水产动物源嗜水气单胞菌药物敏感性及QRDR基因突变分析

为了解临床分离的59株嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物的耐药性及其靶基因gyrA和parC编码的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)的突变情况。采用纸片琼脂扩散法测定15种抗菌药物对水产动物源嗜水气单胞菌的耐药情况,采用PCR法扩增gyrA和parC,并通过测序分析其靶基因突变情况。结果表明:24株(40.7%)嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药,其中对萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星的耐药率依次为40.7%、16.9%、20.3%、8.5%。敏感菌株QRDR靶位点未发生突变,24株喹诺酮类耐药菌株中gyrA基因编码的第83位氨基酸均存在Ser→Ile突变;19株菌parC基因编码的第87位氨基酸也发生突变,其中18株为Ser→Ile突变,1株为Ser→Arg突变,有5株未检测到突变;ParC亚基氨基酸突变的菌株其GyrA亚基均同时发生氨基酸突变。表明临床分离的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药程度不一,其中萘啶酸的耐药最为严重,诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星敏感性较高。喹诺酮类耐药菌株GyrA亚基QRDR氨基酸突变,可能是引起萘啶酸耐药的主要原因。临床分离嗜水气单胞菌QRDR区域的突变具有随机性,但靶位点GyrA的Ser83→Ile以及ParC的Ser87→Ile是最主要的突变方式,另外喹诺酮类药物耐药性的产生可能还与其他耐药机制存在关联。     

鸡源大肠杆菌四环素耐药基因检测

用肉汤稀释法测定32株鸡源大肠杆菌对四环素等8种抗菌药物的敏感性,用PCR方法检测5种四环素耐药基因(tet基因),并用ERIC-PCR方法分析试验菌株间的克隆关系。结果显示:32株大肠杆菌对四环素、多西环素的耐药率分别为84%、75%,tetA和tetB阳性率分别为78%和25%。总tet基因阳性率为90.6%,与对四环素、多西环素的耐药率基本一致。携带1种或2种tet基因的临床分离菌,不仅对四环素类药物耐药,还对头孢噻肟、环丙沙星、新霉素和氟苯尼考耐药,呈现多重耐药的特点。试验菌共分为A^O 15个ERIC型,tetA和tetB几乎均匀分布于不同ERIC型菌株中,表明其在试验菌株间水平扩散。     

鸡源大肠杆菌四环素耐药基因检测

用肉汤稀释法测定32株鸡源大肠杆菌对四环素等8种抗菌药物的敏感性,用PCR方法检测5种四环素耐药基因(tet基因),并用ERIC-PCR方法分析试验菌株间的克隆关系。结果显示:32株大肠杆菌对四环素、多西环素的耐药率分别为84%、75%,tetA和tetB阳性率分别为78%和25%。总tet基因阳性率为90.6%,与对四环素、多西环素的耐药率基本一致。携带1种或2种tet基因的临床分离菌,不仅对四环素类药物耐药,还对头孢噻肟、环丙沙星、新霉素和氟苯尼考耐药,呈现多重耐药的特点。试验菌共分为A~O 15个ERIC型,tetA和tetB几乎均匀分布于不同ERIC型菌株中,表明其在试验菌株间水平扩散。     

三株鸡源大肠杆菌iss基因的检测

采用鸡胚致死对HL11、HL32、SD27鸡源大肠杆菌(Escherichia coli)的致病性进行测定,并检测其血清抗性及iss基因序列。结果表明,3株大肠杆菌为致病性、血清补体敏感菌株,iss基因序列与已知禽大肠杆菌iss基因序列同源性为99.0%~99.7%。     

鸡源CTX-M基因型ESBL大肠杆菌耐药基因的转移性检测分析

为探讨超广谱β-内酰胺酶鸡源性大肠杆菌blaCTX-M基因的可转移性,提醒畜禽养殖滥用抗生素的危害。该研究选取11株blaCTX-M基因型ESBL鸡大肠杆菌分离株（不携带其他基因型）与受体菌（利福平抗性的DH5α）接合转导,对双抗板（终浓度利福平200μg/mL和头孢唑林50μg/mL的胰蛋白酶大豆琼脂培养基）上筛选的接合转导子进行ESBL确认以及PCR检测耐药基因验证。结果表明,得到的11株阳性接合子均呈现ESBL表型;扩增结果显示,11株转移接合子的bla基因型均为CTX-M型,转移率为100%,用TEM和SHV引物扩增结果均为阴性。可见,blaCTX-M基因借助接合性质粒实现耐药基因的水平转移,通过菌株接合方式实现耐药基因的迁移扩散。     

