microRNA-155在长白猪和通城猪骨骼肌发育过程中的表达分析

本研究旨在分析miR-155在长白猪(瘦肉型)和通城猪(脂肪型)骨骼肌发育过程中的表达变化,以了解其在猪肌肉发育中的重要作用。选用长白猪和通城猪不同发育时期(胚胎期12个时期,出生后10个时期)骨骼肌为材料,利用Stem-Loop RT-PCR方法检测miR-155的表达变化。此外,本研究还分析了miR-155在成年通城猪各组织的表达。结果,miR-155在长白和通城猪骨骼肌发育过程中差异表达呈现不同的表达模式。在通城猪中,miR-155在小肠和肺中表达量较高,在心脏和胎盘中度表达,而在其他组织中表达较低。结果提示,miR-155可能参与猪肌细胞增殖和分化,从而影响猪骨骼肌发育,与猪肌肉的表型有关。     

猪骨骼肌卫星细胞中miR-24功能的初步研究及靶基因分析

为了探讨miR-24对猪骨骼肌发育的影响,对体外培养1日龄纯种长白公猪骨骼肌卫星细胞分别转染miR-24过表达载体和干扰片段,发现过表达miR-24后,成肌分化基因MyoD、Myogenin和Myf5表达量显著升高,骨骼肌卫星细胞分化趋势增强;干扰miR-24后,Myogenin的表达量显著降低;同时,靶基因预测结果显示Myogenin可能是miR-24的靶基因。     

猪骨骼肌发育过程中免疫相关基因的表达分析

为探究猪骨骼肌发育过程中免疫相关基因的表达模式以及相关生物学功能,本研究根据蓝塘猪和长白猪骨骼肌10个发育时期的转录组数据,对各时期免疫相关基因的表达数目和表达量进行分析,鉴定了相邻发育时期之间以及同一时期品种间差异表达的免疫相关基因,并对后者进行功能注释分析。结果表明:在蓝塘猪与长白猪骨骼肌发育过程中存在1 129个表达的免疫相关基因;胚胎期35 d和49 d、胚胎期91 d和生后期2d这2组相邻时期之间的差异表达免疫相关基因数目最多;品种间差异表达免疫相关基因数目则在胚胎期49d以及生后期180d最多,且趋向于在蓝塘猪上调表达,并富集在NIK/NF-κB信号传导、细胞凋亡的负调控等生物学过程中。本研究表明免疫相关基因在猪骨骼肌发育过程中存在表达,长白猪与蓝塘猪骨骼肌生长发育差异可能与NF-κB介导的细胞凋亡有关。     

THBS3基因在长白猪和通城猪不同组织和不同时期骨骼肌中的表达分析

本研究主要探究血小板反应蛋白3 (thrombospondin-3,THBS3)基因在不同组织及不同时期骨骼肌生长发育过程中的表达规律。利用实时荧光定量PCR方法对THBS3基因在长白猪和通城猪中的组织表达谱,以及在胚胎期(33、45、65、70和90 d)和出生后阶段(0、9、30、60、120和160 d)骨骼肌中的差异表达进行了比较分析。结果表明,THBS3基因广泛表达于长白猪和通城猪各个组织器官,除胃和肠中的表达存在差异外,其在两个猪种中的组织表达谱基本一致,在肺脏中表达量最高。THBS3基因在长白猪和通城猪胚胎期骨骼肌中的表达水平均显著高于出生后阶段(P<0.05),但胚胎期骨骼肌中的表达模式在两个猪种间存在一定差异,THBS3基因表达峰值出现在长白猪胚胎期45 d,而其在通城猪中表达峰值出现在胚胎期65 d。结果提示,THBS3基因参与了猪骨骼肌生长发育过程及不同类型猪种骨骼肌生长发育异步性的调控。     

TIMP3基因在长白猪和通城猪不同组织及不同时期骨骼肌中的表达分析

采用定量PCR(Quantification PCR, QPCR)方法,比较分析了基质金属蛋白酶3(TIMP3)基因在长白猪和通城猪间的组织表达谱,同时比较分析了其在这2个猪种胚胎期(33, 45, 55, 65, 70和90 d)和出生后(0, 9, 30, 60, 120和160 d)骨骼肌生长发育过程中的差异性表达。组织表达谱结果表明,TIMP3基因在不同猪种的各组织器官中广泛表达,除在腿肌和胰腺中有所差异外,TIMP3基因在两个猪种间的组织表达谱基本是一致的,在肺脏和子宫中表达最高,在背肌、脾脏和胃中表达较高,在肠、心脏、肾脏和肝脏中表达最低。与出生后阶段相比,TIMP3基因在2个猪种胚胎期均显著高表达(P＜0.05),但其表达变化趋势在2个猪种间存在差异;与在长白猪胚胎期相比,该基因在通城猪胚胎期中的高表达水平维持在一个更大的范围内。本试验结果提示,TIMP3基因可能参与不同类型猪种骨骼肌生长发育异步性的调控,影响到不同类型猪种的产肉性状。     

