H7N9亚型禽流感病毒研究进展

禽流感病毒（AIV）属于 A 型流感病毒,它不仅可感染其天然宿主野鸟,而且还可以感染家禽或某些哺乳动物,也会感染人。近年来 AIV 感染人的病例呈上升趋势,我国于2013年首次发现 H7N9亚型 AIV 感染人并致死的病例。H7N9 AIV 感染人的病例至今仅限于中国大陆、香港和台湾,目前尚未在其他国家和地区被发现。H7N9亚型 AIV 虽然对家禽致病性低,但感染人后可以引起严重的呼吸系统症状及多个器官衰竭,甚至死亡。H7N9亚型 AIV 的感染不仅会影响人们的日常生活,而且对人的身体健康危害很大,同时还可能有引发流感大流行的潜在危险。目前仍缺乏用于预防和治疗 H7N9亚型 AIV 感染的有效疫苗及药物。论文简要介绍 H7N9亚型 AIV 的流行现状、病毒基因的来源及毒力等特点,并比较 H7N9与 H5N1亚型 AIV 之间的差异。     

H9N2亚型禽流感病毒研究进展

禽流感(AI)是由禽流感病毒(AIV)引起的一种高度接触性传染病,主要感染家禽和野禽,1966年首次分离得到H9N2。H9N2是AIV的一个亚型,经过长达数十年的遗传变异,已成为当前流行的禽流感病毒主要亚型之一。除了感染鸡、鸭等禽类,H9N2亚型AIV还可感染猪、水貂等哺乳类动物,甚至还可以感染人。虽然H9N2亚型AIV是低致病性的,但它能与其他病毒或细菌引起共感染,还能与其他亚型流感病毒进行重排,形成新型重组病毒,对公共卫生安全造成了不容忽视的潜在危害。文章就H9N2亚型AIV的遗传变异、重组、致病力和跨种传播等方面进行了简要论述。     

H9N2亚型禽流感病毒与其他病原混合感染的研究进展

H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）属于低致病性AIV,但因其分布广泛、传播迅速,可引起感染家禽生产性能下降,给家禽业带来了极大的经济损失。H9N2亚型AIV在感染家禽过程中可引起严重的免疫抑制,使家禽极易继发上呼吸道细菌、消化道细菌等感染,从而导致H9N2亚型AIV致病力增强,细菌黏附定植能力增强,家禽死亡率显著升高。另外,H9N2亚型AIV还能与禽传染性支气管炎病毒、禽传染性法氏囊病病毒、新城疫病毒等发生混合感染,病毒入侵时有可能出现协同作用或颉颃作用,从而相互促进或抑制病毒的复制和排毒;H9N2亚型AIV还极易发生突变或与其他亚型流感病毒在混合感染时发生基因重组产生感染人的新亚型毒株,给人类健康和公共卫生安全带来重大威胁。作者综述了H9N2亚型AIV与其他病原混合感染的研究进展,通过阐述H9N2亚型AIV与细菌或病毒混合感染的协同或颉颃作用,以期为临床上H9N2亚型AIV混合感染的防治提供参考。     

一株多重配H13N8亚型禽流感病毒分子进化以及对鸡致病性研究

2018年对宁夏回族自治区沙湖自然保护区进行禽流感病毒(AIV)流行病学调查中,本研究室分离到一株H13N8亚型AIV。为了解这株H13N8亚型AIV生物学特性,本研究对其全基因组进行了测序及遗传演化分析。结果显示,该病毒HA和NA基因分别来自H13N6和H3N8亚型AIV,内部基因来源于H13N8、H6N2、H13N6、H13N2亚型AIV,是一株多亚型重组AIV,其HA蛋白碱性裂解位点氨基酸序列为ISNR↓GLF,为低致病AIV分子标志。关键氨基酸位点分析显示,其M1蛋白具有N30D和T215A的突变,NS1蛋白具有P42S、L98F和I101M的突变,表明其具有增强对哺乳动物致病性的潜在能力。SPF鸡的感染性试验显示,鸡感染该病毒后不能通过喉头或泄殖腔排毒,在感染鸡各脏器均不能有效复制,其感染鸡的潜在风险较小。本研究对禽流感的综合防控具有一定的指导意义。     

