贵州黑山羊DQB2基因Exon1遗传变异分析

研究了贵州黑山羊MHC-DQB2基因的多态性,以便发挥MHC-DQB2基因在山羊抗病育种中的作用。采用构建DNA池并通过PCR直接测序的方法对164只贵州黑山羊的DQB2基因Exon1进行遗传变异分析;应用生物信息学软件分析基因频率、RNA二级结构、蛋白质二级结构和抗原表位。在其第1外显子中筛选得到4个SNPs,分别为G23A(Arg→Gln)、G45A(同义突变)、T90C(同义突变)、C109A(Gln→Lys),其中,T90C突变位点的最小自由能最低,其RNA二级结构最稳定。G23A和C109A 2个突变位点均引起RNA二级结构、蛋白质二级结构和抗原表位的改变。结果表明:贵州黑山羊MHC-DQB2基因的第1外显子具有较丰富的遗传多样性。     

贵州黑山羊FAS基因CDS区的克隆与组织表达分析

为探究FAS基因在贵州黑山羊各组织中的表达情况,试验参考山羊FAS基因CDS区序列设计合成特异引物,利用PCR技术扩增贵州黑山羊FAS基因CDS区序列并进行生物信息学分析,利用qRT-PCR检测FAS基因在贵州黑山羊各组织中的表达量。结果：贵州黑山羊FAS基因CDS区全长981 bp,编码326个氨基酸,分子式为C₂₉₅₈H₄₉₃₇N₉₈₁O₁₂₂₁S₁₉₅;其核苷酸序列与绵羊同源性最高,蛋白二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成;FAS基因在贵州黑山羊各组织中均有表达,表达量依次为脂肪>背最长肌>肺脏>大肠>脾脏>肾脏>腿肌>心脏>肝脏>小肠。结论：FAS基因在贵州黑山羊脂肪组织中表达量最高,对贵州黑山羊脂肪形成具有重要调控作用。     

贵州黑山羊泌乳量的研究

选择分娩贵州黑山羊母羊10只,每5 d记录羔羊吮吸母乳后的体重变化,计为母羊的泌乳量。通过试验研究发现：贵州黑山羊产后60 d日均泌乳量为（464±22）g;泌乳高峰期出现在产后30 d,产后0～30 d泌乳量缓慢上升,随后泌乳量开始逐渐缓慢下降,在泌乳45 d后,日泌乳量下降速度较快。     

海南黑山羊MBL2基因的转录调控元件的筛选与分析

甘露聚糖结合凝集素C(mannose binding lectin C,MBL-C)是C型(Ca²⁺依赖型)凝集素超家族的成员,其作为一种急性期蛋白,具有抗细菌感染的功能,参与机体的天然免疫反应。为鉴定出结合在MBL2基因启动子区(1 009 bp)的重要转录因子,探寻该基因的转录调控机制,本研究选取海南黑山羊MBL2基因的启动子序列1 009 bp,采用DNA重组技术克隆6个转录起始位点上游1 009 bp的启动子5'端侧翼缺失序列,克隆片段经双酶切后连接至pGL3-Basic载体。重组质粒转染至293T细胞中,结合双荧光素酶活性检测系统筛选MBL2基因的核心启动子区域。通过在线生物信息学软件预测山羊MBL2基因的核心启动子区域的转录因子结合位点,利用点突变技术构建转录因子结合位点缺失的载体,转染293T细胞后结合双荧光素酶活性检测系统分析其转录活性。结果表明,海南黑山羊MBL2基因的核心启动子区域位于转录起始位点上游-304~-45 bp范围内,在线软件分析该区域存在RELA、NF-κB2、MZF1等3种转录因子结合位点。双荧光素酶报告分析结果表明,RELA和NF-κB2的结合位点缺失后均使山羊MBL2基因的转录活性极显著下降(P < 0.01)。结果提示,RELA和NF-κB2对山羊MBL2基因的转录活性可能具有重要的正调控作用。该研究为进一步探寻海南黑山羊MBL2基因的功能提供理论依据。     