猪骨骼肌荧光定量PCR内参基因稳定性分析

为探究16个内参基因在猪不同肌纤维类型组成的骨骼肌中的表达情况,筛选稳定性最佳的内参基因,本试验选取6头3月龄杜长大公猪,以腓肠肌、比目鱼肌、腰大肌和背最长肌为研究对象,运用geNorm和NormFinder程序对β-2-微球白(B2M)、环指蛋白7 (RNF7)、卷曲螺旋结构域蛋白1(CHCHD1)、琥珀酸脱氢酶复合黄素蛋白(SDHA)、核糖体蛋白L32 (RPL32)、转录下调相关蛋白1(DRAP1)、1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶1 (AGPAT1)、谷胱甘肽过氧化物酶1 (GPX1)、RAD23同源物B (RAD23B)、肌动蛋白2α(ACTN2)、醛缩酶(ALDOA)、核糖体蛋白s28 (RPS28)、内质网分类受体1 (RER1)、核糖体蛋白S13 (RPS13)、核糖体蛋白L7样1 (RPL7L1)和肽基脯氨酰异构酶A(PPIA)进行基因表达稳定性评估。结果显示:通过2个程序分析,DRAP1和RPL32是4块肌肉中表达最稳定的内参基因。RER1是慢氧化型肌肉表达最稳定的内参基因,RPL32是快酵解型肌肉表达最稳定的内参基因。     

猪骨骼肌内参基因的筛选及验证

内参基因的正确选择是获得目的基因准确表达的关键。本实验以不同时期（3 d、30 d、90 d和180 d）、不同性别（阉割公猪和母猪）关中黑猪的2种骨骼肌（背最长肌和比目鱼肌）为研究对象,用RT-qPCR技术及geNorm和NormFinder软件分析8个候选内参基因（GAPDH、ACTB、PPIA、TBP、B2M、YWHAZ、eEF-1γ和18SRNA）的表达稳定性。同时,以候选基因本身和两两混合作为内参基因,检测肌纤维类型标志基因肌球蛋白重链MyHC IIx的表达。结果表明：ACTB、B2M和TBP在背最长肌和比目鱼肌中的表达相对稳定;而MyHC IIx基因的相对表达水平的检测结果证实,在背最长肌和比目鱼肌中,将ACTB作为内参基因较好。     

猪囊虫抗原基因TS21的真核表达

构建了猪囊虫抗原基因TS21的VR1020真核表达载体，以菌落原位杂交法筛选获得正确插入的重组质粒，用RNA印迹（Northern blotting)和ELISA检测插入片段的转录及其翻译表达产物。结果，VTS21在真核细胞中能够转录TS21基因的mRNA；兔抗猪囊虫超免疫血清可识别其蛋白表达产物，表明VTS21能正确表达猪囊虫抗原蛋白。     

应用荧光定量PCR方法研究RPL29基因在通城猪和长白猪不同时期胚胎骨骼肌中的表达

为了研究蛋白合成相关基因RPL29在骨骼肌发育中的作用,采用SYBRGreen染料建立该基因的实时荧光定量PCR（QPCR）分析方法,并分析该基因在猪胚胎骨骼肌中的表达变化。以不同浓度稀释样本为标准品,建立标准曲线方程：y=-3.303X＋43．077（决定系数R^2=0．999）。分析表明：该方法具有较大的检验范围（PCR扩增Q值13～35）,很好的扩增效率为100％,熔解曲线显示产物特异的单峰,其Tm值为86．5℃。本研究以H3F3A基因为内参,用所建立的实时定量PCR方法,分析RPL29在妊娠33、65和90d的通城猪和长白猪胚胎骨骼肌中的表达变化。研究发现：RPL29基因在通城猪和长白猪胚胎骨骼肌发育过程中分别呈现下调和上调表达模式;妊娠33d时,通城猪中的表达水平高于长白,而妊娠90d时在长白猪中高表达;妊娠65d时两品种间无显著差异。结果显示RPL29基因可能与猪骨骼肌的生长发育有关,并可能影响产肉性状。     

