利用绿色荧光蛋白报告基因筛选植物乳杆菌强启动子

[目的] 结合已知植物乳杆菌启动子和绿色荧光蛋白报告基因,筛选能够进行稳定强表达的启动子,为构建植物乳杆菌高效特异表达载体提供基因元件。[方法] 分别合成已知植物乳杆菌启动子P11、Pefp、Ptuf33和Ptuf34及其下游绿色荧光蛋白报告基因,并使用上述合成序列分别替代pMG36e乳酸菌表达载体原有多克隆位点及其上游启动子部分,形成启动子筛选载体。利用电转方法将成功构建的启动子筛选载体转化至植物乳杆菌,通过检测重组子绿色荧光信号强弱对比分析启动子强弱特性。[结果] 4个启动子中转录延伸因子TU基因启动子Ptuf33和Ptuf34在受体植物乳杆菌中表达目的基因水平显著（P<0.05）高于其他启动子。[结论] 结合该研究结果及相关报道可知,启动子Ptuf33和Ptuf34在植物乳杆菌中普遍高表达,可以为后续高表达植物乳杆菌载体构建提供元件。     

一株植物乳杆菌生物学特性的研究

文章探讨了植物乳杆菌BLCC2-0001在胃肠道中的耐受性及作为益生菌的功能特性。人工模拟胃肠道环境,研究植物乳杆菌的耐受情况。同时对肠道中致病性大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌等的拮抗特性和安全性试验进行研究。作用4h,在pH2.5和pH3.5的酸性环境及人工胃液、肠液中的存活率皆在80%以上,在0.3%的胆盐环境中,存活率为60%左右。对致病菌的抑菌圈直径均在20mm以上。安全性试验结果表明,该株乳杆菌不会产生硝基还原酶、无溶血现象发生,能产生少量的D-乳酸。植物乳杆菌BLCC2-0001具有较强的耐受胃肠道环境的作用,能抑制病原菌的生长,可以作为动物微生态制剂的菌株使用。     

饲用干酪乳杆菌的生物学特性研究

针对一株干酪乳杆菌生长特性、泌酸能力、耐酸性、胆盐耐受性和抑菌能力进行研究,旨在为微生态饲料添加剂的研发提供理论依据.结果表明:干酪乳杆菌在24 h时菌体质量浓度达到最高值,在28 h时产酸量最高,pH在3.80左右维持稳定;干酪乳杆菌分别经pH 2.0和1.0％胆盐处理3h后存活率分别为81.29％、150.81％;该菌株对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均具有较好的抑菌性能,抑菌圈直径分别为17.47、18.53、16.36 mm.     

1株植物乳杆菌的生物学特性及体外抑菌活性研究

【目的】试验旨在研究植物乳杆菌GX20200417-1菌株的生物学特性及体外抑菌活性,探讨其在生产中应用的可能性。【方法】将植物乳杆菌GX20200417-1菌株接种至不同pH和含不同浓度胆盐的PBS,以及人工胃肠液中,使用菌落计数分析其对酸、胆盐和人工胃肠液的耐受性。使用牛津杯法检测GX20200417-1菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的抑菌能力;通过与霉菌毒素共培养后使用ELISA方法研究GX20200417-1菌株对霉菌毒素的降解能力,并饲喂小鼠进行安全性试验。【结果】植物乳杆菌GX20200417-1菌株能够耐受pH 2.0及0.3%胆盐,并在人工胃肠液中有至少1×10⁴ CFU/mL的活菌数;GX20200417-1菌株发酵上清液对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用,对玉米赤霉素及黄曲霉毒素均有降解作用,但对呕吐毒素无降解作用;灌服GX20200417-1菌株后小鼠安全、无毒副作用。【结论】植物乳杆菌GX20200417-1菌株具有优良的益生特性,在畜禽生产中有一定的开发潜力。     

芽孢杆菌和乳杆菌的生物学特性研究

目前有关益生素在动物体内作用的机理尚不完全清楚.一般认为,益生素应是活菌,必须活着到达动物肠道才能发挥作用,因此,它必须具有抵抗胃酸和胆碱的能力.另外,也有人报道,用死菌喂给动物也具有与益生素相同的饲养效果.针对这些问题,试验主要探讨活菌、死菌对大肠杆菌的体外抑菌作用,以及人工胃液对益生菌活性的影响和胆碱对益生菌活性的影响.     

