牦牛Toll样受体10基因的克隆与分析

旨在获得牦牛TLR10基因序列并进行生物信息学分析,同时分析其组织表达谱,为进一步研究牦牛TLR10基因的功能提供资料。以GenBank中牛TLR10基因序列设计引物,在牦牛脾组织中克隆出牦牛TLR10基因,应用半定量RT-PCR技术检测该基因组织表达情况。生物信息学分析表明,牦牛TLR10基因编码区全长2 328bp,编码氨基酸776个,分子质量196.3ku,理论等电点为4.94;TLR10编码的蛋白整体带负电荷,并表现为亲水性;进化树与同源性分析表明,牦牛与黄牛的同源性最高,达到99.4%,与水牛、绵羊、梅花鹿等哺乳动物遗传距离很近。组织表达谱显示牦牛TLR10基因在12个组织中均有表达。结果显示,牦牛TLR10基因高度保守,具有稳定的抗原特征。     

水貂TOll样受体5编码区基因的克隆及序列分析

为了解水貂Toll样受体5(TLR5)蛋白的结构特征和遗传演化关系,采用RT-PCR方法从水貂肺脏组织总RNA中扩增出TLR5基因的片段,经拼接获得全长编码区序列。序列全长2 577 bp,编码858个氨基酸,含172%的亮氨酸,并有一段20个氨基酸的信号肽序列。蛋白预测结果表明,该分子具有亲水性,由胞外区(具有LRR结构域)、跨膜区和胞内区(具有TIR结构域)组成,表现出典型的TLR家族结构特征;同源性分析结果显示,与蒙眼貂同源性最高,达97%以上,与海象、大熊猫和北极熊同源性80%以上,与其他物种同源性大都在70%以上。水貂TLR5基因序列的成功克隆为进一步研究其在水貂机体免疫应答中的作用奠定了基础。     

高原牦牛乳铁蛋白素基因克隆及序列分析

利用PCR技术从高原牦牛基因组DNA中获得了乳铁蛋白素(lactoferricin,Lfcin)基因序列;将Lfcin基因连接于pGEM T easy载体,送至生物公司测序;将高原牦牛与奶牛的Lfcin基因序列进行比对;同时,对牦牛、奶牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白序列进行分析。结果表明：克隆获得了含高原环湖牦牛LF(lactoferrin)第2外显子的DNA序列,共778 bp,其中Lfcin基因编码区长75 bp,编码25个氨基酸; 序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛这一序列存在9个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性。     

牦牛PRLHR基因的克隆、序列分析及组织表达研究

试验旨在对牦牛催乳素释放激素受体(prolactin releasing hormone receptor,PRLHR)基因进行克隆、序列分析及组织表达研究。采集5头母牦牛和5头母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管和子宫组织,采用RT-PCR技术扩增得到PRLHR基因cDNA全长,通过生物信息学方法分析该基因编码蛋白的生物信息学特征,利用实时荧光定量PCR技术测定PRLHR基因在牦牛及黄牛各组织中的表达量。结果显示,牦牛PRLHR基因序列长1 625 bp,其中CDS区1 113 bp、5′-UTR 22 bp和3′-UTR 490 bp,编码370个氨基酸,与黄牛、水牛、绵羊、猪和人的核苷酸序列有较高的同源性,在进化过程中十分保守;牦牛PRLHR为不稳定疏水蛋白,无信号肽,存在7个跨膜结构域;有13个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点;有3个N-糖基化位点和10个O-糖基化位点;蛋白二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别为49.19%、31.89%、15.68%和3.24%;蛋白质三级结构预测显示,牦牛PRLHR蛋白具有GPCRs超级家族中PrRP家族的典型结构域。实时荧光定量PCR结果表明,PRLHR基因在牦牛输卵管组织中的表达量显著高于其他组织(P0.05);在牦牛下丘脑、脑垂体前叶、子宫和输卵管组织中的表达量极显著高于黄牛(P0.01)。试验成功克隆得到牦牛PRLHR基因序列,并对其进行了生物信息学和组织表达特性分析,为进一步研究PRLHR基因在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定了基础。     

麦洼牦牛NOBOX基因克隆与序列分析

为了解牦牛NOBOX基因的特点,根据GenBank中公布的牛NOBOX基因序列设计2对引物,分两段扩增麦洼牦牛的NOBOX基因,然后测序并拼接。序列分析表明,扩增的牦牛NOBOX基因大小为1 975bp,其中开放阅读框全长1 500bp,编码499个氨基酸,分子质量为53.12ku。核苷酸序列同源性分析表明,NOBOX基因具有相对较高的保守性,牦牛与牛的NOBOX基因核苷酸序列同源性很高,为97%。在此基础上,借助Mega 5.0软件,采用N-J算法构建了NOBOX氨基酸的系统进化树,分析了不同物种间的进化关系。牦牛NOBOX基因序列的成功克隆,为麦洼牦牛卵母细胞成熟及早期胚胎发育分子机制的研究及麦洼牦牛的遗传资源保护和育种提供了理论基础。     