生肌调节因子在绵羊不同胎儿期心肌和骨骼肌中的表达

本试验旨在探究生肌调节因子（myogenic regulatory factors,MRFs）在绵羊不同胎儿发育时期心肌和骨骼肌组织中的表达情况。选取妊娠60（E60）、70（E70）、80（E80）和90 d（E90）4个不同时期的滩羊胎儿作为研究对象,采集骨骼肌和心肌组织,通过HE和油红染色观察心肌和骨骼肌在胎儿发育过程中发生的组织形态学变化;通过实时荧光定量PCR研究绵羊胎儿发育过程中MRFs在心肌和骨骼肌组织中的表达规律以及同一胎儿期MRFs在心肌和骨骼肌中的表达差异。HE染色结果显示,心肌组织和骨骼肌组织的微观结构差异明显,心肌肌纤维密度大,纵横交错成网状,和骨骼肌相比发育的更加成熟;骨骼肌组织肌纤维密度小,间隙大,E60~E90肌纤维数量逐渐增加,肌纤维束结构清晰分明。油红染色结果显示,心肌和骨骼肌组织在4个时期均未出现被染成红色的脂滴,表明E60~E90两个组织均没有分化出脂肪。实时荧光定量PCR结果显示,E60~E90胎儿心肌组织中MYOG、Myf5和Myf6基因表达量持续降低,但是没有MYOD基因表达;E60~E90骨骼肌组织中MYOD、MYOG和Myf6基因表达量持续上升,其中MYOG基因表达水平最高,Myf5基因的表达发生周期性波动。以上结果表明,E60~E90胎儿骨骼肌正处于快速发育阶段,而心肌组织此时已大致成型。因此,骨骼肌组织中MRFs的表达量远远高于心肌组织,且MYOG基因对于维持骨骼肌的快速发育发挥了重要作用。     

Expression of Myogenic Regulatory Factors in Myocardium and Skeletal Muscle at Different Fetal Stages

The topic of this research was to investigate the expression pattern of myogenic regulatory factors (MRFs) in the myocardium and skeletal muscle of sheep at different fetal stages,the fetuses of Tan sheep at 60 (E60),70 (E70),80 (E80) and 90 days (E90) of gestation were selected as the research objects,and the myocardium and skeletal muscle were collected.The histogenesis of myocardium and skeletal muscle during fetal development were observed by HE and oil red staining.The expression patterns of MRFs in myocardium and skeletal muscle during fetal development and the expression differences of MRFs between myocardium and skeletal muscle at the same stage were tested by Real-time quantitative PCR.The results of HE staining showed that the microstructure of myocardium and skeletal muscle was very different,myocardial fibers crisscross into a network with high density,which were more mature;the density of skeletal muscle fibers were low with large gaps,the number of fibers from E60 to E90 increased gradually,and the structure fiber bundles was very clear.The results of oil red staining showed that there were no fat droplets stained red in myocardium and skeletal muscle tissues,which means that these two tissues form E60 to E90 did not have fat differentiation.The results of Real-time quantitative PCR showed that the expression of MYOG,Myf5 and Myf6 genes in myocardium decreased continuously from E60 to E90 day,but there was no MYOD gene expression.The expression of MYOD,MYOG and Myf6 genes in skeletal muscle from E60 to E90 increased gradually,among which the level of MYOG gene was the highest,and the expression of Myf5 gene fluctuated periodically.The above results indicated that the skeletal muscle was at the stage of rapid development from E60 to E90,however,the myocardial tissue had been roughly formed,which led to the expression of MRFs in skeletal muscle tissue was much higher than that in myocardial tissue,and MYOG gene played an important role in maintaining the rapid development of skeletal muscle.     

Expression Analysis of THBS3 Gene in Different Tissues and Skeletal Muscles at Different Periods from Landrace and Tongcheng Pigs

To study the expression pattern of THBS3 gene in different tissues and during skeletal muscle development, the THBS3 gene expression in different tissues and skeletal muscles during prenatal periods (33, 45, 65, 70 and 90 d) and postnatal periods (0, 9, 30, 60, 120 and 160 d) from Landrace and Tongcheng pigs were detected by Real-time quantification PCR.The results showed that THBS3 gene widely expressed in all tissues examined, exhibiting similar spatial expression patterns with expression peaks in lung in both pig breeds except in stomach and intestine.Moreover, although THBS3 gene showed a significant higher expression level in gestation than after birth in Landrace and Tongcheng pigs (P<0.05), it exhibited different expression patterns between Landrace and Tongcheng pigs, the expression peak was detected at gestation day 45 in Landrace pig, while was detected at gestation day 65 in Tongcheng pig.The results suggested that THBS3 gene involved in skeletal muscle growth and development in pigs, as well as the regulation of asynchronization of skeletal muscle development in different pig breeds.     

