鸡传染性支气管炎病毒M41、4/91及疫苗株Ma5、H52、H120 N基因的克隆与序列分析

参照IBVN基因序列,设计一对引物通过RT-PCR扩出IBV标准强毒株株M41,传支变异株4/91和疫苗株Ma5、H52、H120的N蛋白基因序列,基因产物大小为1.23kb。序列分析结果表明,M41株与Ma5、H52、H120的核苷酸序列推导的氨基酸序列的同源性为92.2%～92.9%,而经4/91与M41、Ma5、H52、H120的核苷酸序列推导的氨基酸序列的同源性为91.2%～92.0%,结果表明这几个毒株N基因是相对保守的。     

4株鸡肾型IBV陕西分离株3种主要结构蛋白基因的遗传变异分析

采用RT—PCR方法对近年来本实验室分离的4株肾型IBV陕西分离株的纤突蛋白S1基因、膜蛋白基因（M）和核蛋白基因（N）分别进行扩增,测序后进行遗传变异分析。结果显示：与肾型疫苗株w93相比,各分离株S1基因均存在广泛的点突变,并且都存在基因插入现象,分离株之间氨基酸同源性为75．8％～99．4％;M基因除了存在点突变外,W09和WNl2在其5’端还存在9个核苷酸的缺失,分离株之间氨基酸同源性为91．0％～99．6％;N基N无插入和缺失,但存在基因点突变,分离株之间氨基酸同源性为99．3％～99．5％。4株IBV分离株在S1、M和N基因氨基酸系统进化树上分属于不同的进化群,且都与较早的肾型IBV陕西分离株w118遗传距离较远。结果表明,4株鸡肾型IBV流行毒株的s1、M和N基因均存在不同程度变异,这可能是免疫鸡群肾型鸡传染性支气管炎长期流行的主要原因．     

2006年至2010年山东省鸡传染性支气管炎病毒分子变异的研究

为研究山东省鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的遗传变异规律,本研究2006年～2010年从山东省发病的商品鸡中分离鉴定了17株IBV,并对其S1基因、N基因和M基因分别进行RT-PCR扩增、测序及遗传进化分析.序列分析结果表明:与疫苗株H120相比,17个分离株S1蛋白的变异程度较大,存在广泛的基因突变和氨基酸替代,多数病毒株还存在氨基酸的插入;N蛋白无碱基的缺失和插入,仅存在核苷酸的突变和氨基酸的替代;M蛋白除病毒株CK/CH/SD09/005插入3个碱基外,其它16个分离株仅存在少数的碱基突变和氨基酸替代.S1基因、N基因和M基因的系统进化分析结果表明多数分离株的3个基因在进化上相对平行,与国内分离株LX4同属一个进化分支,同源性较高;分离株SDYT0605的3个基因与疫苗株H120同源性较高,可能是免疫压力下变异的疫苗株;分离株SDTA06111、SDWF0608和CK/CH/SD09/005的S1基因、N基因和M基因分属于不同的进化分支,可能发生了基因重组.本研究结果显示基因突变、插入和不同基因之间的重组是免疫压力下IBV变异的主要方式.     

鸡传染性支气管炎病毒S1和N基因遗传变异的相关性

对国内1992—2005年分离的IBV毒株的纤突蛋白(S1)和核衣壳蛋白(N)基因分别进行克隆测序,结合在GenBank中发表的IBV S1和N基因的序列,对其不同毒株的S1或N基因片段和全长、S1和N基因全长分别进行遗传变异的研究,利用统计学软件SPSS11.5进行同源性相关分析。结果表明:不同IBV毒株N或S1基因片段与其全长之间遗传变异高度相关,核苷酸r≥0.892,氨基酸0.854≤r≤0.968;但S1与N基因全长之间核苷酸的遗传变异相关性相对较低一些,而且有些毒株间S1基因同源性很低(r=0.645),但N基因同源性仍很高,显示每个基因变异的独立性。国内IBV疫苗株之间S1和N基因核苷酸高度同源(S1≥97.3%;N≥90.7%),而野毒株与疫苗株相比S1和N基因同源性均较低(S1≤84.3%;N≤87.1%),这也可能与常规疫苗对IBV野毒株不能有效保护有关。     

鸡传染性支气管炎病毒变异株(793/B)M基因的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的传染性支气管炎病毒(IBV)全基因组序列设计引物,对793/B型IBV分离毒株TA03M基因进行克隆与序列分析.结果表明,793/B型IBV的M基因由669 bp组成,与GenBank已发表的15株IBV的M基因相比较,793/B型IBV的M基因在第4～15位发生了3～12个核苷酸的缺失,对应1～4个氨基酸的缺失,共有30多处点突变.与其他各毒株M基因的核苷酸同源性为84.2%～93.6%,氨基酸同源性为82.1%～96.0%;进化分析显示TA03株与H52和IBN毒株之间的亲缘关系较近.该研究为进一步探讨793/B型IBV M基因(蛋白)在遗传变异和免疫等方面的作用奠定了理论基础.     