牛α-乳清蛋白基因5'调控区多态性研究

试验选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,设计1对引物分别扩增2个牛种α-乳清蛋白(alpha-lactalbumin, LALBA)基因5'调控区及第1外显子部分序列总长1126 bp。结果表明,LALBA基因5'调控区存在5个SNPs位点:T-114C、C-166T、A-225C、C-344T、T-778C,T-114C仅在务川黑牛表现多态性。生物信息学软件预测LALBA基因核心启动子区及转录因子结合位点,SNP位点导致11个转录因子结合位点消失,其中1个位于核心启动子区,产生5个新的转录因子结合位点。突变前后RNA二级结构发生明显改变,目标序列未发现CpG岛。     

贵州黑山羊ADIPOQ基因组织表达分析及脂肪中表达规律研究

本实验旨在探究ADIPOQ基因在贵州黑山羊不同组织中的表达谱和在不同月龄脂肪组织中的表达规律。采用qRT-PCR检测了贵州黑山羊8个组织样(心、肝、脾、肺、肾、胃、背最长肌和脂肪组织)及5个不同时期(1、3、6、9、12月龄)脂肪组织中ADIPOQ基因的表达量。结果表明:ADIPOQ基因在黑山羊8个组织中均有表达,其中在脂肪组织的表达量最高,肾脏中表达量最低;时序表达结果表明ADIPOQ基因总体表达趋势为先增加再减少,其中在6月龄表达量最高,在12月龄表达量最低。说明ADIPOQ基因对贵州黑山羊脂肪代谢具有一定的调控作用,或可作为研究黑山羊肉质品质的候选基因。     

自贡黑山羊MHC-DRB_3基因的多态性研究

本实验研究了自贡黑山羊、金堂黑山羊、乐至黑山羊和成都麻羊MHC-DRB3基因的多态性。MHC-DRB3第2外显子的PCR扩增产物分别经限制性核酸内切酶TaqⅠ、PstⅠ、HaeⅢ消化,结果在第122、154、168、220、241位碱基显示出多态性;4个山羊群体分别检测到9、10、7个和8个等位基因;聚类分析表明:金堂黑山羊和成都麻羊亲缘关系最近,首先聚为一类,再与乐至黑山羊聚为一类,最后自贡黑山羊与其他3个山羊品种聚为一类。     

南江黄羊GHR基因5''''-调控区多态与体重性状相关性研究

试验采用PCR-SSCP方法检测392只南江黄羊和49只波尔山羊GHR基因5＇＇-调控区多态性,并与体重性状进行关联分析.结果表明：GHR基因5＇＇-调控区存在（G）10、（G）11与（G）14多态和（TG）13、（TG）14与（TG）17多态.经最小二乘分析,在2个山羊群体中基因型效应对初生重的影响不显著（P＞0.05）,对周岁体重影响显著,基因型BB所对应周岁体重的最小二乘均值显著高于基因型DD所对应的最小二乘均值（P＜0.05）.     

调控CTSK基因的候选miRNA在单羔、多羔贵州黑山羊卵巢和子宫体的表达分析

以贵州黑山羊为研究对象,通过生物在线软件预测调控CTSK基因表达的候选miRNAs,采用荧光定量PCR法检测CTSK及其候选miRNAs在贵州黑山羊单、多羔性腺轴下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫体及子宫角6种组织中的表达量。结果：CTSK在单、多羔贵州黑山羊的6个组织中均有表达,在单羔组中表达量依次为子宫角>输卵管>卵巢>子宫体>垂体>下丘脑,其中在子宫角中的表达量显著高于其他组织(P<0.05),在多羔组中,其表达量依次为子宫体>输卵管>子宫角>卵巢>垂体>下丘脑,其中子宫体的表达量显著高于其他组织(P<0.05);组间比较可知,CTSK基因在多羔组子宫体中的表达量极显著高于单羔组(P<0.01),卵巢中的表达量极显著低于单羔组(P<0.01)。在线软件预测结果表明：miR-122、miR-205、miR-7、miR-30-5p和miR-124为调控CTSK表达评分最高的5条miRNAs。qPCR结果表明：5条miRNAs在子宫体和卵巢中均有表达,在子宫体中,单羔组和多羔组的表达量均依次为miR-12...     