H10亚型和N8亚型禽流感病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据Gen Bank中H10亚型和N8亚型禽流感病毒(AIV)的HA和NA基因保守序列,分别设计筛选出2对特异性引物,用于H10亚型和N8亚型AIV的检测,优化引物之间的浓度,建立了同时检测H10亚型和N8亚型AIV的双重RT-PCR检测方法。该方法对H10N8亚型AIV可特异性扩增出267 bp(H10亚型)和464 bp(N8亚型)目的条带,对H10Ny(y≠8)亚型AIV仅扩增出267 bp目的条带,对HXN8(x≠10)亚型AIV仅扩增出464 bp目的条带,对其他亚型AIV和常见禽病病原体均未扩增出任何条带。该方法对H10亚型和N8亚型AIV检测下限均为104拷贝数/μL。本研究建立的H10亚型和N8亚型AIV双重RT-PCR特异性强、灵敏度高,可同时快速检测H10亚型和N8亚型AIV,为其感染的快速鉴别诊断提供一种简便、快速和有效的方法。     

H5N8亚型禽流感研究进展

H5N8亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)于2010年在我国江苏省的一个农场中首次被分离到。H5N8亚型高致病性禽流感随着候鸟的不断迁徙已经传播至亚洲、美洲、欧洲、中东、非洲等近50个国家和地区，疫情最为严重的是欧洲。2021年2月18日在俄罗斯联邦阿斯特拉罕州的一个家禽农场中发生了H5N8亚型禽流感疫情，值得注意的是农场员工也发生了感染，这是首例报告的人类感染H5N8亚型AIV。此亚型近几年暴发率较高，不仅对家禽养殖业造成了巨大的经济损失，而且也威胁公共健康和安全。本文对H5N8亚型禽流感的病原学、致病性、传播途径以及国内外流行特点等方面进行综述，为H5N8亚型禽流感的防控提供理论参考，保障公共卫生安全。     

PB2-340K和PB2-588V突变导致H9N2禽流感病毒在哺乳动物间传播

H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)于1966年首次在美国火鸡中发现,它在禽类之间的有效传播使其在全世界家禽中流行。H9N2亚型AIV也能够感染人和多种哺乳动物(如猪、狗、水貂、蝙蝠),中国于1998年报导了第一例人感染H9N2 AIV的病例。血清学研究发现具有家禽接触史的人(特别是从事家禽职业的工人),H9N2 AIV抗体的阳性率比普通人要高,说明H9N2 AIV可以从家禽传播感染人。     

一株H10N1亚型禽流感病毒的遗传演化及其对小鼠的感染性研究

为了解从湖南省某活禽市场分离的一株鸭源H10N1亚型禽流感病毒(AIV) A/duck/Hunan/S10078/2015(H10N1)(简称Hu N/78/15)的生物学特性,本研究对其进行全基因组序列的测定及遗传演化分析,并对其进行BALB/c小鼠的感染试验。序列分析结果显示,该病毒HA基因的裂解位点只含有一个碱性氨基酸,为低致病性AIV (LPAIV)的分子特征。遗传演化分析结果表明该病毒的HA基因与NA基因分别来源于H10N7与H5N1亚型AIV,内部基因来源于H7N9、H4N6、H3N2、H11N7亚型AIV,呈现明显的遗传多样性。小鼠感染试验结果显示,Hu N/78/15能够在小鼠的鼻甲和肺脏中有效复制,但仅引起小鼠轻微的体重变化,表明其对小鼠呈低致病性。本研究结果为H10亚型AIV的持续监测和生物学特性研究提供相应的参考依据。     

H10亚型和N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据基因库中H10亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N8亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因序列,分别设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,建立了H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法。该法对含有H10和N8亚型AIV的模板可特异性扩增出267 bp(H10亚型AIV)、464 bp(N8亚型AIV)和693 bp(AIV)目的条带,对H10亚型AIV扩增出267、693 bp目的条带,对N8亚型AIV扩增出464、693 bp目的条带,对其他亚型AIV仅扩增出693 bp目的条带,对常见禽病病原体均未扩增出任何条带。该法对H10亚型和N8亚型AIV检测下限为10~3拷贝/μL。120份临床样品检测结果与病毒分离鉴定一致。研究建立的H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高,为同时快速鉴别检测H10亚型和N8亚型AIV提供一种简便、快速和有效的方法。     