鸡传染性支气管炎病毒分离鉴定及S1基因遗传演化分析

为调查辽宁地区鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的流行及遗传演化情况,从辽宁某鸡场疑似鸡传染性支气管炎病料中分离得到1株病毒,经分子生物学检测、鸡胚矮小化试验、新城疫病毒血凝特性干扰试验和动物回归试验,确定该毒株为IBV,并命名为CH/LN/2019。扩增该毒株S1基因并进行序列分析发现,分离株S1基因全长1 620 nt,编码540个氨基酸,S1蛋白裂解位点为HRRRR,属于基因Ⅰ型(QX型)毒株;同源性比对发现,分离株与基因Ⅰ型代表毒株QXIBV株的核苷酸和氨基酸序列同源性最高,分别为95.6%和94.8%;与国内常规型疫苗H52、H120和Ma5毒株的同源性较低,核苷酸和氨基酸序列同源性仅为77.2%~76.9%和75.4%~76.2%。本试验为辽宁地区鸡传染性支气管炎的流行病学调查及免疫防控提供了参考。     

2006-2008年山东鸡传染性支气管炎病毒分离株S1与N基因的分子特征

为了调查2006-2008年山东省鸡传染性支气管炎的分子流行病学特征,应用RT-PCR方法分别扩增了14株传染性支气管炎病毒地方毒株S1基因和N基因,并进行了基因克隆与测序工作.对此14株病毒的S1基因序列利用限制性内切酶HaeⅢ进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析,结果显示可以将IBV毒株分为3种不同的基因型.其中11个毒株与LX4毒株有相同的RFLP分型,2株病毒属于Mass基因型,1个毒株有特异的RFLP分型.并将这些分离毒株与11个参考毒株分别进行了基因与氨基酸系统进化树关系分析.S1基因分析结果显示将这些毒株分成3个基因型,与RFLP分析的分型结果一致.11株病毒同属于LX4类型的毒株,分离毒株核苷酸序列相互之间有95.4%～99.7%的同源性.基因Ⅱ型与疫苗株H120和M41的同源性很高.属于基因Ⅲ型的1个毒株形成了独特的基因型.N基因分析结果表明:12株病毒与LX4属于同一基因型,有着较高的同源性.另2株病毒与疫苗株H120同源性很高.以上分析结果表明:山东省IBV分离株存在较为广泛的基因突变、插入和缺失,同时,IBV毒株间的基因重组也可能是山东省IBV变异株产生的另一主要原因.     

鸡传染性支气管炎病毒广西流行株3种主要结构蛋白基因的遗传变异分析

为了解鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,应用RT-PCR方法对2004-2007年的7株广西IBV分离株的纤突蛋白S1基因、核(N)蛋白和膜(M)蛋白基因进行扩增、克隆、测序和同源性比较及系统进化分析。结果显示广西IBV分离株S1基因存在广泛的基因点突变,部分毒株出现基因插入和缺失,分离株之间氨基酸同源性为74.2%～98.7%;N基因无插入和缺失,但存在基因点突变,分离株之间氨基酸同源性为91.7%～99.3%;M基因存在点突变和插入现象,分离株之间氨基酸同源性为90.7%～98.2%。以疫苗株H120为参照,广西IBV分离株的S1、N和M基因都出现了变异,其中S1基因变异程度最大。7株广西IBV在S1、N和M基因氨基酸序列系统进化树中分别集中在2、3和3个基因群中,其中4株的S1、N和M基因分型结果不一致。结果表明广西IBV分离株的S1、N和M基因已发生变异,广西IBV存在广泛的基因突变、缺失或插入现象。研究的结果提示流行株的遗传变异可能是目前影响疫苗免疫效果的主要原因。     

鸡传染性支气管炎病毒广西株N、M基因的克隆与序列分析

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了1株IBV。参照GenBank中IBV的核苷酸序列设计2对引物,利用RT-PCR技术对分离毒株的N、M基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示,N基因序列全长为1 230 bp,编码409个氨基酸,M基因序列全长为678 bp,编码225个氨基酸。与参考毒株相比,分离株的N基因核苷酸序列同源性为87.2%~93.3%,推导的氨基酸序列同源性为90.0%~94.4%;M基因的核苷酸序列同源性为83.6%~91.0%,推导的氨基酸序列同源性为82.7%~92.9%。在遗传进化树中,本试验分离株Guangxi156株与BJ株和LX4株两个参考株位于同一个分支上,亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远。结果表明,本试验分离株是一株新的IBV变异株。     