水牛TLR4 cDNA全长的克隆及其生物信息学分析

本研究利用RT-PCR方法分段克隆水牛TLR4 cDNA后拼接成全长,并克隆于pMD20-T载体中,同时运用生物信息学软件对其核苷酸序列及编码蛋白质的结构进行分析和预测。结果表明,克隆的TLR4 cDNA ORF全长2526 bp,共编码841个氨基酸,N端具有由25个氨基酸组成的信号肽,该蛋白预测的分子质量为95.98 ku,等电点为6.37;水牛TLR4与GenBank中登录的水牛TLR4(DQ857349)核苷酸序列同源性达99.01%,与黄牛、绵羊、野猪、马、人和黑猩猩的同源性超过80%,与小鼠和狗的同源性次之,分别为72.17%和61.30%,与鸡的最低,仅为53.94%;该蛋白是由胞外区(1-634位氨基酸)、跨膜区(635-657位氨基酸)和胞内区(658-841位氨基酸)3部分构成的跨膜蛋白,胞外区含有12个LRR串联重复结构域、胞内区具有TIR结构域。本试验成功克隆了水牛TLR4 cDNA全长,并获得了核苷酸及其蛋白质的生物信息学分析数据,为进一步研究其功能奠定了基础。     

牦牛PRLHR基因的克隆、序列分析及组织表达研究

试验旨在对牦牛催乳素释放激素受体（prolactin releasing hormone receptor,PRLHR）基因进行克隆、序列分析及组织表达研究。采集5头母牦牛和5头母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管和子宫组织,采用RT-PCR技术扩增得到PRLHR基因cDNA全长,通过生物信息学方法分析该基因编码蛋白的生物信息学特征,利用实时荧光定量PCR技术测定PRLHR基因在牦牛及黄牛各组织中的表达量。结果显示,牦牛PRLHR基因序列长1 625 bp,其中CDS区1 113 bp、5'-UTR 22 bp和3'-UTR 490 bp,编码370个氨基酸,与黄牛、水牛、绵羊、猪和人的核苷酸序列有较高的同源性,在进化过程中十分保守;牦牛PRLHR为不稳定疏水蛋白,无信号肽,存在7个跨膜结构域;有13个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点;有3个N-糖基化位点和10个O-糖基化位点;蛋白二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别为49.19%、31.89%、15.68%和3.24%;蛋白质三级结构预测显示,牦牛PRLHR蛋白具有GPCRs超级家族中PrRP家族的典型结构域。实时荧光定量PCR结果表明,PRLHR基因在牦牛输卵管组织中的表达量显著高于其他组织（P<0.05）;在牦牛下丘脑、脑垂体前叶、子宫和输卵管组织中的表达量极显著高于黄牛（P<0.01）。试验成功克隆得到牦牛PRLHR基因序列,并对其进行了生物信息学和组织表达特性分析,为进一步研究PRLHR基因在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定了基础。     

牦牛Hepcidin 基因的克隆与序列分析

根据GenBank中公布的普通牛Hepcidin基因序列(登录号为XM-589792.3)设计1对特异性引物。采用RT-PCR技术从牦牛肝脏组织总RNA中扩增出Hepcidin基因的编码序列并进行测序分析,同时构建Hepcidin蛋白物种进化树。结果显示,经克隆获得牦牛Hepcidin基因322 bp的cDNA序列（GenBank登录号为EU863791）,含289 bp的开放阅读框,编码82个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽;预测Hepcidin蛋白分子质量和等电点分别为8.88 ku 和 9.24;与已知普通牛Hepcidin序列的同源性达 99%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律。本研究为Hepcidin基因cDNA 全长克隆及基因功能研究奠定了重要基础。     

乌苏里貉TLR8基因的分子克隆、序列分析及组织表达分析

为了解乌苏里貉TLR8基因特点及其在不同组织中的表达水平,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆其c DNA全长序列,应用生物学软件分析该基因及预测其编码蛋白的特征,并对该基因在乌苏里貉不同组织中的表达水平进行检测。结果显示该基因全长3 191 bp,ORF全长3 117 bp,编码1 038 aa,含有Toll-like受体家族典型的结构域特征。同源性分析显示乌苏里貉TLR8基因核苷酸序列与犬同源性最高,达99.3%,与其他食肉目哺乳动物也具有较高的同源性,在89.2%~92.9%。组织表达分析显示TLR8基因在乌苏里貉各组织中广泛表达但表达量存在差异。本研究结果为进一步研究乌苏里貉抗病毒免疫及育种相关研究奠定了基础。     