1株野鸟源H7N3亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及其对小鼠感染性研究

旨在对2021年分离自我国宁夏回族自治区野鸟粪便中的1株低致病性H7N3禽流感病毒(AIV)A/mallard/Ningxia/Y37/2021(H7N3)株进行了全基因组测序、遗传进化分析及对小鼠致病性试验。全基因组序列分析表明，HA基因裂解位点仅有1个碱性氨基酸，符合低致病性AIV的分子特性。遗传进化分析结果表明，HA基因和韩国野鸭源H7N7亚型AIV同源性较高；NA基因与韩国野鸟源H5N3亚型AIV同源性较高；PB2、PA基因与H5N2亚型AIV有较高的同源性；PB1基因与H5N3亚型AIV有较高的同源性；NP基因与H3N2亚型有较高同源性；M、NS基因与H3N8亚型有较高同源性，具有明显的遗传多样性。血凝抑制(HI)试验结果表明，该毒株与H7N9-Re4疫苗株抗血清的HI效价比同源毒株低16倍，抗原性差异显著。小鼠感染性试验结果显示，该病毒能在小鼠的肺部与鼻甲中复制，并引起感染小鼠体重下降，表明该毒株有感染哺乳动物的风险。本试验通过对1株野鸟源H7N3亚型AIV部分生物学特性的分析，为H7N3亚型禽流感的预警和综合防控提供重要理论参考。     

H7N9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立

In order to develop a rapid and simultaneous assay for H7N9 subtype avian influenza virus （AIV）, three pairs of specific primers were designed according to the conserved sequences of the hemagglutinin (HA) gene of H7 subtype AIV, the neuramidinase (NA) gene of N9 subtype AIV, and the matix (M) gene of all subtypes AIV. The reaction conditions were optimized, and the specificity and sensitivity of this method were evaluated to develop a triplex PCR assay. It was shown that H7N9 subtype AIV could be amplified into three specific bands by this triplex PCR, the lengths of these bands were 330 (H7 AIV), 207 (N9 AIV) and 632 bp (all AIV), respectively. Samples containing H7 or N9 subtype AIV could be amplified into two specific bands, which were 330 and 632, 207 and 632 bp, respectively. Samples containing other subtypes AIV could be amplified into a 632 bp specific band. No specific band was amplified from other avian pathogenic virus. Sensitivity test results showed that as low as 10³ copies/μL H7N9 subtype AIV could be detected. This triplex PCR could simultaneously diagnose H7N9 subtype AIV, single H7 subtype AIV, single N9 subtype AIV and other subtype AIV in one tube. This assay was a rapid, specific and sensitive method for the detection of H7N9 subtype AIV. It could be applied in rapid diagnosis for clinical samples, and also provided a technical support to prevent and control H7N9 subtype AIV.     

三株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析

采用RT-PCR对3株H9N2亚型禽流感病毒基因组进行扩增,测序后再利用DNAStar和MEGA 4对所得到的序列和部分具有代表性的参考序列进行遗传演化及分子特点分析,旨在从分子水平探讨华南地区H9N2亚型禽流感病毒的流行特点,为该病的综合防控提供依据。结果表明,3个分离株CK/GD/162/03、Francolin/GD/298/05与CK/GD/A8/10分别属于B34、B47和B54基因型;3个分离株HA基因未发生明显的变异,符合我国大陆H9N2亚型AIV HA基因的遗传进化特点,但内部基因出现不同程度重组且部分基因与人源高致病性H5N1亚型AIV同源性很高;CK/GD/162/03、Francolin/GD/298/05两株分离株具有宿主多样性。因此,对华南地区H9N2亚型AIV进行监控及分子流行病学调查具有重要意义。     