养殖场分离的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌基因突变研究

【目的】探讨从养殖场动物、环境和饲养员分离的大肠杆菌的gyrA 和parC 基因突变特征。【方法】用琼脂稀释法测定环丙沙星和恩诺沙星对菌株的最小抑菌浓度。PCR扩增gyrA 和parC 基因的喹诺酮耐药决定区，扩增的片段长度分别为525 bp和487 bp，PCR产物直接测序。【结果】在63株突变株中，在GyrA 亚基发生的氨基酸替代有Ser83→Leu（62株）和Asp87→Asn（52株）、Asp87→Tyr（2株）、Asp87→His（2株）；ParC 亚基的氨基酸替代有Ser80→Ile（47株）、Ser80→Arg（2株）和Glu84→Val（3株）、Glu84→Lys（4株）、Glu84→Gly（5株）、Glu84→Ala（1株）。环丙沙星对菌株的MIC小于0.125μg·ml-1时，GyrA和ParC亚基均没有任何变异；环丙沙星的MIC为0.125～0.25 μg·ml-1时，GyrA亚基出现单一氨基酸替代；环丙沙星的MIC为0.5～32μg·ml-1时，出现GyrA 83位和87位双替代或者GyrA83和ParC80位双替代；环丙沙星的MIC为4～128μg·ml-1，发生GyrA 双替代和ParC单替代；环丙沙星的MIC在16～128μg·ml-1，发生GyrA双替代和ParC 双替代。【结论】不同来源的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌GyrA和ParC具有多种氨基酸替代类型，而且GyrA和ParC突变位点的数量与菌株对氟喹诺酮类耐药水平呈正相关。     

鸡源性沙门氏菌氟喹诺酮类耐药株与拓扑异构酶IV关系研究

采用常规PCR法,以雏鸡沙门氏菌NCTC5776作为质控菌株,取临床分离的对5种氟喹诺酮类药物(环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、单诺沙星和沙拉沙星)均耐药的9株鸡源性沙门氏菌耐药株,提取其染色体DNA.设计引物parCF和parCR、parEF和parER,分别扩增菌株拓扑异构酶IVparC基因和parE基因的氟喹诺酮类...     

鸡源致病性大肠杆菌对四环素类抗生素耐药性及耐药基因检测

为更好地了解鸡源致病性大肠杆菌对四环素类抗生素的耐药性及耐药基因分布,从陕西省部分规模化养鸡场的病、死鸡中经分离鉴定得到158株致病性大肠杆菌。采用K-B药敏纸片法检测致病性大肠杆菌分离株对4种四环素类药物的药敏性,PCR方法检测3种四环素类耐药基因,用DNAStar软件对获得的耐药基因序列与GenBank中的相关序列进行比对。结果显示,鸡源致病性E.coli分离株对四环素、金霉素、土霉素以及多西环素的耐药率分别为88.6%、77.2%、87.3%、50.6%,3重以上耐药菌株占78.5%。四环素类耐药基因tetA、tetB的检出率分别为81.4%、20.7%,未检测到tetC基因。结果表明,鸡源致病性E.coli对四环素类抗生素普遍具有耐药性,且以多重耐药为主;耐药基因tetA的检出率与其耐药性呈正相关。     

鸡源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的分子检测

对豫北地区临床分离的102株鸡源大肠杆菌进行生化鉴定、MICS值测定及氟苯尼考耐药基因floR的检测.最敏感的是头孢喹肟,敏感率为93.1%;其次为阿米卡星和氟苯尼考,敏感率分别为59.8%和54.9%;而对复方新诺明的耐药率达到100%;此外,对四环素,多西环素,氨苄西林,恩诺沙星和沙拉沙星的耐药率为78.4%~94.1%.氟苯尼考耐药基因的分子检测显示,有45.1%的菌株显示floR基因阳性.对其中4株大肠杆菌的氟苯尼考耐药基因floR进行了克隆和测序.结果表明,克隆的floR基因所推导的氨基酸序列与其它12-跨膜外输泵家族在共同的基序上是保守的,在克隆的floR序列与报道的floR序列间仅存在1~3个氨基酸替代.     