犬瘟热病毒分离株N、H、F蛋白基因的变异分析

通过RT-PCR方法扩增到犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)分离株GS0812-4的N、H、F蛋白基因,然后克隆入pGEM-T Easy载体并进行序列分析和抗原表位预测分析。结果表明,GS0812-4分离株的N、H、F蛋白基因与其他分离株相应序列的核苷酸同源性分别为93.2%~97.8%、90.3%~97.3%、93.2%~97.8%,其推定的氨基酸同源性分别为96.6%~98.7%、91.3%~97.9%和96.6%~98.7%;GS0812-4分离株N、H、F蛋白基因与疫苗株相应序列的核苷酸同源性分别为93.1%~93.8%、89.4%~90.5%、93.1%~93.8%,其推定的氨基酸同源性分别为96.4%~97.3%、89.3%~91.3%、96.4%~97.3%。由基因系统发育树可知,GS0812-4与疫苗株处于不同的分支,其中与MKY-KM08的亲缘关系最近,但GS0812-4在N、H、F 3个基因系统发育树上与其他同一毒株的亲缘关系远近不同。H、F蛋白的抗原表位预测结果表明,GS0812-4与MKY-KM08和疫苗株的抗原表位均有差异。说明GS0812-4是野毒株,与MKY-KM08属于同一基因型,来源于同一毒株,但两毒株间的H蛋白和F蛋白的抗原表位仍有差异。     

Cloning and Sequence Analysis of N and M Genes of Avian Infectious Bronchitis Virus Guangxi Strain

To investigate genetic variation of avian infectious bronchitis virus (IBV) in Guangxi province,one strain of IBV was isolated from chicken.Two pairs of primers for amplifying the N and M genes of IBV were designed according to the sequences in GenBank.The N and M genes of the strain were amplified by RT-PCR,and they were proved to be the N and M genes of IBV by cloning,sequencing and compared with reference IBV strains published in GenBank.The results showed that the N gene from the IBV isolate consisted of 1 230 bp,coding 409 amino acids.The M gene from the IBV isolate consisted of 678 bp,coding 225 amino acids.The sequence analysis of N gene showed that it shared 87.2% to 93.3% nucleotide homologies and 90.0% to 94.4% deduced amino acid sequence homologies with IBV strains from GenBank.The M gene sequence analysis showed that it shared 83.6% to 91.0% nucleotide homologies and 82.7% to 92.9% deduced amino acid sequence homologies.The phylogenetic tree analysis showed that it was closely related to BJ and LX4 strains,and were clustered into one group;But with the distant relatives from other strains of IBV.These results suggested that the isolate was a new variant of IBV.     

IBV AH1-99分离株N基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术成功扩增出IBV AH1-99分离株的N基因全长cNDA,将其克隆到pMD18-T载体上。经酶切分析、PCR鉴定及核苷酸序列测定,成功获得该分离株N基因的重组质粒。序列分析结果表明,分离株N基因全长1 230个核苷酸,编码409个氨基酸。同部分IBV参考毒株相比,核苷酸同源性为85.8%~89.9%,氨基酸同源性为86.6%~91.0%,在进化关系树中,AH1-99与国内分离株X、LX4亲缘关系较近。     

鸡传染性支气管炎病毒SH株的分离及鉴定

从黑龙江省绥化市某养鸡场疑似鸡传染性支气管炎的鸡群中采集病料,经鸡胚传代、电镜观察、生物学特性和分子生物学鉴定以及动物回归试验,表明该分离株具有明显的鸡传染性支气管炎病毒特征,具有鸡胚出现卷曲、出血、发育延迟等作用;对新城疫病毒有明显的干扰作用;动物回归试验导致未免疫鸡出现明显的感染症状,剖检可见明显的肾脏肿胀、尿酸盐沉积现象,同时可见呼吸道有出血现象。对该毒株的N基因进行扩增,并将其序列与NCBI的参考毒株的N基因进行序列对比,发现其与国内的分离株SC和N毒株的N基因具有较高的同源性,为97.6%;与国外参考毒株和国内的疫苗株同源性较低,为84.8%。表明分离的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。     

鸡传染性支气管炎病毒SC株N基因序列测定与同源性分析

从我国四川省一疑似鸡传染性支气管炎(Avianinfectious bronchitisvirus,IB)的雏鸡病料中成功分离到一株鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV),命名为SC。病毒经鸡胚传代、血凝试验监测和负染电镜检查证实为IBV。自接毒鸡胚尿囊液中提取RNA后应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到了IBVSC株mRNA6 cDNA(编码N蛋白)。应用DNAstar5．06,Clustal1．8分析软件将克隆测序的N蛋白基因与Genbank中11株国内外参考毒株进行序列比较分析和同源性分析,发现IBV SC株变异独特,明显不同于国内外参考毒株。     