H5亚型和N6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、简便的H5亚型、N6亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,根据GenBank中H5亚型、N6亚型AIV的HA和NA基因保守序列,分别设计了2对特异性引物,通过优化条件,建立了H5亚型和N6亚型AIV二重RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对H5N6亚型AIV特异性扩增出418bp和251bp目的片段,对H5Ny(y≠6)亚型AIV扩增出418bp目的片段,对HxN6(x≠5)亚型AIV扩增出251bp目的片段,对其他亚型和常见的禽病病原体均未扩增出目的片段;敏感性结果显示,该方法对H5亚型和N6亚型最低检测限为1.59×10-5ng/μL。本研究建立的H5亚型和N6亚型AIV检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,为H5亚型和N6亚型AIV临床检测以及防控提供了有效方法。     

H5亚型虎源流感病毒血凝素单抗制备及胶体金试纸条的研制

以H5N1亚型虎源流感病毒免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA试验检测细胞培养上清,获得2株阳性杂交瘤细胞克隆株,命名为3A13和1B8.分别制备腹水后进行纯化,获得了抗H5亚型虎源流感病毒血凝素的单克隆抗体,用制备的单克隆抗体结合胶体金免疫层析技术,制备了H5亚型虎源流感病毒免疫胶体金快速诊断试纸条.该试纸条对H5N1虎源流感病毒鸡胚培养毒、H5亚型禽流感病毒标准抗原,以及24份虎疑似感染H5N1亚型虎源流感病毒感染病料和小鼠模型病料等检测结果为阳性,同时对H7和H9亚型禽流感病毒标准抗原及传染性支气管炎、新城疫抗原等检测结果为阴性;与HA-HI和RT-PCR的平行对比试验表明,试纸条检测敏感度与血凝试验和血凝抑制试验的敏感性相符.本试验所研制的免疫胶体金诊断试纸条可用于H5亚型虎源流感病毒的特异诊断和流行病学调查,为开发成品化检测试纸条奠定基础.     

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异株致病性及抗原特性

为确定近年来H9N2亚型禽流感病毒(AIV) HA蛋白S145N点突变对病毒毒力变化和抗原性变异的影响,笔者对从全国不同地区分离的12株H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株和HP疫苗参考株进行了半数鸡胚感染量(EID50)、半数鸡胚致死量(ELD50)、平均鸡胚致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)、鸡静脉致病指数(IVPI)和8周龄SPF鸡感染排毒试验,并与抗H9N2亚型AIV HP参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性进行测定.结果发现,H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株毒力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长.单抗2A4和F6不能抑制H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞.研究结果表明,H9N2亚型AIV呈现变异趋势,有毒力增强和抗原性变异毒株出现.S145为H9N2亚型AIV HA蛋白的1个抗原位点,是血凝抑制抗体结合的位点,但有该位点漂变导致抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用.这提示该病的防控面临着新的挑战.     

H5亚型AIV HA抗原表位重组蛋白McAbs的制备及应用

目的以H5亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)抗原表位重组表达蛋白为抗原,探索H5亚型AIV单克隆抗体制备的简便有效途径。方法利用H5亚型AIV的HA抗原表位原核表达重组蛋白为抗原,4次免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特性及初步应用价值进行测试。结果得到一株能稳定分泌针对H5亚型AIVHA抗原表位的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株,单克隆抗体ELISA效价达1:5×104,为具有IgK轻链的IgM亚类。该单克隆抗体能特异性地与H5亚型AIV产生肉眼可见的WesternBlot免疫印迹反应,与其它供试的禽病抗原无反应。H5N1亚型AIV阳性血清能有效阻断辣根过氧化酶标记的单克隆抗体与HA抗原表位重组蛋白的结合。结论本研究探索出一条利用H5亚型AIV的HA抗原表位重组表达蛋白为抗原的单克隆抗体制备的简便、高效途径,所制备的单克隆抗体稳定性好、效价高、特异性强,在H5亚型禽流感病毒及其血清学检测中有较高的应用价值。     

