鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗轻链可变区基因的克隆与序列测定

将已扩增出的鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗轻链可变区基因进行纯化,并用纯化的基因片段与pMD-18T载体连接,将重组载体转化于感受态细胞JM109,筛选出阳性重组子,提取阳性重组子质粒并进行测序,得到特异性单抗轻链可变区的基因序列。为鸡堆型艾美耳球虫特异性单链抗体基因的构建奠定了基础。     

鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗重链可变区基因的克隆与测序

提取堆型艾美耳球虫子孢子杂交瘤细胞总RNA,进行RT PCR,扩增出重链可变区基因。将已扩增出的鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗重链可变区基因片段与pMD 18T载体连接,重组载体转化于感受态细胞JM109,筛选出阳性重组子,提取阳性重组子质粒并进行测序,得到单抗重链可变区的基因序列,为单链抗体基因的构建及免疫毒素的构建奠定了基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫HAP2基因的克隆与生物信息学分析

为研究鸡柔嫩艾美耳球虫HAP2(Hapless2/generative cell-specific)基因的抗原性,根据GenBank发表的HAP2基因的cDNA序列ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫配子体总RNA中扩增HAP2基因,将扩增产物与pMD18-T载体连接后进行测序和序列分析,同时应用生物信息学软件对HAP2基因表达蛋白的结构域和在柔嫩艾美耳球虫生活史的各阶段表达情况进行预测。结果获得867 bp的目的基因扩增片段,经同源性分析比较柔嫩艾美耳球虫HAP2基因与其他艾美耳球虫种HAP2基因同源性在70%以上,该基因所表达的蛋白主要在球虫配子生殖阶段的配子体和未孢子化的卵囊中表达。说明HAP2基因具有作为传播阻断疫苗的候选抗原的可行性。     

鸡堆型艾美耳球虫单链抗体基因的构建及表达

轻链可变区和重链可变区基因产物等摩尔浓度混合后,用重叠延伸拼接法扩增出单链抗体基因,再用带限制性内切酶位点的引物(NcoⅠ和HindⅢ)扩增出带有特定酶切位点的单链抗体基因片段.NcoⅠ和HindⅢ双酶切单链抗体与表达载体pET-22b( ),用回收试剂盒回收酶切后的单链抗体与表达载体pET-22b( )基因片段,用连接试剂盒将单链抗体与表达载体pET-22b( )基因片段连接,并将连接产物转化感受态细胞JM109.氨苄青霉素筛选阳性重组子.以T7promoter/T7terminator primer进行茼落PCR鉴定,测定正确后,37℃摇菌扩增,测菌浓度至D600为0.6时,加入IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE初步检测.SDS-PAGE检测显示其相对分子质量是31 000,与预期结果一致,证明单链抗体基因在大肠杆菌中得到表达.     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株的选育

用早熟选育方法对堆型艾美耳球虫保定株进行了12代早熟选育,获得了潜隐期为74h的P_9株和62h的P_(12)株两个早熟株.两个早熟株不经选择传递2代,仍保持了早熟的特性.早熟株较其亲代株繁殖能力下降,致病力降低,但仍然保持了良好的免疫原性.早熟选育改变了虫体的内生性发育过程,引起了潜隐期的缩短.P_9株的裂体生殖为3代,P_(12)株的裂体生殖为2代.     

鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗轻、重链可变区基因的克隆与序列测定

将已扩增出的鸡堆型史美耳球虫特异性单抗轻、重链可变区基因进行纯化,并用纯化的2基因片段与pMD-18T载体连接,将重组载体转化于感受态细胞JM109,筛选出阳性重组子,提取阳性重组子质粒并进行测序.得到单抗轻、重链可变区的基因序列.轻链基因为312 bp,重链基因为381 bp,为单链抗体基因的构建及免疫毒素的构建奠定了基础.     

堆型艾美耳球虫ADF基因的原核表达与免疫原性

参考Gen Bank中收录的E.acervulina ADF基因序列设计1对特异性引物,以河北保定株堆型艾美耳球虫子孢子DNA为模板,用聚合酶链式反应(PCR)法扩增ADF基因。将扩增的ADF基因克隆至p MD18-T载体,转化感受态细胞DH5α,蓝白斑法筛选出阳性重组子,提取阳性质粒进行PCR、酶切鉴定及对序列确证。将扩增产物与原核表达载体p ET32a(+)连接,构建重组质粒p ET32a-ADF,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定。用E.acervulina重组质粒p ET32a-ADF免疫雏鸡,观察其对雏鸡细胞免疫和体液免疫功能的影响。结果显示,ADF基因扩增产物为729 bp,与预期结果相符。序列分析结果表明,该株的ADF基因序列与参考序列同源性达99.6%。表达出的ADF重组蛋白相对分子质量大小约为46 000。与健康对照组相比,重组质粒组淋巴细胞的增殖能力明显增强(P0.05),外周血中Ig G及IL-2含量均显著升高(P0.01),表明p ET32a-ADF质粒DNA能有效提高雏鸡的细胞免疫和体液免疫水平。     