山羊DCT基因启动子区甲基化水平、SNP与毛色特征关系研究

旨在探究DCT基因启动子区甲基化水平和SNP突变对山羊毛色的影响,为探索DCT基因调控山羊毛色变化的机理提供理论依据。本研究以山羊为试验动物,对DCT基因启动子区进行CpG岛预测,设计引物对预测的2个CpG岛富集区域进行亚硫酸氢盐甲基化测序,使用甲基化水平分析软件BISMA统计甲基化位点,比较唐山奶山羊(白色)和南江黄羊(黑色品系)两种不同毛色山羊群体DCT基因启动子区甲基化水平差异。克隆DCT基因核心启动子区,筛选不同毛色山羊群体的SNPs,使用JASPAR和Nsite预测SNPs位点突变前后转录因子的改变,并检测比较突变前后DCT基因启动子活性变化。结果,成功克隆了山羊DCT基因启动子区甲基化序列及核心启动子区(g.-1045～-318)。在g.-348～-150区域和g.+222～+502区域分别发现6个和23个甲基化位点,其中g.+312、g.+352和g.+400位点与g.+389和g.+404位点白色山羊甲基化水平分别显著和极显著高于黑色山羊(P<0.05和P<0.01),并且g.+222～+502区域白色山羊甲基化平均水平极显著高于黑色山羊(P<0.01)。在DCT基因核心启动子区的g.-804T> G、g.-705C> T和g.-679G> A,3个SNPs位点的基因型构成在白色山羊和3个有色山羊群体中存在差异,g.-804T> G突变导致该区域的SOX10转录因子结合位点缺失,DCT基因启动子活性显著下降(P<0.05)。结果显示,白色山羊DCT基因g.+222～+502区域的高甲基化水平,g.-804、g.-714和g.-679 3个位点的突变,尤其是g.-804T> G造成SOX10转录因子结合位点的缺失,突变的G型DCT基因启动子活性显著降低。因此,DCT基因启动子区SNP突变和高甲基化水平可能抑制了基因的表达从而形成山羊白色被毛。     

毕节无角黑山羊调查

在基本能代表无角黑山羊整体水平的主产区赫章、威宁6个乡镇以访谈、观察、生长发育测定的方式进行调查。结果表明:无角黑山羊是从贵州黑山羊中分化出来的具有无角、被毛全黑等典型特征的一个群体,生活在海拔1200~2000 m之间,属湿润气候暖温带的半农半牧山区。特性:管理粗放,早熟易肥,肉质优良,皮薄骨细。生产性能:两年三产,胎产1~2羔,周岁母羊体重26.59±5.65 kg,成年母羊体重37.83±5.02 kg。     

山羊腺苷单磷酸脱氨酶1基因启动子区单核苷酸多态性研究

为筛选腺苷单磷酸脱氨酶1(adenosine monophosphate deaminase 1,AMPD1)基因启动子区单核苷酸多态性(SNP)及研究其对启动子功能元件的影响,试验选择小香羊、黔北麻羊、努比山羊构建不同DNA池,直接测序结合BLAST筛选SNP位点。结果表明,AMPD1基因启动子区存在5个SNPs位点,分别为:T-614A、G-326A、G-309A、T-287C和T-165C。生物信息学软件预测得到AMPD1基因核心启动子区和转录因子结合位点,SNPs位点导致9个转录因子结合位点消失,而产生7个新的转录因子结合位点。AMPD1基因RNA二级结构在突变后显著改变,但未检测到CpG岛区域。     

贵州4个山羊群体mtDNACytb基因多态性研究

为了从核酸水平上分析贵州4个山羊群体线粒体DNA细胞色素b基因(mtDNACytb)的遗传多样性及亲缘关系,对贵州白山羊、贵州黑山羊、贵州麻羊及贵州小香羊4个山羊群体,共计55个个体mtDNACytb基因片段进行测序分析和比较。结果表明:55条山羊的Cytb基因序列均为1140bp的同源基因序列;总共发现11个变异位点,观察到10种单倍型;4个山羊群体中单倍型多样性为0.442~0.889,核苷酸多样度为0.00145~0.0025。贵州山羊的遗传多样性处于中等水平;贵州山羊可分为两大类群,即贵州黑山羊和贵州麻羊2个群体为一类;贵州白山羊和贵州小香羊2个群体为另一类。     