H9N2 AIV HA蛋白S145N变异毒株的抗原性和免疫原性

在研究1998-2008年中国H9N2亚型禽流感病毒（AIV）分离株HA基因的进化时,发现在25个毒株中有2个致病性最强的毒株因HA基因第145位氨基酸的突变导致产生1个潜在的糖基化位点,从而使其不与单抗H6、F6等反应。为进一步探究这类变异毒株HA基因变异对H9亚型AIV的抗原性和免疫原性的影响,本试验对12株HA蛋白S145N变异的H9N2AIV进行了交叉中和试验和交叉攻毒试验。结果显示,不同H9N2S145N变异株与疫苗株间在抗原性上变化不大,或无显著差异（0.5≤R≤0.67）。但参照现有的H9灭活疫苗效力检验方法对HP疫苗免疫鸡进行攻毒,用HP株攻毒对照组0/5保护,免疫组保护≥9/10,达到了H9灭活疫苗质量标准要求;但用S145N变异株N3攻毒,仅保护2/10～6/10,且随免疫量剂量的增加,抗体水平的提高,攻毒保护也依次升高。对H9变异株疫苗（N1、N2、N3、N8）免疫鸡用N3攻毒,仅保护2/5～4/5,N3同源抗体也不能有效地阻止其攻毒后的排毒。用N3、N6 2个变异株交叉攻毒,采用与疫苗株攻毒相同的剂量作攻毒试验也得到类似结果。表明高于6log2的抗体能抵抗疫苗株和大多数流行毒株攻毒后的排毒,但不能抵抗S145N变异株攻毒后的排毒。这类毒株免疫原性上的变化与病毒HA基因的变异密切相关。因HA基因145～147aa位增加了1个NGT,导致三维空间构象的变化,并影响其邻近的受体结合位点,从而使这类毒株致病性提高,免原性发生改变。虽然这一类变异株或免疫逃逸毒株仅占当前流行毒株总数的5%～7%,但在强大的免疫压力和自然选择下有可能逐步成为优势毒株,造成更大的危害,这为该病的防控提出了新的挑战。     

H5N1亚型禽流感病毒感染海兰白鸡模型的建立

为建立H5N1亚型禽流感病毒感染海兰白鸡模型,本研究选取1株鹅源H5N1高致病性禽流感病毒A/goose/guangdong/1/96(H5N1)(简称GD1/96),测定其对4周龄海兰白鸡的半数致死量.感染模型试验中,将30只4周龄海兰白鸡随机分成3组,每组10只,5只直接感染,5只同居,试验组设置一个重复,将病毒液稀释至10^4.5EID₅₀,滴鼻、点眼各0.1 mL,对照组接种PBS,感染后24 h放入同居鸡;感染后连续观察14 d,记录死亡时间,每天采集咽喉拭子和泄殖腔拭子;感染组和同居组第3、5 天各剖解3只鸡,采集气管、肺脏、脑、脾脏、肾脏和十二指肠,进行病毒分离;qRT-PCR法分析感染组和同居组第3、5 天鸡肺组织中IFN-α和TNF-α的相对表达量.结果显示,GD1/96株的鸡胚半数感染量(EID₅₀)为10^-8.167/0.1 mL,对4周龄海兰白鸡的半数致死量为10^4.5 EID₅₀.感染模型试验结果显示,以10^4.5EID₅₀的攻毒剂量感染海兰白鸡,感染组鸡在感染后8 d全部死亡;在感染和同居3 d后,各组鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子均可检测到病毒;感染和同居后第3、5 天,各组鸡的6种组织中均可分离到高滴度的病毒;IFN-α和TNF-α在感染组和同居组的鸡肺脏组织中的表达量均显著增加(P <0.05).本试验建立了海兰白鸡的H5N1亚型禽流感病毒感染模型,为H5N1亚型禽流感病毒的致病机理及表达抗流感基因转基因鸡的研究奠定了基础.     

H9N2亚型禽流感流行现状

低致病性禽流感主要是由H9N2亚型禽流感病毒所引起,近几年在世界上许多国家都暴发了H9N2亚型禽流感疫情.研究表明,H9N2亚型禽流感病毒在陆禽中至少可分为北美和欧亚两个种系,该病毒在自然环境中很容易发生变异,通过混合基因组分而形成不同的病毒亚型.H9N2亚型禽流感病毒已经能传播至哺乳动物,包括猪和人类,从而引发对其是...