堆型艾美耳球虫早熟株免疫剂量研究

为确定堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)早熟株合适的免疫剂量,设立7个早熟株免疫攻虫组、7个母株免疫攻虫组、1个不免疫攻虫组和1个不免疫不攻虫组,7个早熟株/母株免疫组的免疫剂量为孢子化卵囊100、200、400、600、800、1 000、2 000个/羽,经嗉囊感染,7日龄首次免疫,14日龄以同等剂量进行第二次免疫,21日龄以1.5×105个/羽的同源母株进行攻虫,28日龄结束试验,以增重、肠道病变记分和卵囊减少率为试验指标。并对早熟株中免疫保护效果较好的2个免疫剂量进行重复试验,免疫方法、试验周期、试验指标同第一批试验,攻虫剂量为2×105个/羽的同源母株。结果显示,免疫期间,各免疫组的增重与不免疫组差异不显著(P>0.05);攻虫期间,早熟株400、600、800、1 000个/羽和母株600、800、1 000个/羽免疫组的相对增重与不免疫不攻虫组差异不显著(P>0.05);肠道病变记分,除2 000免疫组明显低于不免疫攻虫组(P<0.05)外,其余各免疫组虽低于不免疫攻虫组,但与其差异不显著(P>0.05);卵囊减少率,早熟株和母株400～2 000个/羽免疫组均达90%以上,其中600、800个/羽免疫组达97%以上。用早熟株600、800个/羽进行免疫重复试验,两个免疫组攻虫期间的相对增重和肠道病变记分均与不免疫不攻虫组差异不显著(P>0.05),而与不免疫攻虫组差异显著(P<0.05),其卵囊减少率均在88%以上。研究结果表明,该堆型艾美耳球虫早熟株保持了良好的免疫原性,不同免疫剂量均能诱发鸡产生免疫保护力,其中以600、800个/羽的免疫效果更好,可考虑以600个/羽作为该早熟株在疫苗制备中的推荐免疫剂量。     

堆型艾美耳球虫单克隆抗体细胞株的鉴定

通过对杂交瘤细胞染色体分析、单克隆抗体的免疫组化和免疫荧光等指标的检测，对已建立的单克隆抗体细胞株5B4和5G7进行鉴定，结果表明：两株单克隆抗体细胞株的染色体数目均接近两亲本的染色体数目之和；所建立的单克隆抗体细胞株所分泌的特异性抗体是针对子孢子的。     

水牛TLR2cDNA的克隆与生物信息学分析

本研究通过RT-PCR分段扩增得到水牛Toll样受体2(TLR2) cDNA序列,并利用亚克隆重叠区进行全长序列拼接.将拼接产物与pMD20-T栽体连接,重组质粒经PCR酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析.结果表明,克隆得到的序列全长2 455 bp,含有一个大小为2 355 bp的开放阅读框,共编码784个氨基酸,...     

堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子的克隆和表达

本研究扩增和克隆了堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子,并在大肠杆菌中表达出MIF重组蛋白。根据GenBank中的MIF mRNA序列,设计特异引物,采用PCR方法以堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库为模板扩增获得MIF基因,将MIF基因片段连接到原核表达载体pET-28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a—MIF,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,对表达产物进行Western blot分析。结果从堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库中扩增出MIF基因片段,长度为709bp;经序列分析,扩增片段的核苷酸序列与GenBank中登录的MIF序列的同源性为99．5％;经SDS-PAGE检测表明重组质粒pET（28a）-MIF在大肠杆菌中以包涵体形式表达;Western blot分析证明堆形艾美耳球虫抗血清可与重组表达蛋白特异性结合。本研究结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

驴Zfy基因cDNA克隆及生物信息学分析

本研究旨在对驴Zfy基因的cDNA序列进行克隆及生物信息学分析。根据GenBank中公布的家牛Zfy基因mRNA序列（登录号：NM_177491.1）设计特异性引物，运用RT-PCR技术获取驴Zfy基因的cDNA序列，并对Zfy基因CDS区核苷酸序列与蛋白质结构进行生物信息学分析。结果表明，驴Zfy基因CDS区序列长度为2 325 bp，编码774个氨基酸；蛋白质二级结构预测结果显示，Zfy蛋白没有信号肽及跨膜结构；驴Zfy基因CDS区序列与家牛、绵羊、人、家猫、家犬、马鹿、黑猩猩、藏羚羊的同源性分别为92.9%、92.6%、91.8%、93.8%、92.5%、92.3%、91.6%和92.6%；对驴和其他8种哺乳动物Zfy基因CDS区核苷酸序列构建的系统进化树显示，驴与绵羊、藏羚羊、家牛、马鹿亲缘关系较近，与家犬和家猫的亲缘关系稍远，与人和黑猩猩亲缘关系最远。本研究成功克隆出驴Zfy基因CDS区序列，为进一步研究驴Zfy基因的功能奠定了基础。     