多重PCR检测猪源大肠杆菌毒素基因

根据猪源大肠杆菌产生的4种主要毒素(STa、STb、LT、SLT-2e)基因序列，设计4对聚合酶链式反应(PCR)引物，建立多重PCR方法。该方法能快速地检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌(ETEC)和产志贺样毒素大肠杆菌(SLTEC)菌株，准确地了解所检测菌株产生肠毒素和志贺样毒素的情况。对215株猪源病原性大肠杆菌进行检测，其中STa为52．56％，STb为26．51％，STa STb为8．84％，STa STb SLT-2e为6．51％。这表明多重PCR可为猪源大肠杆菌毒素基因的检测提供一种更加快速、经济、易行的技术。     

动物源大肠杆菌PMQR基因流行性检测

【目的】检测分离自广东省散养型养殖场的动物源大肠杆菌中oqxAB基因及其它质粒介导喹诺酮类耐药基因(PMQR)的流行情况。【方法】采用PCR方法检测oqxA、oqxB、qnr、qepA和aac（6′）-Ib-cr基因;琼脂平板稀释法对PMQR阳性菌株进行18种抗菌药物的最小抑菌浓度测定。【结果】qnrB 、qnrS、aac（6′）-Ib-cr、oqxA、oqxB的检出率依次为10.49%、18.88%、31.47%、44.8%和48.9%,但未检测到qnrA、qnrC、qnrD和qepA。oqxA与oqxB的检出率较高,且oqxA与oqxB常常同时存在。多数菌株同时携带两个或两个以上的PMQR基因。PMQR阳性菌对18种兽医临床常用抗生素耐药率较高。【结论】PMQR基因在广东省兽医临床传播广泛,广东省大肠杆菌对临床常用抗菌药物耐药较为严重,药敏谱呈多样化,多重耐药株比例较高。     

blaCTX-M型鸡大肠杆菌中mcr-1的分子流行病学分析

检测了不同时期从河南省分离的162株blaCTX-M型鸡大肠杆菌对黏菌素的耐药性,进行了耐药基因blaCTX-M和mcr-1的质粒接合试验,并比较了各亚型的水平传播规律.结果表明:随着时间的推移,blaCTX-M型鸡大肠杆菌对黏菌素的耐药率由0％显著增加到42.2％;在头孢噻肟单药筛选下获得的21株接合子有5株同时携带...     

东北地区鸡源多重耐药大肠杆菌整合子的检测

[目的]了解东北地区鸡源大肠杆菌耐药性的流行特征以及整合子-基因盒系统的耐药机制。[方法]在检测耐药性的基础上,采用PCR方法对整合酶和整合子进行检测和克隆测序,并且对检测结果和耐药基因盒与GenBank数据库的序列进行比对和分析。[结果]413株分离菌中整合子检出率为71.91%,整合酶Ⅰ和整合酶Ⅱ的检出率分别为65.52%和54.48%,整合酶Ⅲ未检出。序列分析得出,共包含6种整合子,各自携带不同组合的基因盒。[结论]Ⅰ型整合子在细菌耐药性的传播过程中发挥着至关重要的作用。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的原核表达

[目的]为VP1蛋白的免疫学研究和鸡贫血病毒基因工程疫苗的研制奠定基础。[方法]将1个新克隆的鸡贫血病毒vpl基因（AF448446）在大肠杆菌DE3中进行表达,并对该蛋白进行纯化。[结果]结果表明：已成功构建了表达载体pET30（b^＋）-vp1;VP1蛋白已成功诱导表达并得以纯化;获得的VP1蛋白序列与已发表的VPl蛋白序列存在差异。[结论]试验克隆的vp1基因大小为1347bp,编码449个氨基酸的蛋白。     