一株干酪乳杆菌的生物学特性研究

通过对一株具有降胆固醇功能的益生茵一千酪乳杆菌生物学特性研究。发现所筛选的干酪乳杆菌BDⅡ能够耐受2．5％的牛胆盐和6．0％盐，在pH2．5R MRS-broth中仍可以生长，并有抑制常见致病茵，对部分抗生素比较敏感的特性，对小白鼠安全无毒，可以用作微生态制剂和酸奶发酵剂的优良菌种。     

酸马奶酒中乳杆菌的生物学特性及其抗菌特性的研究

试验从内蒙古锡林郭勒盟地区牧民家庭采集的10份酸马奶酒样品中共分离到18株同型发酵乳杆茵和4株异型发酵乳杆茵，并对其生物学特性和抗茵特性进行了研究。发现有5株乳杆茵的产酸能力比保加利亚乳杆茵JCMl002强。其中，10株乳杆茵的茵体悬浊液对指示茵利斯特氏茵有抑茵作用，但其余茵体悬浊液和发酵上清液均对大肠杆茵、金黄色葡萄球茵、利斯特氏茵无抑茵作用。     

一株干酪乳杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

本研究旨在分离既能用于微生态制剂又能用于青贮饲料发酵剂的优良乳酸菌,采集规模化牛场青贮饲料,取梯度稀释液涂布MRS平板,进行厌氧培养,筛选优势菌株,观察其菌落形态,并进行生化试验和特异性PCR鉴定。研究自筛乳酸菌的生长曲线、产酸曲线、培养温度及培养基初始pH对菌株生长的影响,并研究其抑菌特性、药物敏感性和安全性。试验筛选到1株菌落形态圆形、边缘整齐、表面光滑、乳白色、镜检为革兰氏阳性的无芽孢杆菌。生化结果显示,分离菌株可厌氧生长,运动性试验、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验结果均为阴性,15种糖醇发酵试验结果符合干酪乳杆菌生化特征。用干酪乳酸杆菌特异性引物对菌株进行PCR鉴定,琼脂糖凝胶电泳结果显示在727 bp处出现特异性扩增条带,与生化鉴定结果相符,将分离菌株命名为RS1。RS1在0~4 h时发酵液pH变化不明显,处于生长延迟期;4~16 h时发酵液pH下降较快,进入对数生长期;16~36 h时发酵液pH下降缓慢,进入稳定期。RS1在培养温度为20~50 ℃范围内均能生长,适宜生长温度为25~40 ℃;在培养液初始pH 1.0~9.0条件下均能生长,最适pH为6.0~8.0;对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为23 mm,对大肠杆菌的抑菌圈直径为17 mm;对恩诺沙星和头孢他啶耐药;经14 d灌服小鼠生长状况良好。上述结果表明,本试验筛选到的干酪乳杆菌RS1安全、无致病性,在微生态制剂及生物饲料添加剂领域具有潜在的开发价值。     

植物乳杆菌在畜禽生产中的应用研究进展

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）具有提高畜禽生长性能,调节肠道微生态平衡,提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种益生功能,对畜禽胃肠道环境具有较好的耐受性。因此,植物乳杆菌作为一种添加剂应用于畜禽生产中具有广泛的应用前景。文章综述植物乳杆菌的生物学特性、生理功能和对畜禽生产的影响及作用机理,为更高效地将植物乳杆菌应用于畜禽生产提供参考。     

植物乳杆菌的生理功能及其在鸡生产中的应用

植物乳杆菌作为植物源性微生态制剂,具有非侵入性、无残留性、无污染等特性,能提高畜禽的生产性能、机体免疫力和抗氧化能力。本文就植物乳杆菌的生物学特性、生理功能及在鸡生产中的应用进行综述,为植物乳杆菌的研究与应用提供参考依据。     

1株鲤鱼源植物乳杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析

【目的】筛选具有优良益生特性的鲤源乳酸菌作为水产养殖用微生态制剂候选菌株。【方法】以鲤鱼肠道内容物及黏膜为菌株的分离来源,采用MRS培养基进行菌株分离纯化,经16S rRNA测序鉴定后,对分离菌株生长特性、产酸能力、耐酸、耐胆盐、抑菌特性、药物敏感性及安全性等生物学特性进行分析。【结果】试验成功分离到1株植物乳杆菌,将其命名为YY001,该分离株在MRS培养基上菌落形态为圆形、表面光滑、边缘整齐、呈乳白色,革兰氏染色为阳性、无芽孢、两端钝圆的短小杆菌;4 h后进入对数期生长,12 h后生长达到稳定期;具有较强的产酸能力,产酸曲线显示,0~12 h pH迅速下降,培养16 h的菌液pH达3.8;在pH 3.0和0.3%胆盐的条件下具有一定耐受性;该分离株对水产常见致病菌柱状黄杆菌、维气氏单胞菌和嗜水气单胞菌均具抑菌效果,且对柱状黄杆菌的抑菌效果最显著,抑菌圈直径达34.19 mm;药物敏感性试验结果显示,分离株对卡那霉素、链霉素和万古霉素耐药;每天一次连续1周灌胃10⁸CFU分离菌株对小鼠无毒害作用。【结论】本研究分离到的菌株YY001具有优良的生物学特性,可作为水产养殖用微生态制剂候选菌株,为后续制备鲤鱼用微生态制剂奠定基础。     