海南原鸡CDC42 cDNA的克隆及其生物信息学分析

以海南原鸡外周血白细胞总RNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增海南原鸡细胞分裂周期蛋白42(Cell division cycle 42,CDC42)编码区,将扩增产物与pMDTM20T载体连接,重组质粒鉴定正确后,进行序列特征、同源性、编码蛋白质理化性质及结构预测等生物信息学分析.结果表明,海南原鸡CDC42的CDS序列长度为576 bp,编码191个氨基酸;与鸡、人、牛、褐家鼠、斑马鱼的核苷酸序列同源性分别为100％、88.54％、88.19％、86.98％、82.12％;该基因编码的蛋白质相对分子质量约为21 259,理论等电点为6.16;编码蛋白为非跨膜蛋白,在其二级结构中,α-螺旋占27.23％,β-折叠占25.65％,无规卷曲占47.12％.     

羊IL-1Ra基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

试验旨在对羊白介素1受体颉颃因子（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra）基因进行全长cDNA克隆及生物学分析。根据布鲁氏菌感染羊白细胞层SSH cDNA文库中的IL-1Ra基因序列信息及已知核苷酸序列（GenBank登录号：KC425613.1）设计引物，利用RT-PCR结合RACE方法扩增并克隆IL-1Ra基因，对其进行序列及相关分子特性分析。结果表明，羊IL-1Ra基因全长为1 228 bp，可编码174个氨基酸，含有1个完整的IL-1保守结构域和1个IL-1Ra结构域（PHA02651结构域）。IL-1Ra分子质量为19 765.8 u，等电点（pI）为5.72，其分子式为C₈₈₅H₁₃₈₅N₂₃₅O₂₅₆S₁₁，且含有信号肽。二级结构分析显示，IL-1Ra分子存在较多的β折叠及受体结合位点，与三级结构预测结果一致，且与人/鼠IL-1Ra分子的空间结构相似度极高，达到90%以上。羊IL-1Ra有IL-1特有的三叶草结构，其酶结合结构域位于TYR⁴⁷至GLU⁶⁶之间。将羊IL-1Ra与牛、虎鲸、宽吻海豚、猪、家犬、人、鼠等14个物种进行蛋白质同源性比对，发现在各物种间存在5个高度同源的半胱氨酸位点。系统进化树分析发现，羊IL-1Ra基因全长cDNA所编码的氨基酸序列同山羊、牛单独形成一个分支。本研究结果为今后深入研究IL-1Ra基因的生物学功能奠定了基础。     

堆型艾美球虫侵入相关蛋白MIC3受体分子VAPB的克隆与表达

堆型艾美球虫感染具有寄生部位特异性,其寄生区位于鸡十二指肠,但造成这种特异性的机制尚不清楚。为研究在球虫侵入过程中可能起重要作用的配体-受体分子,对堆型艾美球虫侵入相关蛋白微线蛋白3(MIC3)的受体分子VAPB进行克隆及表达。从鸡十二指肠中分离获得肠道上皮细胞,提取细胞RNA,利用RT-PCR技术扩增VAPB基因。分析VAPB基因的分子特征,构建重组表达质粒pET-32a-VAPB,利用大肠杆菌对其进行表达、纯化,并制备大鼠抗重组VAPB蛋白多抗。序列分析揭示了VAPB具有一个完整的开放性阅读框,含有732个碱基对,编码244个氨基酸组成的分子量约为26.8 kD的蛋白,其重组蛋白rVAPB分子量约为45 kD。序列分析表明其等电点约为7.30,无信号肽,含跨膜区、多个O-糖基化位点和磷酸化位点;进化树分析表明鸡的VAPB氨基酸序列与一些动物如Numida meleagris和Coturnix japonica等亲缘关系较近。原核表达、纯化重组蛋白VAPB并获得抗rVAPB大鼠血清。Western blot分析表明鸡十二指肠上皮细胞中的天然VAPB蛋白可被抗rVAPB大鼠血清识别。结果表明:成功制备了重组蛋白VAPB及抗rVAPB大鼠血清,为研究VAPB蛋白在堆型艾美球虫侵入过程的作用提供基础。     

帝克珠利对鸡堆型艾美尔球虫的药效实验

球虫病是威胁养鸡业的重要疾病之一，目前对该病的防治仍主要依赖药物［１］。但耐药虫株的出现使现有许多抗球虫药物疗效降低甚至丧失。因此，除了采取轮换用药及穿梭用药等方法以减少或延缓耐药性的产生外，开发评价和应用新型抗型抗球虫药物极为重要和必要。本文报道我...