletal muscle stem cells

The aims of the present study were to establish a culture system for goat skeletal muscle stem cells and to examine their myogenic and adipogenic properties in vitro. Cells were isolated from the skeletal muscle of the Shiba goat and cultured in vitro. Most of the cells were positive for myogenic markers, such as Pax7, MyoD, and desmin, and immunocytochemistry revealed they differentiated to form myotubes expressing myosin heavy chain, indicating they were highly myogenic. Myogenic differentiation was strongly suppressed by the addition of basic fibroblast growth factor, while proliferation was unaffected. When the cells were cultured in adipogenic differentiation medium, some of the cells differentiated into mature adipocytes that stained with Oil Red-O. These cells were immunocytochemically positive for adipogenic markers, including peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPAR gamma) and CCAAT/enhancer-binding protein-alpha (C/EBP alpha). These results clearly demonstrate the presence of both myogenic and adipogenic stem cells in goat skeletal muscle.     

绒山羊毛囊发育中非编码RNA的研究进展

非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是指从基因组上转录而来,不编码蛋白质,但在RNA水平上能行使一定生物学功能的RNA。非编码RNA的种类较多,种类的不同造成功能的差异。毛囊是绒山羊皮肤特殊的附属物,位于皮肤的真皮层,发生于绒山羊胚胎期。由于真皮细胞和上皮细胞间的信号分子传递,使其发育呈周期性变化,历经生长期、退行期和休止期。近年来,有关ncRNA在绒山羊毛囊发育中作用报道较多。文章就其中的微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)及环状RNA(circRNA)的生物发生及其在绒山羊毛囊发育中的作用机制进行了归纳、总结。miRNA是真核生物中存在的一种长18～25 nt的ncRNA分子,可通过与靶信使核糖核酸mRNA特异结合,抑制转录后基因表达。在绒山羊毛囊发育中,miRNA通过抑制相关基因及相关信号通路中关键分子的表达而调控毛囊的发育周期以及毛囊的再生能力。lncRNA是长度超过200 nt的ncRNA,经过剪接,具有polyA尾巴与启动子结构,在绒山羊毛囊发育中能促进毛囊细胞增殖与分化,通过调控基因的靶向表达与多种信号通路互作调节毛囊发育及绒毛生...     

不同浓度褪黑素刺激对内蒙古绒山羊毛囊干细胞增殖活性的影响

试验旨在探究不同浓度褪黑素刺激对内蒙古绒山毛囊干细胞增殖活性的影响.采用0 (对照组)、100、300、500、700 pg/mL 5个浓度梯度分别对内蒙古绒山羊毛囊干细胞连续刺激5 d,MTT法分别检测各组细胞活性.结果表明,不同浓度褪黑素刺激2 d后,相较于对照组 (0 pg/mL),褪黑素刺激组未见成团细胞出现,开始出现长梭形细胞且细胞生长不再均一,各刺激组均表现出较高的增殖活性;刺激4 d后,500 pg/mL褪黑素刺激组毛囊干细胞增殖活性显著高于0、100 pg/mL (P<0.01;P<0.05),但与700 pg/mL褪黑素刺激组差异不显著 (P>0.05).因此,500 pg/mL是内蒙古绒山羊毛囊干细胞增殖的最适浓度.