2种侵入型乳酸菌生物学特性的研究

本研究旨在选择性能优良的乳酸菌表达载体,为后期研发新型乳酸菌活菌疫苗奠定基础。试验对诱导型和组成型表达的2种侵入型乳酸菌NC8-pSIP409-FnBPA和NC8-pLc23-FnBPA的生物学特性进行研究,从酸耐受性、胆盐耐受性、生长曲线、质粒稳定性、抑菌试验以及药敏试验这6个方面进行鉴定。结果表明,这2种乳酸菌在pH为2.5的酸应激条件下,存活率均达到125%,在质量分数为0.5%的高胆盐溶液中,存活率高达200%。2种类型的乳酸菌均能在9 h时达到平台期,生长性能优良,其中组成型表达菌株NC8-pLc23-FnBPA达到平台期时的D_{600 nm}值为1.3,高于诱导型表达菌株,生长性能优于诱导型菌株。pH生长曲线结果表明,乳酸菌产酸性能无明显性差异,在10 h时,溶液中的pH均降为3.5,产酸能力较强。2种类型乳酸菌的菌体和上清对常见致病菌均有不同程度的抑菌作用,其中菌体的抑菌效果优于上清,且表达FnBPA蛋白的组成型菌体的抑菌效果强于诱导表达型。2种侵入型乳酸菌均对绝大多数的抗生素敏感性高,具有一定的生物安全性。2种类型的乳酸菌的质粒稳定性均>90%。本试验发现诱导型乳酸菌NC8-pSIP409-FnBPA与组成型乳酸菌NC8-pLc23-FnBPA具有相似的生物学特性,其中组成型乳酸菌表达蛋白更方便,无需添加诱导肽便可自主表达,更适合作为新型乳酸菌活菌疫苗的受体菌株,为后期乳酸菌活菌疫苗的研制提供便利。     

猪圆环病毒2型ORF2基因重组植物乳杆菌的构建及其免疫原性分析

为研制一种能有效控制猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）的新型疫苗,本试验将PCV2的ORF2基因克隆至植物乳杆菌表达载体pSCPSP超强启动子SCP的下游,构建重组表达质粒pSCPSP-Cap,用电击转化法转化克隆至表达宿主菌植物乳杆菌,获得一株重组植物乳杆菌。以SDS-PAGE和Western blotting法检测24 h上清液中表达的蛋白;将8周龄的SPF级BALB/c小鼠随机分组,每组8只,分别设置对照组、空载体组、灌胃组、饮水组、灭活疫苗组,试验14、28、42和56 d后对小鼠采血,分离血清,利用PCV2 ELISA抗体检测试剂盒检测小鼠血清中PCV2的抗体水平。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,PCV2衣壳蛋白在植物乳杆菌中成功分泌表达,表达的蛋白分子质量为28 ku,且具有良好的反应原性,重组植物乳杆菌免疫小鼠诱导机体产生PCV2特异性抗体显著高于其他组（P<0.05）。结果表明,PCV2的ORF2基因在植物乳杆菌中成功表达,且具有良好的生物活性,可为PCV2口服疫苗的开发研究提供理论参考。     

Construction and Immunogenicity Analysis of Recombinant Lactobacillus plantarum Expressing ORF2 Gene of Porcine Circovirus Type 2

To develop an effective vaccine against porcine circovirus type 2 (PCV2), ORF2 gene was cloned into a Lactobacillus plantarum (L.plantarum) pSCPSP under the control of a SCP promoter to construct recombinant plasmid pSCPSP-Cap that was transformed into LP1 by electroporation. Extracellular expression of the Cap protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blotting analysis. Afterwards, 8-week-old SPF BALB/c mice were randomly divided into control group, carrier group, lavage group, group of drinking water and inactived vaccine group. After 14,28,42 and 56 d, mice serums were collected to evaluate the level of specific antibody by SDS-PAGE and Western blotting. Eventually, SDS-PAGE and Western blotting results indicated that the Cap protein of PCV2 could be efficiently expressed in L. plantarum, expression of protein molecular weight was 28 ku and with good immunogenicity. In addition, higher levels of specific antibody in the serum of mice was observed by oral administration with L. plantarum expressing the PCV2 Cap antigen (P<0.05). In conclusion, the ORF2 gene of PCV2 could be successfully expressed in recombinant L. plantarum and expressed protein with good biological activity, which would lay the foundation for the development of PCV2 oral vaccination.     