bla_(CTX-M)型鸡大肠杆菌中mcr-1的分子流行病学分析

检测了不同时期从河南省分离的162株bla_(CTX-M)型鸡大肠杆菌对黏菌素的耐药性,进行了耐药基因bla_(CTX-M)和mcr-1的质粒接合试验,并比较了各亚型的水平传播规律。结果表明:随着时间的推移,bla_(CTX-M)型鸡大肠杆菌对黏菌素的耐药率由0%显著增加到42.2%;在头孢噻肟单药筛选下获得的21株接合子有5株同时携带mcr-1,在黏菌素单药筛选下获得的18株接合子有11株同时携带bla_(CTX-M),且bla_(CTX-M)和mcr-1基因的接合频率无明显差异;原菌及对应接合子的bla_(CTX-M)亚型均属于bla_(CTX-M-1)和bla_(CTX-M-9)亚群,部分原菌同时携带两种亚型,但接合子均仅携带一种亚型(bla_(CTX-M-9)亚群)。说明在单一药物(黏菌素或头孢噻肟)的选择性压力下,bla_(CTX-M)和mcr-1基因均易水平传播,且携带bla_(CTX-M)和mcr-1的质粒既可单独转移也可同时转移。     

山西省鸡源大肠杆菌耐药性的监测

从山西省发生大肠杆菌病的鸡场采集了雏鸡病料,进行大肠杆菌的分离、鉴定和耐药性试验。结果表明,在分离出的37株大肠杆菌中,采用纸片法分别用14种抗菌药物进行了敏感性检测,发现除了丁胺卡那霉素对所有菌株敏感外,其他药物均呈不同程度耐药性,磷霉素耐药率最高,其次为磺胺二甲基嘧啶,对喹诺酮类药物有交叉耐药现象;采用试管稀释法对6种抗菌药物进行敏感性试验,发现同种药物对不同菌株的最小抑菌浓度有较大的差别,其中差别最大是恩诺沙星。     

利用质粒指纹图谱法对大肠杆菌耐药质粒遗传特性的研究

为研究鸡源大肠杆菌耐药性及耐药的生物学特性，选用30株来自不同地区的鸡源大肠杆菌，在药敏试验的基础上，对耐药菌质粒进行了指纹图谱分析。结果表明：30株鸡源大肠杆菌对氨苄青霉素、青霉素、四环素的耐药率为100.00%，对氯霉素、庆大霉素、利福平、红霉素的耐药率为60.00%-93.33%，多重耐药率为26.67%-80.00%，质粒图谱比较发现：来源相同的菌株质粒图谱相同或相似；来源不同的菌株质粒图谱一般不同。聚类分析表明：30株大肠杆菌遗传距离在0.224-0.416处聚成五类，其中同一地区聚为一类。这表明同一地区的大肠杆菌病的病原之间有一定的同源性。其次，这30株大肠杆菌在遗传距离为0.864处聚成一大类，说明它们之间有一定程度的遗传相关性。     

罗曼鸡白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

应用RT-PCR技术从罗曼鸡脾淋巴细胞RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序。结果表明,获得了ChIL-18全序列,其大小为597 bp。将其成熟蛋白基因(510 bp)亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。SDS-PAGE可检测到分子质量为约46 kDa的融合蛋白,Western blot证实该融合蛋白可与鼠抗鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。用MTT法测定表明,重组蛋白能明显促进鸡T细胞转化的活性。     

鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的表达

构建鸡γ-干扰素基因(lFN-γ)的融合表达质粒,并在原核系统表达。根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,使用prim er5设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆出鸡γ-干扰素基因并对其进行测序。测序结果表明,鸡γ-干扰素基因全长495bp,具有一个完整的开放阅读框,编码164个氨基酸,与国外发表的序列同源性为100%。将序列连接到原核表达载体pET28 a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明鸡γ-干扰素表达蛋白大小为20.8KD,并以包涵体形式表达。为鸡γ-干扰素生物制剂或疫苗佐剂的开发奠定基础。     

福寿螺纤维素酶基因的原核表达

[目的]研究福寿螺纤维素酶基因的原核表达。[方法]福寿螺（Ampullaria gigas）的纤维素酶基因CelAg编码含395个氨基酸的多功能纤维素酶。利用RT—PCR方法技术,从福寿螺中克隆纤维素酶基因CelAg,并构建于表达载体pET-30a（＋）上,再转化至大肠杆菌B121（DF3）,获得重组菌Ecoli BDCelAg,进行发酵并分析纤维素酶的活性。[结果]可表达出有活性的纤维素酶,酶活可达8．31U／ml。[结论]为纤维素酶基因今后的大规模生产研究奠定基础,并对纤维素的生物转化与利用的进一步研究和解决当前世界能源危机、粮食短缺和环境污染等问题具有重要的意义。