贵州黑马羊的选育

试验采取在农家组建核心群、基础群的开放式选育路线,制订初步淘汰标准、综合选择指数,指导整群淘汰、选种选配。结果发现,选育后核心群周岁公母羊体重分别为29.77 kg±5.51 kg、25.18 kg±5.67 kg,成年公母羊体重分别为40.08kg±7.73 kg3、4.90 kg±6.56 kg;选育后基础群周岁公母羊体重分别为26.59 kg±3.68 kg、24.09 kg±4.60 kg,成年公母羊体重分别为35.33 kg±4.09 kg3、2.16 kg±6.83 kg;产羔率达152.33%。经t检验,选育后核心群周岁公母羊、基础群周岁公母羊、成年公母羊平均体重极显著高于选育前的平均体重(P0.01)。无角对有角是显性,山羊间性与无角存在连锁关系。     

贵州地方山羊促卵泡素受体基因部分外显子多态性研究

本试验以贵州白山羊、黔北麻羊和贵州黑山羊3个地方品种为研究对象,采用DNA池结合PCR直接测序法对促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor, FSHR)基因进行单核苷酸多态性检测,同时结合在线软件预测不同基因型的mRNA的二级结构。结果表明,在3个山羊品种中共检测到3个SNPs位点:C126T、C1246A和A1412C,其中C126T和C1246A分别位于外显子1和外显子10中,且均为同义突变,A1412C位于内含子中。对外显子1和10中的2个SNPs位点进行生物信息学分析,结果显示均导致了mRNA二级结构发生改变。     

基于SNP芯片的云上黑山羊遗传结构分析

为从分子水平对云上黑山羊遗传结构做出评价,本研究以云上黑山羊核心群母羊108只(来自7个育种核心场、10个群体)、育种素材云岭黑山羊和努比山羊各11和14只、对照组波尔山羊10只为试验动物,用Illumina公司Iselect Goat60k芯片技术在全基因组范围内进行单核苷酸多态性(SNP)分析,并运用GenAlEx 6.5、Cervus 3.0、SNPRelate、Plink 1.07、Mega 4.0进行遗传多样性参数统计计算、主成分分析和系统进化树构建。试验获得143个样本在48 116个SNPs位点上的分型结果,其中波尔山羊10个样本单独聚集,与云上黑山羊、努比山羊、云岭黑山羊存在较大的遗传距离,较小的遗传一致度和较小的基因流,在聚类进化树中显示为一个独立分支,这些结果与波尔山羊实际遗传背景完全一致,显示出它在本研究中的对照组作用,同时证明本研究方法可行、结果可靠;云上黑山羊108个样本具有高度一致性,在聚类系统树中这些样本聚为一个大簇,而努比山羊(14个)和云岭黑山羊(11个)的样本各自聚为一簇;UPGMA进化树显示,云上黑山羊与努比山羊关系较近,与云岭黑山羊关系稍远,这与云上黑山羊育种导血方案结果相一致。云上黑山羊新品种在基因组水平上可与其育种素材明显区分,在基因组层面已具备独立品种特点。     

贵州黑山羊本品种选育效果初报

1998～2001年在毕节地区赫章县古达、兴发、雉街,纳雍县雍熙,织金县实兴、桂果,毕节市对坡等7乡(镇)开展的黑山羊本品种选育,采取了开放式的选育路线,通过制订的初步淘汰标准、综合选择指数,严格选种选配、提纯复壮,取得了较好效果。其结果为:核心群周岁公、母羊体重分别达29.25±4.94kg、26.44±3.07kg;成年公、母羊体重分别达38.39±4.24kg、36.77±5.49kg。基础群周岁公、母羊体重分别达28.66±5.16kg、24.63±3.74kg;成年公、母羊体重分别达35.50±5.01kg、34.44±6.05kg。胎产羔率、屠宰率分别为148.81%、46.36%。与选育前比较,6月龄公、母羊体重平均提高了10.57%,周岁公、母羊体重平均提高了8.56%,成年公母羊体重平均提高了5.98%,已建成优质黑山羊品种群3万只。