非编码RNA对猪骨骼肌发育的影响

骨骼肌发育与猪肉产量和品质密切相关,且受到各种因素的影响。近年来,非编码RNA （non-coding RNA,ncRNA）对骨骼肌发育的影响已成为新的研究热点之一。ncRNA主要包括微小RNA （microRNA,miRNA）、长链非编码RNA （long non-coding RNA,lncRNA）和环状RNA （circular RNA,circRNA）,是一类不具有编码蛋白功能的RNA,最初被认为只是在转录或转录后水平调控基因的表达,但随着研究的深入,越来越多的ncRNA被证实参与骨骼肌细胞增殖、分化与凋亡等生物过程,其中miRNA可通过与靶基因互补序列结合发挥功能;lncRNA与circRNA主要作为分子海绵竞争性结合miRNA,解除其对靶基因的抑制作用。作者主要从ncRNA介绍及miRNA、lncRNA和circRNA对猪骨骼肌发育的影响等进行综述,并就ncRNA对猪骨骼肌生长发育的研究进行了展望。     

miR-21在鸭胚胎期胸肌发育中的功能研究

旨在通过研究鸭miR-21的分子特征、时空表达模式以及对鸭骨骼肌卫星细胞的增殖与分化的影响,为探索骨骼肌发育机制提供支撑。本研究选取180枚(98±5)g鸭蛋,相同条件孵化。从孵化第11天到第27天每天取3枚鸭蛋(分别表示为:E11、E12、E13……E26、E27),无菌状态下逐只采集鸭胚胸肌样品。E27时另取3只鸭胚逐只采集腿肌、心、肝、肾、肌胃、小肠、腹脂和皮脂。混合酶消化法和差速贴壁法分离和纯化骨骼肌卫星细胞,骨骼肌卫星细胞增殖、分化时期分别过表达和干扰miR-21表达,利用荧光定量、蛋白杂交、EdU检测及流式细胞术等检测miR-21对鸭骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。qRT-PCR结果显示,miR-21的表达随着孵化时间的增加而增加,E19天时到达最高,然后逐渐降低;E27时,miR-21在肝中的表达量最高。在增殖的鸭骨骼肌卫星细胞中过表达miR-21,荧光定量PCR检测CDK2和CyclinD1基因的mRNA表达量分别显著(P<0.05)和极显著增加(P<0.01),EdU检测阳性细胞数目显著增加(P<0.05),流式细胞仪检测发现G2期细胞数目极显著降低(P<0.01)、S期细胞数量显著增加(P<0.05)。在增殖的骨骼肌卫星细胞中,干扰miR-21表达,所得结果相反。在分化的鸭骨骼肌卫星细胞中过表达miR-21,qRT-PCR检测MyoG和MyHC基因的mRNA表达量均极显著增加(P<0.01);蛋白杂交(WB)检测结果显示,MyoG蛋白表达显著增加(P<0.05),MyHC蛋白表达极显著增加(P<0.01)。免疫荧光检测发现,MyHC阳性细胞数和10核以上的肌管数都极显著增加(P<0.01)。在分化的鸭骨骼肌卫星细胞中,干扰miR-21的表达,所得结果相反。结果表明,miR-21具有促进成肌细胞鸭骨骼肌卫星细胞增殖和分化的作用。     

不同发育阶段蒙古牛肌肉组织差异表达基因的筛选

应用mRNA差异显示技术,对两个发育阶段(16月龄和5岁龄)蒙古牛臀肌组织差异表达的基因进行研究,从分子水平分析影响不同发育阶段蒙古牛肉品质的遗传机制。经mRNA差异筛选获得6条差异表达的EST片段,与GenBank中序列进行相似性比对后发现,其中一条序列S1与牛的丝切蛋白2(cofilin 2, CFL2)基因高度同源(相似性99%),确认S1就是牛的CFL2基因;另外5条S2-S6在数据库中未发现同源序列,确定为新的EST片段。 采用相对定量PCR方法对差异表达基因CFL2进行真实性鉴定和差异表达量检测,结果显示,CFL2基因在5岁龄蒙古牛肌肉组织中的表达量是16月龄的3.8倍。过量的丝切蛋白2可以抑制单体型肌动蛋白的聚合及1型优质肌纤维的累积,其高表达可能导致了蒙古牛肉质性状的下降。