牦牛Toll样受体8和9基因克隆及组织表达分析

为了解牦牛Toll样受体8(TLR8)和9(TLR9)蛋白的结构特征及其基因的组织表达规律,丰富牦牛TLRs基因研究的理论数据,应用RT-PCR方法克隆牦牛TLR8、TLR9基因,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术构建组织表达谱。结果显示,两个基因cDNA全长分别为3 102bp和3 090bp。牦牛TLR8和TLR9基因与野牦牛、黄牛和绵羊之间的同源性都很高,均在95%以上。牦牛TLR8和TLR9蛋白都具有胞外LRRs功能域、胞内区TIR结构域、低复杂度区;另外,TLR8还具有1个C端富集亮氨酸重复序列(LRRCT)和跨膜结构域。两个基因在10个组织中均有不同程度的表达,在肾脏中表达量最高,而在大肠中表达量最低。本研究成功克隆了牦牛TLR8和TLR9基因的完整编码区,并揭示了它们在各组织器官的表达规律,为进一步研究TLRs在牦牛体内的免疫机制奠定了基础。     

麦洼牦牛G蛋白信号转导调节因子5克隆及蛋白结构分析

采用RT-PCR方法扩增并克隆麦洼牦牛G蛋白信号转导调节因子5(regulator of G protein signaling 5,RGS5)基因序列,利用ClustalX 1.83和Mega 5.0软件构建系统进化树,并选用多种生物信息学软件进行序列分析和蛋白结构预测.结果表明,所得麦洼牦牛RGS5基因长度为863 bp,包含1个546 bp的完整开放阅读框,编码181个氨基酸,GenBank登录号为KJ867514.系统进化树分析发现,麦洼牦牛RGS5氨基酸序列与普通牛亲缘关系最近,其次是山羊和绵羊.RGS5基因编码的蛋白质分子质量为20.94 ku,理论等电点(PI)为6.35,它是一种以α-螺旋为主,不含信号肽的非跨膜、不稳定性蛋白.三级结构预测显示,麦洼牦牛与人RGS5蛋白三级结构相似性高达90.51%.以上结果为深入研究RGS蛋白功能积累科学资料.     

牦牛性激素结合蛋白基因克隆及组织表达研究

试验旨在阐明牦牛性激素结合蛋白（SHBG）基因CDS序列及其在母牦牛生殖轴中的表达特点,为探讨该基因在牦牛繁殖中的调控作用奠定基础。试验分别采集5头健康成年母牦牛和母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、输卵管、卵巢和子宫组织,根据NCBI公布的黄牛SHBG基因设计特异性扩增引物,分别采用RT-PCR技术、生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术进行牦牛SHBG基因克隆、序列分析和组织表达检测。结果显示,牦牛SHBG核苷酸序列的编码区（CDS）全长为1 206 bp,共编码401个氨基酸,其中,亮氨酸（L）、甘氨酸（G）、脯氨酸（P）和丝氨酸（S）较多,含量分别为16.5%、9.7%、8.7%和9.0%。蛋白质分子式为C₁₉₄₄H₃₀₆₁N₅₃₅O₅₆₆S₁₀,分子质量为43.30 ku,理论等电点5.63,与黄牛核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0%和97.5%。SHBG蛋白为亲水不稳定蛋白,存在跨膜结构和信号肽;二级结构中主要包含无规则卷曲和延伸链,与三级结构分析一致。系统进化树表明牦牛与黄牛亲缘关系最近。SHBG基因在牦牛输卵管的表达量显著高于其他组织（P<0.05）,其他组织之间差异不显著（P>0.05）。SHBG基因在黄牛输卵管表达量极显著高于牦牛（P<0.01）,在黄牛卵巢表达量显著高于牦牛（P<0.05）,两物种的其他组织中表达量差异不显著（P>0.05）。本研究探讨了牦牛SHBG基因序列及其在生殖轴的表达特性,为进一步研究SHBG基因对牦牛繁殖调控作用提供了一定理论依据。     

牦牛FSHB基因的克隆及生物信息学分析

通过PCR技术以及生物信息学软件,对牦牛FSHB基因进行克隆和生物信息学分析。结果表明:牦牛FSHB基因的c DNA序列区长645 bp,编码的氨基酸129个;同源性和分子进化树分析结果显示,其CDS区碱基序列与普通牛的关系最近,然后依次是水牛、山羊、绵羊、梅花鹿、马、人和小家鼠。牦牛FSHB蛋白的分子量14683,分子式C637H978N170O193S18,等电点6.27,总原子数1996,半衰期估计30 h,不稳定指数45.8,脂肪指数61.9;该蛋白属于非跨膜蛋白,α螺旋、延伸链、β转角和无规卷曲分别为30、29、6和64个,所占的比例分别为23.26%、22.48%、4.65%和49.61%。该基因编码的氨基酸在第18位点和第19位点可能存在信号肽。该研究探明牦牛FSHB基因与其他种属的差异,为进一步研究牦牛FSHB基因结构、功能及其与繁殖功能的关系提供了理论基础。     