猪流感病毒H9N2亚型济南株HA、NA基因的克隆与序列分析

根据GenBank中流感病毒H9N2亚型HA基因与NA基因序列,分别设计扩增HA基因与NA基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增猪流感病毒H9N2济南株(SW/SD/JT/07)HA基因和NA基因,分别将RT-PCR扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析。结果表明,SW/SD/JT/07 HA基因长度为1701bp,编码566个氨基酸,HA0切割位点序列为R-S-S-R-G,属非高致病性毒株;HA蛋白有8个糖基化位点,与参考毒株糖基化位点数一致;HA蛋白有5个受体结合位点,其中在190位氨基酸与其余参考毒株存在差异。SW/SD/JT/07 NA基因长度为1413bp,编码470个氨基酸,NA蛋白基质结合部与参考毒株一致,高度保守;NA蛋白有5个抗原位点,在325位为D其余参考毒株均为N,SW/SD/JT/07与DC/HB/W1/04,CK/GS/2/99在398位为E,其余参考毒株为D或N;SW/SD/JT/07 NA蛋白与CK/SH/F/98,DC/HB/W1/04,CK/GS/2/99,SW/GD/WXL/04,SW/SD/W4/03,SW/YN/Simao2/07一样在茎区63,64,65位发生氨基酸缺失。SW/SD/JT/07 HA基因与参考毒株的同源性82.5%～98.6%,NA基因与参考毒株的同源性82.2%～99.1%。SW/SD/JT/07 HA基因与NA基因系统发生树分析表明,SW/SD/JT/07与AIV H9N2亚型亲缘关系密切。     

两株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析

为调查广东地区鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的流行及其遗传变异情况,本研究通过病料SPF鸡胚接种和鸡胚尿囊液的RT-PCR鉴定,于2013年从广东湛江地区不同发病鸡场分离到两株IBV,分别命名为CK/CH/GD/ZJ10/2013和CK/CH/GD/ZJ11/2013,并对这两株IBV的S1基因进行序列分析。结果显示,CK/CH/GD/ZJ10/2013株S1基因全长1 626 bp,编码542个氨基酸,其裂解位点为NRFRR,属于基因型Ⅲ,并推测其为基因型Ⅲ毒株(CK/CH/GX/NN11-3)与基因型Ⅰ毒株(GX-NN-6)在S1基因处发生重组而产生的新毒株;CK/CH/GD/ZJ11/2013株S1基因全长1620 bp,编码540个氨基酸,其裂解位点为HRRRR,属于基因型Ⅰ(类QX型);两株IBV的S1基因间核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性较低,与位于同一基因型的参考毒株间同源性较高,而与中国使用的Mass型常规疫苗H120和H52之间的同源性最低,仅为75.7%~76.3%和77.1%~77.9%。本研究可为广东省IBV的流行病学调查和分子生物学研究提供参考。     

Isolation,Identification and Sequence Analysis of S1 Gene of Two Strains of Avian Infectious Bronchitis Viruses

In order to investigate the epidemiology and genetic variation of avian infectious bronchitis virus (IBV) in Guangdong province, two strains of IBV were isolated by inoculation of embryo and RT-PCR detection from diseased chickens at different farms in Zhanjiang, Guangdong province in 2013.We denoted these two strains of IBV as CK/CH/GD/ZJ10/2013 and CK/CH/GD/ZJ11/2013, respectively.Analysis of the S1 gene sequences from these two isolated strains showed that the S1 gene of CK/CH/GD/ZJ10/2013 was 1 626 bp, which encoded 542 amino acids with a cleavage site sequence of NRFRR, while the S1 gene of CK/CH/GD/ZJ11/2013 was 1620 bp, encoded 540 amino acids with a cleavage site sequence of HRRRR.Phylogenetic analysis revealed that these two isolated strains were clustered into genetic groups Ⅲ and Ⅰ(QX-like type), respectively.Homology analysis demonstrated that nucleotide and deduced amino acid sequence homologies between these two isolated strains were lower, while the homologies were higher among the same genotypes, however, the homologies were lower comparing with current vaccine strains such as H120 and H52, with which the nucleotide homologies ranged from 75.7% to 76.3% and the amino acid homologies ranged from 77.1% to 77.9%.Further analysis showed that the CK/CH/GD/ZJ10/2013 strain was formed from a recombination event between CK/CH/GX/NN11-3 and GX-NN-6.Taken together, this study provided valuable insight into prevention and control of IBV infection in Guangdong province.