乳酸菌噬菌体的分离及生物学特性鉴定

为了解乳酸菌噬菌体的生物学特性,并为制定乳酸菌发酵生产过程中噬菌体污染的防控措施提供试验数据和参考,本研究通过斑点试验和双层琼脂平板法,以干酪乳杆菌（L. casei） ATCC 393、戊糖乳杆菌（L. pentosus） KLDS 1.0413、短小乳杆菌（L. brevis） ATCC 367为指示菌从乳制品、泡菜样品中分离乳酸菌噬菌体,通过透射电镜观察噬菌体形态,噬菌体基因组限制性内切酶作用分析其包装机制,并进行宿主范围和一步生长曲线的测定,SDS-PAGE分析噬菌体结构蛋白,对获得的噬菌体进行生物学特性鉴定。结果显示,分离获得3株烈性乳酸菌噬菌体,依次命名为Lc、Lpen和Lbre。电镜结果显示,噬菌体Lc、Lpen均由多面体头部和非收缩性尾部组成,而噬菌体Lbre由多面体头部和收缩性尾部组成。根据形态学分析,Lc和Lpen属于长尾噬菌体科（Siphoviridae）,B1类,Lbre属于肌尾噬菌体科（Myoviridae）,A1类。噬菌体基因组经限制性内切酶作用后,核酸电泳结果显示,噬菌体Lc、Lpen基因组均为异质平末端,其包装机制属满头包装,即pac-型,而Lbre含有黏性末端,其包装机制属于cos-型。宿主范围测定结果显示,噬菌体Lc、Lbre对宿主专一,而Lpen宿主谱较广。一步生长曲线显示,噬菌体Lc、Lpen和Lbre潜伏期分别为60、45和150 min,裂解期分别为45、90和105 min,裂解量分别为47、24和30 PFU/cell。SDS-PAGE分析显示,噬菌体Lc结构蛋白有7个,主要结构蛋白分子质量约为50 ku;噬菌体Lpen和Lbre结构蛋白均有5个,主要结构蛋白分子质量分别约为55和50 ku。综上,本研究分离获得3株乳酸菌烈性噬菌体,并对其主要生物学特性进行鉴定,对了解乳酸菌噬菌体及后续乳酸菌噬菌体污染的防治提供了试验数据和理论依据。     

植物乳杆菌和布氏乳杆菌对甘蔗尾青贮品质的影响

试验旨在研究植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum,LAP）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri,LAB）对甘蔗尾青贮品质及有氧稳定性的影响。以新鲜甘蔗尾为原料于聚乙烯薄膜袋中真空青贮,共设3个组,每组3个重复,每个重复取新鲜甘蔗尾500 g,避光室温青贮发酵。试验组Ⅰ在甘蔗尾中添加20 mL LAP菌剂（6.00×10¹⁰ CFU/mL）及30 mL生理盐水;试验组Ⅱ添加20 mL LAB菌剂（8.80×10⁹ CFU/mL）及30 mL生理盐水;对照组只添加50 mL的生理盐水。45 d后测定各组青贮常规营养成分含量、pH、挥发性脂肪酸含量和有氧稳定性。结果表明,与对照组相比,添加LAP的试验组Ⅰ或添加LAB的试验组Ⅱ甘蔗尾青贮pH显著降低（P<0.05）;试验组Ⅰ乳酸含量和试验组Ⅱ乙酸含量显著升高（P<0.05）。对照组丁酸含量较高,而在两个试验组中均未检测到丁酸（P<0.05）。与对照组相比,试验组Ⅰ氨态氮含量显著降低（P<0.05）,粗蛋白质（CP）含量也有一定程度升高（P=0.071）;两个试验组中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量均显著降低（P<0.05）,且试验组Ⅰ、Ⅱ的有氧稳定性分别提高了34.29%和42.86%（P<0.05）。综合以上结果,添加LAP 或LAB 均能有效提高甘蔗尾青贮的品质和有氧稳定性,其中LAP对提高甘蔗尾青贮品质和有氧稳定性效果更优。     

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)8-6产细菌素发酵条件的优化

对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)8-6产细菌素的发酵条件进行了优化,分别研究了培养时间、温度、接种量、培养基起始pH值、培养基碳源、氮源等因素对细菌素产生的影响,通过单因素水平试验和正交试验,确定产细菌素的最佳培养基组合和最佳发酵条件为葡萄糖3%,胰蛋白胨2%,蛋白胨1%,酵母膏1%,硫酸镁0.058%,吐温-80 0.2%,30℃培养24h,培养基起始pH值为6.5,接种量2%。乳杆菌8-6优化后效价为1825.56IU/mL,比优化前提高了373.15%。