梅花鹿S100A16基因的克隆及生物信息学分析

为探索梅花鹿（Cervus nippon）S100A16基因序列及生物学特性，本研究根据GenBank数据库中牛、绵羊S100A16基因序列设计引物，以梅花鹿鹿茸顶端组织cDNA为模板，采用RT-PCR技术和分子克隆技术成功获得梅花鹿S100A16基因的cDNA序列。生物信息学分析发现，梅花鹿S100A16基因CDS区全长312 bp，编码103个氨基酸；蛋白含有11个磷酸化位点，有跨膜结构域，无信号肽，为在细胞内发挥作用的稳定蛋白；蛋白仅在C端含有S100蛋白家族经典的EF螺旋结构域，由12个氨基酸组成，N端EF螺旋结构域由15个氨基酸组成；蛋白C端含有FGF-1蛋白结合位点；梅花鹿S100A16蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成；三级结构显示该蛋白有2个Ca²⁺结合位点；梅花鹿S100A16蛋白氨基酸序列与东欧马鹿同源性最高，为100%，与其他部分物种S100A16蛋白氨基酸序列构建系统进化树，分析表明S100A16基因在进化上比较保守，符合功能基因的特点。研究结果为进一步揭示梅花鹿S100A16基因的功能及表达机制提供依据。     

隆林山羊肌细胞生成素基因的序列分析与结构预测

为了丰富优良地方品种隆林山羊的肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因遗传学基础信息,并探究其序列结构及其对山羊肌肉的发育分化调控机理。本研究设计1对特异性引物,采用PCR和克隆技术成功获得隆林山羊MyoG基因2419 bp长的DNA序列。结果表明,该基因包括3个外显子、2个内含子、部分5'UTR和3'UTR区,编码区DNA序列长675 bp,共编码224个氨基酸,该氨基酸序列无信号肽序列和跨膜结构。经同源性分析可知,隆林山羊MyoG编码区核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与其他物种比对结果和氨基酸系统进化树的聚类结果相符,均显示隆林山羊与哺乳动物中的绵羊、牛和野猪的亲缘关系最近,氨基酸同源性达到95%以上。因此隆林山羊MyoG基因在哺乳动物中具有较高的保守性,而MyoG基因的克隆、序列分析和结构预测将为今后该基因的表达与调控、肉质改良、山羊开发利用等研究提供了更充分的分子生物学基础信息和理论依据。     

牦牛及杂种后代犏牛的TSPY基因克隆分析

 克隆测序了牦牛、犏牛TSPY基因的编码区全序列,并用生物信息学软件分析了该基因的编码区序列、蛋白结构和进化关系。结果表明,牦牛和犏牛TSPY基因编码区序列长度均为954 bp,编码317个氨基酸,牦牛与普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95%,犏牛与牦牛、普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95%、99.79%,杂交后代犏牛与亲本序列差异表现在第113位核酸位点发生了改变（T→T→C）,导致第38位氨基酸发生变化（V→V→A）。牦牛和犏牛TSPY蛋白含有TSPY家族典型的SET/NAP保守结构域,与人、鼠TSPY蛋白结构域一致,推测牦牛和犏牛TSPY蛋白在雄性减数分裂过程中参与了精原细胞和初级精母细胞的调节。     

牦牛MT-IV基因克隆与序列分析

采用RT-PCR方法,利用特异性引物YMT-IVSP1和YMT-IVSP2先克隆出牦牛Bos grunniens MT-IV的编码区序列全长,将其与人MT-IV基因全序列比对,设计2对引物分别克隆内含子1和内含子2,将获得序列拼接后得到了牦牛MT-IV外显子与内含子全长为2 099 bp（GenBank Accession No.:EU665491）,编码区序列长189 bp,编码62个氨基酸,20个半胱氨酸残基,不含芳香族氨基酸,2个内含子的长度分别为1 392和518 bp。将牦牛MT-IV基因编码区序列和氨基酸序列BLAST搜索结果表明,MT-IV在物种间高度保守。牦牛MT-IV氨基酸序列与牛、绵羊、山羊、狗、家鼠、人和马的比对表明,MT-IV包含有金属硫蛋白（MTs）特有的C-X-C、C-C-X-C-C、C-X-X-C 结构域,构建的系统发育树与比较生理学和形态学相同,表明牦牛MT-IV具有与其他哺乳动物相同的分子特性,有必要进行牦牛MT-IV在上皮细胞中表达量水平的研究。